轉(zhuǎn)EPSPS基因抗除草劑水稻恢復系的培育及育種評價

肖本澤，王資霖

（華中農(nóng)業(yè)大學植物科學技術(shù)學院，武漢 430070）

0 引言

隨著城市化進程的快速發(fā)展，傳統(tǒng)的精耕細作式水稻生產(chǎn)模式將不復存在，水稻生產(chǎn)面臨著勞動力短缺和生產(chǎn)力降低的問題。因此，直播、拋秧、機插等輕簡化栽培模式已成為水稻生產(chǎn)中的主流[1-2]。但隨著這些輕簡型栽培模式的不斷擴大，草害的問題也越來越嚴重。據(jù)統(tǒng)計，由于稻田雜草的侵害，水稻產(chǎn)量損失可達40%以上[3]。面對這一水稻生產(chǎn)上的棘手問題，通過培育抗除草劑水稻是解決這一問題的理想途徑[4-5]。劉文強等[4]對轉(zhuǎn)基因早稻香125S/Bar68-1的在直播、拋秧、機插3種栽培方式中噴施低毒、低殘留除草劑Basta（活性成分為草銨膦）的效果進行了研究，發(fā)現(xiàn)通過噴施除草劑能徹底地控制各種雜草，進而保證了早稻香125S/Bar68-1較高的產(chǎn)量水平。另一方面，利用抗除草劑恢復系也可較好地解決雜交水稻制種中雜種純度問題，降低雜交種成本[6-7]。黃大年等[6]通過基因槍法將Bar基因轉(zhuǎn)入京引119、春江03、秀水11中，然后將這些轉(zhuǎn)穩(wěn)定株系與兩系不育系培矮64S、三系不育系珍汕97A配制雜交種，通過苗期噴施0.25%除草劑Basta，在一周內(nèi)秧田中稗草等主要雜草枯萎死亡，為雜交稻正常生長創(chuàng)造了沒有雜草競爭的空間，同時保證100%高純度雜交稻移種大田。肖國櫻等[8]對轉(zhuǎn)Bar基因抗除草劑兩系法雜交早稻香125S/Bar68-1和香125S/Bar68-2在苗期噴施0.3%Basta，可以有效地將雜交稻純度提升至99.98%，保證了雜交稻各項經(jīng)濟性狀穩(wěn)定、生長整齊。

這些年來，研究人員在培育抗除草劑、綜合農(nóng)藝性狀優(yōu)良的水稻育種材料方面也取得了較好的進展。段發(fā)平等[9]通過雜交將Bar基因轉(zhuǎn)移到恢復系測64、明恢63和特青中培育出抗除草劑同型恢復系，這些同型恢復系的大部分生理性狀和主要農(nóng)藝性狀與原恢復系接近；將同型恢復系與不育系雜交，選配出多個抗除草劑兩系雜交組合，抗除草劑組合能保持或略高于原組合的產(chǎn)量水平。王才林等[10]利用回交轉(zhuǎn)育將Bar基因?qū)牖謴拖怠癊32”中，獲得了對除草劑Basta具有穩(wěn)定抗性的水稻新品系“E32HR”和雜交種“培矮64S/E32HR”，它們的絕大部分農(nóng)藝性狀均與原始的恢復系“E32”、雜交組合“培矮64S/E32”無明顯差異。以往研究中，對抗除草劑恢復系或雜交種的農(nóng)藝性狀評價主要集中在與原始非轉(zhuǎn)基因恢復系或雜交種的比較，而通過大田比產(chǎn)篩選出優(yōu)勢強于區(qū)試對照（其是品種審定的參照，一般是當?shù)氐闹魍破贩N；目前長江中下游水稻試驗以豐兩優(yōu)四號作為對照品種）的抗除草劑新材料的報道較少。本研究對本課題組選育的3份綜合農(nóng)藝性狀優(yōu)良的抗除草劑株系與生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用的5份不育系進行測配，通過對其重要農(nóng)藝性狀配合力進行分析，為培育抗除草劑強優(yōu)勢雜交水稻提供重要依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本試驗以秈稻轉(zhuǎn)化系明恢63-EPSP[11-12]為供體將抗除草劑基因EPSPS基因[13]導入恢復系華84中，經(jīng)多代系譜選育得到了3份對除草劑草甘膦抗性完全、遺傳穩(wěn)定、農(nóng)藝性狀優(yōu)良的株系（華84EP-1、華84EP-2和華84EP-3），然后將上述抗除草劑株系及原始恢復系華84與生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用的5份不育系（紅香2A、Y58S、廣占63-4S、華1015S、天源6S）按照不完全雙列雜交在海南春季進行測配，獲得了20份雜交組合；另外選用國家區(qū)試對照品種豐兩優(yōu)四號作為本試驗的對照品種。以上親本材料及對照的來源和系譜見表1。

