不同濃度PMSG和HCG組合對家兔超數(shù)排卵的影響

周 娜，鐵雅楠，楊雅楠，王欣榮

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070）

0 引言

哺乳動物在發(fā)育前期，卵巢上的卵母細胞被單層扁平前體顆粒細胞包圍后形成了原始卵泡，出生后其原始卵泡總和高達上百萬個[1]；但隨著動物生長發(fā)育，只有不到1%的原始卵泡發(fā)育為成熟卵泡并釋放卵子，其余99%的原始卵泡將退化、凋亡，這種現(xiàn)象被稱為卵泡閉鎖[2]。卵泡閉鎖是一種為了維持卵泡內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、控制排卵周期內(nèi)排卵數(shù)目以及選擇優(yōu)質(zhì)卵子等功能的正常生理現(xiàn)象[3-4]。隨著胚胎生物工程技術(shù)的發(fā)展，研究者可以通過超數(shù)排卵獲得更多的可用卵子或胚胎[5]。超數(shù)排卵是指選擇哺乳動物適當(dāng)?shù)纳黼A段，使用各種外源性促性腺激素刺激卵巢，使之比正常情況下有更多的卵泡同時發(fā)育，并能夠排出具有受精能力卵子的技術(shù)，簡稱“超排”[6]。除激素的種類、濃度影響超排效果外，試驗動物的體況、年齡、品種、氣候、季節(jié)及飼養(yǎng)條件也影響著超排效果[7-8]。本試驗旨在研究不同濃度孕馬血清促性腺激素(Pregnant Mare Serum Gonadotropin,PMSG)和人絨毛膜促性腺激素(Human Chorionic Gonadotrophin,HCG)的組合對家兔超排效果的影響，以篩選出試驗范圍內(nèi)的最佳激素組合濃度，為家兔及其他哺乳動物通過超排獲得更多優(yōu)質(zhì)可用胚胎、提高繁殖力、養(yǎng)殖生產(chǎn)效率等提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

2020年6—8月在甘肅靖遠某肉兔養(yǎng)殖場挑選若干品種純正、體格健壯的5月齡性成熟母兔，將其飼養(yǎng)在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物場，以消毒清潔的飼養(yǎng)舍單籠飼養(yǎng)，自然光照、自由飲水，使用優(yōu)質(zhì)苜蓿顆粒飼料每天定時定量飼喂，約7天后進行藥物處理和試驗。

1.2 試驗藥械

PMSG和HCG（寧波第二激素廠，獸藥GMP證字11004號，1000 IU）、生理鹽水、沖胚液、M199培養(yǎng)基、M23沖洗液、1 mL注射器、5 mL注射器、頭皮針、5 mL離心管、培養(yǎng)皿、顯微鏡、超凈臺、10～100μL移液槍、細胞培養(yǎng)箱等。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗分組 從試驗動物中隨機挑選24只，每組6只，分別設(shè)計為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ共4組。其中Ⅰ組為對照組，不做任何激素處理，試驗開始后72 h合籠交配，交配后14～16 h處死動物并采集卵巢、輸卵管和子宮，從子宮角和輸卵管中沖洗出胚胎并對其進行鑒定和培養(yǎng)。其余3組為試驗組Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ，在試驗開始第1天分別頸部皮下注射50、70 IU和90 IU的PMSG，繼續(xù)飼喂72 h后再分別耳緣靜脈注射100 IU的HCG，注射后與公兔合籠使其完成交配，并在合籠14～16 h后處死動物進行沖胚、鑒定及培養(yǎng)。

1.3.2 合籠要求 合籠前通過外陰觀察法對母兔進行發(fā)情鑒定，確定母兔發(fā)情后與公兔1:1合籠，發(fā)現(xiàn)交配成功后分離公母兔單籠飼養(yǎng)，若出現(xiàn)互相撕咬或母兔尾巴濕潤的情況復(fù)配一次，確保交配成功。

1.3.3 樣本采集 用耳緣靜脈注射空氣法處死試驗動物并解剖，完整分離出輸卵管、子宮。將卵巢與輸卵管分離后觀察并測量卵巢的排卵點、充血卵泡等物理數(shù)據(jù)。沖胚操作時，手持連有子宮角的輸卵管，將培養(yǎng)皿懸空接在輸卵管傘部，再用已吸取5 mL沖卵液的注射器刺入子宮角與輸卵管連接處，并將止血鉗固定在針頭后方，緩慢推動注射器，使沖卵液從輸卵管傘部滴入培養(yǎng)皿，從而沖出胚胎。具體操作時要注意動作輕柔緩慢，避免沖卵液滴在培養(yǎng)皿邊緣及外面，可能會導(dǎo)致胚胎的遺失。

