低氧脅迫和復(fù)氧對(duì)長吻鮠鰓組織低氧應(yīng)答基因和生理生化指標(biāo)的影響

李 謠，楊智茹，程景顥，李 杰，王 濤，張 凱，張國松，尹紹武

（1南京師范大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院/江蘇省特色水產(chǎn)育種與綠色高效養(yǎng)殖技術(shù)工程研究中心，南京 210023；2菏澤學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物工程學(xué)院/山東省高校生理生化及應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東菏澤 274015）

0 引言

在自然環(huán)境中，溶解氧(DO)是水生生物生存不可缺少的條件[1]。由于水溫、晝夜變化等原因，水生態(tài)系統(tǒng)中DO濃度不斷變化，導(dǎo)致魚類常常暴露于低氧環(huán)境中。魚類已進(jìn)化出多種適應(yīng)策略應(yīng)對(duì)低氧環(huán)境，但是當(dāng)DO長時(shí)間處于較低水平或者嚴(yán)重低氧時(shí)，仍會(huì)對(duì)其生長產(chǎn)生不利影響，甚至導(dǎo)致死亡，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重?fù)p失[2]。鰓組織是魚類主要的呼吸器官，具有氣體交換、排泄廢物和滲透壓調(diào)節(jié)等重要功能[3-4]，研究長吻鮠鰓組織在低氧脅迫和復(fù)氧下低氧應(yīng)答基因和生理生化指標(biāo)的變化，可以為低氧應(yīng)激的分子機(jī)制研究提供基礎(chǔ)資料，并為其健康養(yǎng)殖提供參考。目前，研究人員針對(duì)低氧環(huán)境給魚類鰓組織帶來的影響已展開部分研究，如低氧脅迫可引起鯽魚(Carassius auratus)[5]、花斑溪鳉(Rivulusmarmoratus)[6]和團(tuán)頭魴(Megalobrama amblycephala)[7]分化遷移鰓小片間細(xì)胞團(tuán)或提高平均突出片層高度和平均片層面來增加魚體的呼吸表面積。在分子水平上，魚類鰓組織中氧傳感蛋白（包含HIFs、PHDs、Vhl等）作為低溶解氧反應(yīng)的核心調(diào)節(jié)因子，在低氧環(huán)境中被不同程度的激活[8]，如大彈 涂 魚 (Boleophthalmus pectinirostris)[9]、多 鱗 鱚(Sillago sihama)[10]和斑點(diǎn)叉尾鮰(Ictalurus punctatus)[11]等。同時(shí)氧傳感蛋白主導(dǎo)的HIF signaling pathway通過激活一系列相關(guān)基因致使鰓組織代謝模式由有氧呼吸向無氧呼吸轉(zhuǎn)變[12]，如翹嘴鱖(Siniperca chuatsi)在急性低氧下糖酵解酶活力顯著增加，此現(xiàn)象也同樣出現(xiàn)在草魚(Ctenopharyngodon idella)和卵形鯧鲹(Trachinotus ovatus)中[13-14]。常氧下魚體內(nèi)線粒體會(huì)產(chǎn)生少量的活性氧(ROS)來滿足正常的生理活動(dòng)[15]，而低氧脅迫下鯽魚[16]、鰱(Hypophthalmichthys molitrix)[17]和花鱸幼魚(Lateolabrax japonicus)[18]鰓組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)和抗氧化酶活性顯著上調(diào)。這些氧化應(yīng)激狀態(tài)可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡產(chǎn)生，如Jun等[19]研究發(fā)現(xiàn)低氧脅迫能顯著提高大口黑鱸(Micropterus salmoides)鰓組織促凋亡基因的表達(dá)水平，另外也有報(bào)道稱鰓組織的細(xì)胞凋亡是發(fā)生在鰓絲間，目的是為了在低氧下增加鰓組織的呼吸表面積[20]。