表1 供試親本材料和對照品種的系譜來源

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 田間試驗 試驗在華中農(nóng)業(yè)大學水稻實驗基地進行，供試材料（包括20份雜交組合、4份恢復系材料、1份對照豐兩優(yōu)四號）5月上旬播種，秧齡達30天進行移栽（對于抗除草劑恢復系及其雜交組合，選擇噴施農(nóng)達后存活下來的健壯植株進行移栽；對于常規(guī)恢復系華84及其所配的雜交組合、以及對照豐兩優(yōu)四號選取未噴除草劑的植株進行移栽）。田間試驗參照國家水稻區(qū)域試驗方案按隨機區(qū)組排列，2次重復，每小區(qū)種植5行，每行10株，單苗種植，株行距16.7 cm×26.7 cm，按一般生產(chǎn)大田進行管理。

1.2.2 除草劑抗性鑒定 待供試材料秧齡15天時對抗除草劑株系華84EP-1、華84EP-2和華84EP-3及其雜交組合開始進行除草劑農(nóng)達（孟山都公司，有效成分為草甘膦異丙胺鹽，母液濃度為41%，稀釋150倍使用）噴施，一星期后調(diào)查秧苗存活率，作為除草劑抗性的評價指標。

1.3 數(shù)據(jù)處理

供試材料各農(nóng)藝性狀的配合力分析參照相關(guān)文獻的固定模型方法進行[14]，其中結(jié)實率百分數(shù)資料均經(jīng)過平方根反正弦轉(zhuǎn)換[15]。實驗數(shù)據(jù)的分析采用SPSS軟件進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試材料除草劑抗性表型

苗期除草劑抗性鑒定表明，恢復系華84EP-1、華84EP-2和華84EP-3的秧苗存活率均在96%以上，表明這3個衍生恢復系對除草劑農(nóng)達抗性接近完全；由這3個恢復系與5份不育系（紅香2A、Y58S、廣占63-4S、華1015S、天源6S）配制的15份雜交組合的秧苗存活率介于44.9%～52.6%之間（表2），表明這些雜交組合的純度較差。這與當時雜交種的制種環(huán)境有很大關(guān)系：這些雜交組合是在海南的3—4月進行，溫度較低，此時兩系不育系（尤其是溫敏不育系）表現(xiàn)為部分可育，從而降低了雜交種純度。因此，利用抗除草劑恢復系培育兩系雜交種，通過苗期噴施除草劑可以大大地提高兩系雜交種子的純度，進而提高雜交水稻產(chǎn)量[6-8]。本試驗中的常規(guī)恢復系華84及其雜交組合、對照豐兩優(yōu)四號的秧苗在噴施農(nóng)達后全部死亡，顯然，這些不攜帶抗除草劑基因EPSPS的材料對除草劑農(nóng)達均無抗性。

表2 抗除草劑恢復系及其雜交組合對農(nóng)達抗性表型

2.2 供試材料主要農(nóng)藝性狀的方差和相關(guān)性分析

為了評估抗除草劑恢復系華84EP-1、華84EP-2和華84EP-3的育種潛力，通過不完全雙列雜交對這3個恢復系及原始華84與生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用的5份不育系（紅香2A、Y58S、廣占63-4S、華1015S、天源6S）配組得到的20個雜交組合，按隨機區(qū)組設(shè)計田間試驗并對供試材料的10個主要農(nóng)藝性狀（單株產(chǎn)量、結(jié)實率、千粒重、生育期、株高、有效穗數(shù)、著力密度、穗總粒數(shù)、穗實粒數(shù)、穗長）進行了考察。方差分析結(jié)果表明：除生育期區(qū)組間方差達到極顯著差異外，其余9個性狀在區(qū)組間均未達到顯著差異（表3）。雜交組合間方差在單株產(chǎn)量、有效穗數(shù)、穗實粒數(shù)中的差異不顯著，在其他7個農(nóng)藝性狀中均達顯著或極顯著差異水平。

對雜交組合中存在顯著差異的7個農(nóng)藝性狀（結(jié)實率、千粒重、生育期、株高、著力密度、穗總粒數(shù)、穗長）的變異效應(yīng)按照父本一般配合力效應(yīng)、母本一般配合力效應(yīng)以及雙親特殊配合力效應(yīng)進行分解。其中父本一般配合力效應(yīng)在結(jié)實率、生育期、株高、著力密度、穗總粒數(shù)等5個性狀上達到了顯著或極顯著差異，母本不育系在結(jié)實率、千粒重、生育期、株高、著力密度、穗總粒數(shù)、穗長等7個性狀上的一般配合力效應(yīng)存在顯著或極顯著差異，雙親特殊配合力效應(yīng)則僅在生育期性狀上達到了顯著或極顯著差異（表3）。因此，雜交組合間結(jié)實率、株高、著力密度、穗總粒數(shù)變異主要來源于雙親的一般配合力效應(yīng)，雜交組合間千粒重、穗長變異主要來源于母本一般配合力效應(yīng)，而雜交組合間生育期變異則同時來源于雙親的一般配合力和特殊配合力效應(yīng)（表3）。