1.3.4 胚胎鑒定 將胚胎放在倒置顯微鏡下進行觀察和鑒定，根據(jù)胚胎整體形態(tài)、卵裂情況和碎片化程度進行鑒定。將所得胚胎分成4個等級：A級胚胎卵裂球大小均勻整齊，結(jié)構(gòu)緊湊，整體形態(tài)完整輪廓清晰，呈球形；B級胚胎與A級相比卵裂球大小、形狀、密度存在一定的不規(guī)則性，整體輪廓清晰，色調(diào)透明度適中，可見少量液泡；C級胚胎卵裂球大小、密度不均，結(jié)構(gòu)松散凌亂，整體輪廓不清晰，色調(diào)發(fā)暗，游離液泡或細胞較多；D級碎片化嚴(yán)重、模糊不清、胚胎發(fā)暗、破碎甚至死亡[9-10]。A、B和C級胚胎統(tǒng)稱為可用胚胎，其中A、B級胚胎可用于鮮胚移植或冷凍，C級胚胎只可用于鮮胚移植，而D級為不可用胚胎[11]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用SPSS 23.0軟件處理所得數(shù)據(jù)，各組數(shù)據(jù)進行單因素方差分析及多重比較。其中P＜0.01表明組間差異極顯著，P＜0.05表明組間差異顯著，P＞0.05表明組間差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度PMSG超排處理對家兔輸卵管物理形態(tài)的影響

由表1可見，使用不同濃度的PMSG，家兔輸卵管形態(tài)表現(xiàn)出一定的變化。當(dāng)PMSG注射劑量為90 IU時，輸卵管長度是123.24 mm，輸卵管峽部的寬度是2.11 mm，宮管結(jié)合部的寬度是2.53 mm；而當(dāng)注射劑量為50 IU時，輸卵管傘部的寬度是2.88 mm。但無論是與對照組相比，還是不同處理間比較，各組數(shù)值均未表現(xiàn)出顯著差異(P＞0.05)。

表1 不同濃度PMSG/HCG對輸卵管物理形態(tài)的影響 mm

2.2 不同濃度PMSG對家兔超數(shù)排卵效果的影響

由表2可知，隨著PMSG處理濃度的增加，家兔卵巢上的只均充血卵泡數(shù)呈現(xiàn)出增多的趨勢，且差異極顯著(P＜0.01)。與對照組相比，注射50、70 IU和90 IU PMSG后的卵巢充血卵泡數(shù)分別增加了27.03%、91.46%、181.10%。隨著PMSG濃度的增加，家兔只均排卵點和沖出胚胎數(shù)呈現(xiàn)出先增多后又降低的趨勢，且組間差異極顯著(P＜0.01)。特別當(dāng)注射70 IU的PMSG時，只均排卵點和沖出胚胎數(shù)最多，分別達到29.00個和21.83枚，且極顯著高于對照組(P＜0.01)。與對照組相比，Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ組的只均排卵點增多率分別為66.67%、329.63%、234.52%，只均胚胎數(shù)增多率分別為62.86%、322.24%、230.37%。

表2 不同濃度PMSG/HCG處理后對家兔超數(shù)排卵效果的影響

2.3 不同濃度PMSG處理對胚胎質(zhì)量的影響

由圖1A可知，與對照組相比，試驗組的胚胎回收率有所降低，且隨激素濃度的增大回收率上升，但差異不顯著(P＞0.05)。由圖1B可知，各組獲得的總可用胚分別為58、83、213、126枚，隨激素濃度的增大，總可用胚呈先增大后降低的趨勢，且差異極顯著(P＜0.01)，特別是III組獲得了最多的總可用胚，總計213枚。由圖1C可知，各組胚胎畸形率分別為6.45%、17.82%、18.70%和38.54%，隨PMSG注射濃度的增大，呈上升趨勢且差異極顯著(P＜0.01)，與對照組相比，畸形率分別增加了11.37%、12.25%、32.09%。