長吻鮠(L.longirostris)隸屬于鲇形目(Siluriformes)、鲿科(Bagridae)、鮠屬(Leiocassis)，是一種主要生活在長江、淮河、珠江等水域的底層經(jīng)濟(jì)魚類，具有營養(yǎng)豐富、肉質(zhì)細(xì)膩、生長速度較快等特點(diǎn)[21]，深受廣大消費(fèi)者喜愛。由于陰雨、高溫、高密度放養(yǎng)等原因?qū)е吗B(yǎng)殖水體內(nèi)的DO含量減少，致使長吻鮠經(jīng)常產(chǎn)生浮頭，甚至窒息或死亡。因此，研究該魚低氧脅迫的分子調(diào)控機(jī)制顯得尤為重要。目前國內(nèi)外關(guān)于該魚的研究主要集中在其繁養(yǎng)殖技術(shù)[22]、產(chǎn)品加工[23]等方面，針對(duì)其鰓組織低氧應(yīng)答基因和生理生化指標(biāo)的研究尚未見報(bào)道。本研究以長吻鮠為對(duì)象，研究低氧脅迫和復(fù)氧對(duì)其鰓組織氧傳感蛋白、呼吸代謝、氧化應(yīng)激、組織形態(tài)和細(xì)胞凋亡的影響，系統(tǒng)地探討該魚低氧應(yīng)答基因和生理生化指標(biāo)的變化，初步揭示該魚鰓組織應(yīng)對(duì)低氧脅迫的分子調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用長吻鮠采自江蘇省南京市水產(chǎn)科學(xué)研究所祿口基地，選取500尾體格健壯、規(guī)格均勻的長吻鮠，體長(12±1.1)cm，體重(30±2.3)g消毒處理后，隨機(jī)轉(zhuǎn)移到10個(gè)具有生物過濾器的水循環(huán)養(yǎng)殖玻璃缸(1.2 m×0.85 m×0.55 m)中馴養(yǎng)14天，每缸50尾。試驗(yàn)水溫為(27±1)℃，DO濃度為(7.3±0.5)mg/L，水的流速為5 L/min，每天投喂人工配合飼料2次，時(shí)間為9時(shí)和17時(shí)。試驗(yàn)前禁食24 h。試驗(yàn)于2021年3—10月在江蘇省南京市水產(chǎn)科學(xué)研究所祿口基地進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與樣本采集

試驗(yàn)設(shè)置2個(gè)處理組：低氧脅迫(0.8±0.1)mg/L和復(fù)氧(7.3±0.5)mg/L，每組3個(gè)重復(fù)。在低氧處理前，分別從常氧狀態(tài)[DO濃度為(7.3±0.5)mg/L]的3個(gè)水循環(huán)養(yǎng)殖玻璃缸中各取4尾長吻鮠鰓組織作為對(duì)照組（標(biāo)記為C），共12尾，其中同1個(gè)水循環(huán)養(yǎng)殖玻璃缸中3尾魚的鰓組織混為1個(gè)樣本，液氮處理后-80℃保存，用于檢測(cè)基因表達(dá)量和生理生化指標(biāo)；另外3尾魚鰓組織（第二鰓弓）保存于加有多聚甲醛的離心管中，用于切片檢測(cè)。隨后，關(guān)閉水循環(huán)養(yǎng)殖玻璃缸的充氣設(shè)備直接將純氮?dú)獬淙胨w30 min左右，使水中DO濃度降至(0.8±0.1)mg/L后，調(diào)節(jié)氮?dú)獾臎_入量使DO濃度穩(wěn)定在(0.8±0.1)mg/L，分別在0、2、4、6 h（記為H0、H2、H4、H6）進(jìn)行取材，每個(gè)水循環(huán)養(yǎng)殖玻璃缸取4尾。低氧脅迫試驗(yàn)結(jié)束后停止充入氮?dú)獠⒊淙肟諝猓蠨O濃度恢復(fù)至(7.3±0.5)mg/L時(shí)，調(diào)節(jié)空氣沖入量維持水中DO含量，分別在2、4、6 h（記為R2、R4、R6）進(jìn)行取材，每個(gè)水循環(huán)養(yǎng)殖玻璃缸取4尾。整個(gè)試驗(yàn)期間每5 min使用溶氧測(cè)定儀（LDO101，上海鑫嵩公司）檢測(cè)一次水體中DO濃度。