表3 供試材料10個重要農(nóng)藝性狀的方差分析

通過對雜交組合所考察的10個農(nóng)藝性狀進行相關(guān)性分析（表4），結(jié)果表明單株產(chǎn)量與結(jié)實率、有效穗數(shù)、穗實粒數(shù)之間，結(jié)實率與千粒重、穗實粒數(shù)之間，生育期與株高、穗實粒數(shù)、穗長之間，株高與穗實粒數(shù)、穗長之間，著粒密度與穗總粒數(shù)、穗實粒數(shù)之間，穗總粒數(shù)與穗實粒數(shù)之間均存在顯著正相關(guān)性；而結(jié)實率與著力密度、穗總粒數(shù)之間，千粒重與有效穗數(shù)、著力密度、穗總粒數(shù)之間，著力密度與穗長之間均存在顯著負相關(guān)性。因此，培育具有高產(chǎn)潛力的水稻品種可以通過提高結(jié)實率增加每穗實粒數(shù)、促進分蘗有效結(jié)實等途徑進行改良，但通過延長生育期或增加株高達到增加生物學產(chǎn)量似乎對水稻籽粒產(chǎn)量貢獻并不大。

表4 農(nóng)藝性狀間相關(guān)性分析

2.3 恢復系一般配合力效應(yīng)分析

雜交組合的表現(xiàn)是由雙親的一般配合力效應(yīng)和雙親間的特殊配合力效應(yīng)共同決定，首先對4份父本恢復系（華84、華84EP-1、華84EP-2、華84EP-3）主要農(nóng)藝性狀的一般配合力效應(yīng)進行了分析（表5）。其中抗除草劑衍生恢復系華84EP-1在單株產(chǎn)量、生育期、穗實粒數(shù)、穗長性狀上具有最高的一般配合力效應(yīng)，表明恢復系華84EP-1在培育高產(chǎn)、長穗型、抗除草劑雜交組合上具有較好的應(yīng)用前景，但同時應(yīng)防范生育期過長引起的不利影響?？钩輨┭苌謴拖等A84EP-2在結(jié)實率、千粒重、有效穗數(shù)性狀上具有最高的一般配合力效應(yīng)，在生育期、株高上具有最低的一般配合力效應(yīng)；這表明恢復系華84EP-2在配制高結(jié)實、大粒密穗、早熟、矮稈的抗除草劑雜交組合上具有潛在的應(yīng)用前景?？钩輨┭苌謴拖等A84EP-3主要在著力密度、穗總粒數(shù)性狀上具有最高的一般配合力效應(yīng)，表明其在配制重穗型的抗除草劑雜交組合上具有潛在的應(yīng)用前景。相比與原始恢復系華84，3份抗除草劑衍生恢復系（華84EP-1、華84EP-2、華84EP-3）除了在除草劑抗性上進行了徹底改良，同時在這些重要農(nóng)藝性狀上的一般配合力效應(yīng)也進行了不同程度的改良。

表5 父本的一般配合力效應(yīng)

2.4 不育系一般配合力效應(yīng)分析

與前面母本類似，本試驗中供試的5個不育系（紅香2A、Y58S、廣占63-4S、華1015S、天源6S）主要農(nóng)藝性狀的一般配合力效應(yīng)分析見表6。不育系紅香2A在單株產(chǎn)量、穗實粒數(shù)這2個性狀上的一般配合力是供試不育系中最高的，生育期的一般配合力最??；這說明不育系紅香2A在組配高產(chǎn)、早熟雜交組合方面上具有優(yōu)勢。不育系Y58S在生育期、株高中的一般配合力均較小，表明其是一個配制早熟、矮稈雜交組合的理想親本。不育系廣占63-4S在結(jié)實率、千粒重、株高、穗長上的一般配合力是供試不育系中最高的，表明廣占63-4S是一個配制高結(jié)實率、大粒長穗型雜交組合的優(yōu)良親本；但同時應(yīng)警惕高稈可能引起的倒伏。在供試不育系中，華1015S具有最高的生育期、有效穗數(shù)一般配合力，較高的單株產(chǎn)量、結(jié)實率、千粒重、株高一般配合力；這表明不育系華1015S在組配出強分蘗、高產(chǎn)、高結(jié)實率、大粒型的雜交組合上具有優(yōu)勢；但同時應(yīng)防范生育期過長和高稈引起的倒伏。不育系天源6S在著力密度、穗總粒數(shù)上具有最高的一般配合力效應(yīng)，在株高上具有最低的一般配合力效應(yīng)；這表明不育系天源6S在配制矮稈、重穗型雜交組合方面具有優(yōu)勢。通過配合力分析表明，這些不育系親本在不同的農(nóng)藝性狀上各有可取之處。在育種實踐中，應(yīng)根據(jù)育種目標合適地選擇不同親本。