圖1 不同濃度PMSG對家兔胚胎的影響

3 討論

研究認為，多種生殖激素如PMSG、HCG、促卵泡素 (Follicle-stimulating Hormone,FSH)、 孕 酮(Progesterone，P4、雌二醇(Estradiol，E2)、促黃體激素(Luteinizing Hormone,LH)、前 列腺素(prostaglandin,PG)等均可以用于動物超排，但各激素之間通過相互協(xié)同和制約共同發(fā)揮生理學(xué)效應(yīng)[12]，因此用于家畜超排時，多以激素組合的形式進行，常見的組合有PMSG+HCG的組合及FSH+HCG的組合[13]。HCG是胎盤膜組織中合體滋養(yǎng)層細胞分泌的糖蛋白，生物學(xué)活性主要為LH，F(xiàn)SH的活性很小[14]。FSH主要是促進卵泡的生長和發(fā)育，而PMSG是由孕馬的子宮內(nèi)膜杯分泌的一種糖蛋白激素，同時具有FSH和LH的生物學(xué)功能[15]。PMSG價格便宜容易獲取，但半衰期較長，代謝困難，過量使用會增加母畜患卵巢疾病的風(fēng)險，不足則起不到相應(yīng)的作用，所以在使用時要控制最佳劑量[16]。本試驗使用相同劑量的HCG和不同濃度的PMSG作為超排激素組合，以研究家兔輸卵管的變化狀況，并從整體超排效果和胚胎質(zhì)量方面來篩選各組合中的效果最佳者。

3.1 不同濃度PMSG對家兔輸卵管物理形態(tài)的影響

譚景和等[17]的研究發(fā)現(xiàn)，超排處理對輸卵管傘部大小無明顯影響。而關(guān)于生殖激素對母畜輸卵管長度和寬度影響的研究卻鮮有報道，本研究中試驗動物均為體重、體況相當(dāng)?shù)耐慢g健康伊拉肉兔。試驗結(jié)果表明，與對照組的輸卵管長度、寬度相比較，各試驗組并沒有顯著差異性變化，該結(jié)果也與樊寶仁等[18]的研究結(jié)果吻合。說明在本試驗設(shè)計的激素濃度范圍內(nèi)，PMSG濃度的變化對輸卵管長度和寬度沒有顯著影響。

3.2 不同濃度PMSG對家兔超排效果和胚胎質(zhì)量的影響

超數(shù)排卵作為提高母畜繁殖力和獲得胚胎的重要途徑之一，受多重因素的影響，如超排方法、超排激素、光照、飼養(yǎng)條件、供體母畜所處發(fā)情階段等[19-20]。雖然超排可以獲得更多的胚胎，但通過外源激素的刺激獲得的胚胎質(zhì)量需要進行科學(xué)的評估。在本試驗中發(fā)現(xiàn)，隨著激素濃度的增大，胚胎的畸形率也逐步上升。特別在90 IU的PMSG處理時不僅排卵點降低，而且胚胎的畸形率增大，導(dǎo)致總可用胚數(shù)少。因此從胚胎質(zhì)量的角度分析，當(dāng)使用PMSG+HCG組合對家兔進行超數(shù)排卵，HCG的劑量為100 IU時，PMSG也不宜超過70 IU。超排所得的卵子是母畜卵巢上的卵母細胞受外源性激素和母畜原有激素共同協(xié)同調(diào)節(jié)下形成的，因此卵子質(zhì)量也與超排所用的外源性激素有關(guān)，所以超排后胚胎質(zhì)量下降很有可能是受超排激素的影響。有研究表明，超數(shù)排卵可以刺激大量的卵泡發(fā)育，使之在發(fā)育過程中對營養(yǎng)、空間的競爭致使黃體質(zhì)量下降，從而影響所得胚胎回收率及質(zhì)量[21]。王改蘭[22]在用FSH對羊進行超排試驗時發(fā)現(xiàn)，隨FSH濃度的增大，胚胎畸形率逐步上升。但在林峰等[23]用PMSG對家兔進行超排的試驗中，發(fā)現(xiàn)激素濃度對胚胎發(fā)育無影響，但其使用的PMSG和HCG分別為50 IUPMSG和PMSG+HCG為50+50的組合，因此分析可能是激素濃度還未達到導(dǎo)致其胚胎出現(xiàn)畸形的閾值所致。

4 結(jié)論

研究表明，用HCG定量為100 IU、PMSG為50～90 IU濃度范圍的超排方案處理家兔時，對其輸卵管的長和寬無顯著作用；PMSG+HCG組合可以有效促進家兔超排，特別是70 IU PMSG+100 IU HCG的組合可取得較好的超排效果；當(dāng)PMSG濃度為90 IU時，會誘導(dǎo)胚胎畸形率增高，影響胚胎質(zhì)量，故建議在生產(chǎn)中謹慎使用。