1.3 鰓組織實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)

每個(gè)時(shí)段各取3個(gè)樣提取總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Vazyme，南京）得到cDNA。在已有的轉(zhuǎn)錄組序列中獲取基因CDs序列，使用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)基因qRT-PCR上下游引物（見表1），其中β-actin為內(nèi)參基因。qRT-PCR（Light Cycler?96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，Roche）反應(yīng)體系為正、反向引物各0.45μL，Mix10μL，ddH2O 7.1 μL，模板cDNA2 μL，總體積為20 μL。反應(yīng)條件為95℃ 5 min，1個(gè)循環(huán)；95℃ 10 s，60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。使用2-ΔΔCt公式計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物列表

續(xù)表1

1.4 鰓組織酶活性檢測(cè)

在冰浴條件下準(zhǔn)確稱取鰓組織0.1 g，迅速剪碎，按1:9比例加入0.9%的生理鹽水，機(jī)械勻漿之后經(jīng)低溫離心機(jī)3000 r/min離心10 min，取上清液分裝保存于-20℃冰箱備測(cè)。鰓組織勻漿上清液中的蛋白濃度(TP)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活力、過氧化氫酶(CAT)活力、超氧化物歧化酶(SOD)活力、果糖磷酸激酶(PFK)活力、己糖激酶(HK)活力、丙酮酸激酶(PK)活力、乳酸脫氫酶(LDH)活力、琥珀酸脫氫酶(SDH)活力、蘋果酸脫氫酶(MDH)活力、丙二醛(MDA)和脂質(zhì)過氧化物(LPO)含量均使用南京建成生物工程研究所所售的試劑盒測(cè)定。

1.5 鰓組織蘇木精-伊紅(H&E)染色切片

將固定于4%多聚甲醛中的鰓組織，經(jīng)石蠟切片脫蠟至水→蘇木素染色→伊紅染色→脫水封片后使用顯微鏡觀察并拍照，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)分別呈藍(lán)色和紅色。

1.6 鰓組織TUNEL切片檢測(cè)

將保存在4%多聚甲醛溶液中的鰓組織進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋并切片，操作步驟如下：石蠟切片，脫蠟水化，PBS漂洗，通透，PBS漂洗，室溫平衡，DAB顯色，PBS漂洗，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，PBS漂洗，脫水中性樹膠封片和顯微鏡觀察。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)照組和低氧組表達(dá)模式的數(shù)據(jù)采用雙尾t-test檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)差異，當(dāng)P-value＜0.05時(shí)認(rèn)為差異顯著（標(biāo)為*），P-value＜0.01時(shí)認(rèn)為差異顯著（標(biāo)為**），P值均為試驗(yàn)組與對(duì)照組相比得出，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 低氧脅迫和復(fù)氧對(duì)長吻鮠鰓組織氧傳感蛋白的影響

如圖1所示，低氧脅迫下長吻鮠鰓組織中HIF-1α、HIF-2α、PHD1和PHD3基因的表達(dá)量在H4到達(dá)頂峰，復(fù)氧后逐漸下降，R6較對(duì)照組仍有顯著差異(P＜0.05)。PHD2和Vhl基因的表達(dá)量在H2時(shí)達(dá)到峰值，復(fù)氧6 h后仍顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。

圖1 低氧脅迫和復(fù)氧下長吻鮠的鰓組織氧傳感蛋白基因的表達(dá)模式

2.2 低氧脅迫和復(fù)氧對(duì)長吻鮠鰓組織呼吸代謝相關(guān)酶活性的影響

在低氧脅迫下長吻鮠鰓組織中PFK和HK活性顯著升高，在R2時(shí)達(dá)到峰值，隨后逐漸降低，R4時(shí)活性較對(duì)照組無顯著差異(P＞0.05)。PK和LDH活性分別在H6和H2時(shí)到達(dá)峰值，復(fù)氧后逐漸恢復(fù)至對(duì)照組水平。SDH和MDH活性分別在H6和H4時(shí)顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，復(fù)氧6 h后與對(duì)照組已無顯著性差異(P＞0.05)（圖2）。

圖2 低氧脅迫與復(fù)氧對(duì)長吻鮠鰓組織PFK、HK、PK、LDH、SDH、MDH活性的影響

2.3 低氧脅迫和復(fù)氧對(duì)長吻鮠鰓組織氧化應(yīng)激酶活性與參數(shù)的影響

如圖3所示，長吻鮠在低氧脅迫下GSH-Px和LPO活性在H4和H6時(shí)達(dá)到頂峰，隨后逐漸下降，R6較對(duì)照組已無顯著性差異(P＞0.05)。CAT活性在低氧脅迫下不斷上升，在H2時(shí)到達(dá)頂峰，恢復(fù)溶氧后呈下降趨勢(shì)，R6較對(duì)照組仍有顯著性差異(P＜0.05)。SOD和MDA活性分別在H6和H4時(shí)達(dá)到峰值，隨著溶氧的恢復(fù)其活性逐漸下降，R2時(shí)已恢復(fù)至對(duì)照水平。

圖3 低氧脅迫與復(fù)氧對(duì)長吻鮠鰓組織GSH-Px、SOD、CAT、MDA和LPO活性的影響

2.4 低氧脅迫和復(fù)氧對(duì)長吻鮠鰓組織結(jié)構(gòu)的影響

如圖4所示，在常氧狀態(tài)下長吻鮠鰓絲兩側(cè)鰓小片排列整齊，形狀良好，線粒體豐富細(xì)胞聚集在鰓小片基部，血細(xì)胞排列有序，低氧脅迫后鰓組織上皮出現(xiàn)了抬升，隨著低氧時(shí)間的延長部分血細(xì)胞大量聚集使鰓小片頂端呈棒狀，并發(fā)生線粒體豐富細(xì)胞腫脹和增生等病變現(xiàn)象，在溶氧恢復(fù)后，低氧引起的鰓組織變化并未得到改善。

圖4 低氧脅迫和復(fù)氧下長吻鮠鰓組織形態(tài)

2.5 低氧脅迫和復(fù)氧對(duì)長吻鮠鰓組織細(xì)胞凋亡的影響

2.5.1 鰓組織TUNEL結(jié)果分析 低氧脅迫下，長吻鮠鰓組織細(xì)胞凋亡程度不斷增加，復(fù)氧6 h后細(xì)胞凋亡現(xiàn)象仍然存在，對(duì)凋亡指數(shù)統(tǒng)計(jì)分析顯示，低氧可促進(jìn)鰓組織發(fā)生凋亡，各處理組之間的凋亡指數(shù)隨著低氧時(shí)間的延長逐漸增加，在H6時(shí)到達(dá)頂峰，復(fù)氧后不斷下降，R6細(xì)胞凋亡指數(shù)較對(duì)照組仍有顯著差異(P＜0.05)（圖5）。

圖5 鰓組織TUNEL切片檢測(cè)和凋亡指數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.5.2 凋亡基因的時(shí)序表達(dá)分析 在低氧脅迫下，長吻鮠鰓組織中Bax和Apaf-1基因的表達(dá)量在H0時(shí)顯著上升，復(fù)氧后逐漸回落，R6較對(duì)照組仍有顯著性差異(P＜0.05)。Caspase 3和p53基因的表達(dá)量在低氧脅迫下顯著升高，在H2時(shí)達(dá)到峰值，復(fù)氧6 h后逐漸恢復(fù)至對(duì)照組水平。Bcl-2基因的表達(dá)量在H6時(shí)顯著低于對(duì)照組(P＜0.01)，復(fù)氧后表達(dá)量逐漸上升，R6與對(duì)照組相比仍有顯著差異(P＜0.05)（圖6）。

圖6 低氧脅迫和復(fù)氧下長吻鮠鰓組織凋亡相關(guān)基因的表達(dá)模式

3 討論

3.1 低氧脅迫和復(fù)氧對(duì)長吻鮠鰓組織氧傳感蛋白和呼吸代謝的影響

在自然水體中，魚類為了減輕DO濃度劇烈變化所造成的損害，演化出了許多復(fù)雜的低氧反應(yīng)機(jī)制[8]，如HIFs、PHDs和Vhl等氧傳感蛋白的低氧誘導(dǎo)研究被廣泛報(bào)道，麥穗魚(Pseudorasbora parva)在低氧脅迫處理6 h時(shí)鰓中HIF-1α基因表達(dá)量到達(dá)峰值[24]，大彈涂魚在低氧處理后鰓組織中HIF-1α基因表達(dá)量顯著高于對(duì)照組[9]，多鱗鱚在低氧處理后鰓組織中PHDs、Vhl的表達(dá)量顯著高于常氧組[25]，同樣低氧脅迫能顯著誘導(dǎo)鯽魚[26]、斑點(diǎn)叉尾鮰[11]和半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)[27]鰓組織氧傳感蛋白相關(guān)基因的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，隨低氧脅迫時(shí)間的延長，長吻鮠鰓組織中氧傳感蛋白相關(guān)基因HIF-1α、HIF-2α、PHDs和Vhl的表達(dá)量整體呈逐漸上升趨勢(shì)，復(fù)氧后其表達(dá)量逐漸下降但仍有較高的表達(dá)量，其中，PHD1、PHD2、PHD3和Vhl基因的高表達(dá)可能充當(dāng)終止低氧反應(yīng)的反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，防止長吻鮠鰓組織一直處于低氧效應(yīng)期[28]；以上結(jié)果表明長吻鮠與上述魚類氧傳感蛋白的功能類似，氧傳感蛋白在進(jìn)化過程中具有一定的保守性。值得注意的是，復(fù)氧后HIF-1α、HIF-2α、PHDs和Vhl仍有較高的表達(dá)量，類似現(xiàn)象也出現(xiàn)在瓦氏黃顙魚(Pelteobagrus vachelli)腦組織中[12]，這可能是由于鰓組織是魚體重要呼吸器官，在復(fù)氧過程中部分氧傳感蛋白基因需要通過持續(xù)高表達(dá)來緩沖低氧造成的影響，使機(jī)體快速恢復(fù)到穩(wěn)定狀態(tài)。

在低氧脅迫下細(xì)胞可通過改變代謝途徑、代謝方式來減輕低氧產(chǎn)生的不利影響[29]。有研究表明，SDH和MDH參與三羧酸循環(huán)是該循環(huán)的關(guān)鍵酶，PFK、HK和PK是糖酵解過程中的限速酶，LDH是無氧呼吸的指示劑。錢辰穎等[30]研究發(fā)現(xiàn)，團(tuán)頭魴鰓組織在低氧脅迫下LDH活性顯著升高，SDH活性顯著降低。張國松等[12]研究發(fā)現(xiàn)，瓦氏黃顙魚大腦和肝臟中糖酵解相關(guān)酶（PFK、HK和PK）活性和LDH活性隨低氧脅迫時(shí)間延長逐漸增加。在本研究中，長吻鮠在低氧脅迫下鰓組織糖酵解關(guān)鍵酶（PFK、HK和PK）、LDH的活性與對(duì)照組相比顯著升高，TCA循環(huán)的關(guān)鍵酶SDH和MDH活性顯著降低，復(fù)氧后呈上升趨勢(shì)，表明低氧脅迫可以抑制長吻鮠鰓組織三羧酸循環(huán)途徑，而增強(qiáng)了無氧呼吸相關(guān)酶活性，如提高糖酵解活動(dòng)，以及LDH活性催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸，從而增加無氧呼吸；原因可能是在低氧脅迫下長吻鮠體內(nèi)ATP產(chǎn)生減少，魚體需要通過增強(qiáng)無氧呼吸來彌補(bǔ)有氧呼吸活動(dòng)抑制導(dǎo)致的能量缺失[31]。

3.2 低氧脅迫和復(fù)氧對(duì)長吻鮠鰓組織氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡和組織結(jié)構(gòu)的影響

生物體內(nèi)ROS增加與消除速率處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，在多種形式脅迫下體內(nèi)ROS不斷積累從而造成機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激損傷[32]，而生物體可通過激活機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)來減輕ROS增加造成的損傷。賈秀琪等[33]研究發(fā)現(xiàn)，河川沙塘鱧(Odontobutis potamophilus)在急性低氧5 h時(shí)，鰓組織中CAT、GSH-Px活性和SOD含量顯著升高。Huang等[34]研究發(fā)現(xiàn)，在低氧脅迫下金曼龍(Trichogaster microlepis)鰓組織中CAT、GSH-Px和SOD的活性均增加。本研究發(fā)現(xiàn)低氧脅迫能顯著提高長吻鮠鰓組織MDA和LPO的含量和GSH-Px、CAT和SOD活性。然而，CAT活性在復(fù)氧6 h后較對(duì)照組仍有顯著差異，說明在低氧條件下長吻鮠鰓組織可通過提高抗氧化防御系統(tǒng)（CAT、GSH-Px和SOD）來減少氧化應(yīng)激對(duì)鰓組織的傷害，而在復(fù)氧過程中隨著環(huán)境中氧氣大量導(dǎo)入，導(dǎo)致機(jī)體代謝補(bǔ)償增強(qiáng)，有氧呼吸增強(qiáng)引起ROS濃度上升，從而再次出現(xiàn)氧化應(yīng)激現(xiàn)象；此結(jié)果也印證了M.Hermes-Lima等[35]所提出的關(guān)于“氧化應(yīng)激準(zhǔn)備（在低氧條件下動(dòng)物能夠通過提高自身的抗氧化潛力，從而為解決再氧化后體內(nèi)的氧化應(yīng)激做好準(zhǔn)備）”的猜想。

有研究顯示，在動(dòng)物組織低氧或缺血過程中，細(xì)胞出現(xiàn)代謝紊亂、細(xì)胞周期阻滯等，同時(shí)線粒體功能受損生成過量ROS，引起細(xì)胞凋亡[36]。丁晨雨等[37]研究發(fā)現(xiàn)，低氧脅迫致使鰱心肌細(xì)胞發(fā)生了凋亡，并隨著低氧濃度下降凋亡指數(shù)逐漸升高。本研究采用TUNEL檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，低氧脅迫會(huì)造成長吻鮠鰓組織細(xì)胞凋亡加劇，對(duì)凋亡細(xì)胞統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，其數(shù)量隨著低氧時(shí)間的延長逐漸增加，在復(fù)氧6 h時(shí)仍有較多的凋亡細(xì)胞數(shù)量，說明低氧脅迫能顯著造成長吻鮠鰓組織細(xì)胞發(fā)生凋亡，但凋亡加劇的起始溶解氧濃度還有待進(jìn)一步研究。Bcl-2和Bax基因在魚類細(xì)胞凋亡過程中起著關(guān)鍵作用，二者間的比率關(guān)系是決定細(xì)胞存亡的關(guān)鍵[38]。Yuan等[39]研究發(fā)現(xiàn)，斑點(diǎn)叉尾鮰在低氧處理后其組織中Bcl-2基因的表達(dá)受到抑制。本研究結(jié)果顯示長吻鮠鰓組織中Bcl-2的表達(dá)量在低氧脅迫下顯著降低，而Bax的表達(dá)量顯著升高，在復(fù)氧過程中Bcl-2、Bax的表達(dá)量較對(duì)照組仍有顯著差異，這可能是由于Bax/Bax同源二聚體的數(shù)量在低氧脅迫和復(fù)氧下明顯增加，鰓組織細(xì)胞對(duì)凋亡信號(hào)的反應(yīng)性持續(xù)增強(qiáng)，從而促進(jìn)了細(xì)胞凋亡。此外，裴雪瑩等[40]研究發(fā)現(xiàn)，雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號(hào)”在低氧條件下，細(xì)胞凋亡相關(guān)基因(Apaf-1、Caspase 3、Caspase 9和p53)的表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組。本研究發(fā)現(xiàn)Caspase 3、p53和Apaf-1基因表達(dá)量在低氧脅迫下顯著升高，說明長吻鮠鰓組織細(xì)胞凋亡反應(yīng)在低氧脅迫下進(jìn)一步加劇。值得注意的是，復(fù)氧6 h后Apaf-1基因的表達(dá)量仍顯著高于對(duì)照組，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是復(fù)氧過程中重新輸入的氧氣使魚體再次產(chǎn)生了氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而產(chǎn)生了細(xì)胞凋亡程序。

魚類鰓組織肩負(fù)著呼吸、排泄、調(diào)節(jié)滲透壓、維持酸堿平衡的功能，相比其他器官更容易受到低氧的影響，從而危及魚體的正常生長[41]。有研究發(fā)現(xiàn)低氧脅迫會(huì)使魚類鰓組織發(fā)生上皮抬升、增生、線粒體豐富細(xì)胞腫脹、鰓小片棒狀化等結(jié)構(gòu)變化[42]。陳世喜等[43]研究發(fā)現(xiàn)，急性低氧脅迫致會(huì)使卵形鯧鲹(Trachinotus ovatus)鰓小片上皮出現(xiàn)腫脹和抬升；隨低氧脅迫時(shí)間的延長，會(huì)出現(xiàn)鰓小片上皮細(xì)胞分離現(xiàn)象，從而增加鰓呼吸表面積。本研究中通過H&E染色切片觀察發(fā)現(xiàn)，在低氧脅迫下長吻鮠鰓組織上皮出現(xiàn)了抬升，隨著低氧時(shí)間的延長部分血細(xì)胞大量聚集使鰓小片頂端呈棒狀，并發(fā)生線粒體豐富細(xì)胞腫脹和增生等現(xiàn)象，在溶氧恢復(fù)后，低氧引起的鰓組織的變化并未得到改善，表明低氧脅迫顯著影響了長吻鮠鰓組織的正常組織形態(tài)。

4 結(jié)論

本研究對(duì)低氧脅迫和復(fù)氧下長吻鮠鰓組織低氧應(yīng)答基因和生理生化指標(biāo)進(jìn)行了系統(tǒng)分析，發(fā)現(xiàn)長吻鮠在低氧脅迫和復(fù)氧下可以通過迅速啟動(dòng)氧傳感通路，上調(diào)PHDs和Vhl基因的表達(dá)量來終止低氧反應(yīng)的反饋調(diào)節(jié)；通過提高無氧呼吸活動(dòng)來補(bǔ)償氧氣供應(yīng)不足所導(dǎo)致的ATP緊缺。隨著低氧時(shí)間的延長，鰓組織上皮抬升、鰓小片頂端棒狀、線粒體豐富細(xì)胞腫脹和增生等現(xiàn)象加劇，同時(shí)產(chǎn)生了氧化應(yīng)激損傷與細(xì)胞凋亡，機(jī)體通過激活抗氧化防御系統(tǒng)來維持體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，本研究結(jié)果為闡明低氧脅迫和復(fù)氧下魚類鰓組織低氧應(yīng)答與生理生化機(jī)制提供了參考資料。