表6 母本的一般配合力效應(yīng)

2.5 雙親特殊配合力效應(yīng)分析

雜交組合的表現(xiàn)除了與雙親的一般配合力效應(yīng)有關(guān)，還與兩者間的特殊配合力效應(yīng)緊密相連。通過對雙親配組組合的特殊配合力效應(yīng)進行全面分析（表7），單株產(chǎn)量上雙親特殊配合力效應(yīng)變幅在-9.00～12.48 g之間，其中最高的3個組合分別是天源6S/華84EP-1(12.48 g)、紅香 2A/華 84EP-3(10.86 g)、Y58S/華84EP-2(7.15 g)；結(jié)實率特殊配合力效應(yīng)最高的3個組合分別為 Y58S/華 84EP-2(4.37%)、華 1015S/華 84EP-3(4.13%)、紅香 2A/華 84EP-3(3.86%)；千粒重特殊配合力效應(yīng)最高的3個組合分別為紅香2A/華84EP-2(0.79g)、廣占 63-4S/華84EP-1(0.78g)、華1015S/華84EP-3(0.46g)。生育期作為育種中的重要目標，在不影響產(chǎn)量及品質(zhì)的情況下短生育期的雜交組合在生產(chǎn)上更受歡迎；從表7可知生育期特殊配合力負效應(yīng)值最大的3個組合分 別為華1015S/華84EP-1（-8.28天）、天源6S/華84EP-2（-6.88天）、天源6S/華84EP-3（-5.28天）。株高與水稻抗倒伏、產(chǎn)量密切相關(guān)，供試的20個雜交組合株高特殊配合力效應(yīng)-10.33～6.55 cm之間，為了同時兼顧到抗倒伏與產(chǎn)量育種時應(yīng)選取合適的株高至關(guān)重要。有效穗數(shù)上雙親特殊配合力效應(yīng)變幅在-2.03～1.77個之間，其中特殊配合力效應(yīng)最高的3個組合分別是紅香2A/華 84EP-3、天源 6S/華 84EP-2、Y58S/華 84EP-3。著力密度上雙親特殊配合力效應(yīng)變幅在-18.53～9.81粒/10 cm之間，其中特殊配合力效應(yīng)最高的3個組合分別是：天源6S/華84EP-3、廣占63-4S/華84EP-2、天源6S/華84。穗總粒數(shù)上雙親特殊配合力效應(yīng)變幅在-39.85～28.90粒之間，其中特殊配合力效應(yīng)最高的3個組合分別是：天源6S/華84EP-3、Y58S/華84EP-2、天源6S/華84EP-1。穗實粒數(shù)上雙親特殊配合力效應(yīng)變幅在-28.43～33.28粒之間，其中特殊配合力效應(yīng)最高的3個組合分別是：Y58S/華84EP-2、天源6S/華84EP-1、廣占63-4S/華84EP-3。穗長性狀上雙親特殊配合力效應(yīng)變幅在-1.08～1.49 cm之間，其中特殊配合力效應(yīng)最高的 3 個 組 合 分 別 是 ：Y58S/華 84EP-2、華 1015S/華84EP-3、天源6S/華84。

表7 雜交組合主要農(nóng)藝性狀的特殊配合力效應(yīng)值

2.6 雜交組合的優(yōu)勢表現(xiàn)

在水稻品種審定和推廣生產(chǎn)中，雜交組合的利用價值往往通過與生產(chǎn)上對照品種進行比較的超標優(yōu)勢得以體現(xiàn)。在供試的20個雜交組合中，絕大部分組合都較對照品種減產(chǎn)，比國家水稻區(qū)試對照品種豐兩優(yōu)四號增產(chǎn)的組合僅有5個（表8），其中增產(chǎn)幅度超過10%的雜交組合有3個：天源6S/華84EP-1(23.54%)、紅香 2A/華 84EP-3(13.45%)、華 1015S/華 84EP-1(11.75%)。其中增產(chǎn)幅度最大的組合天源6S/華84EP-1，其父本華84EP-1的單株產(chǎn)量一般配合力、雙親的單株產(chǎn)量特殊配合力分別是所有供試恢復系、雜交組合中最高的（表5和表7），其母本天源6S的產(chǎn)量一般配合力也居于中等（表6）；產(chǎn)量居第二位的組合紅香2A/華84EP-3，其母本紅香2A的單株產(chǎn)量一般配合力是供試不育系中最高的（表6），且雙親特殊配合力效應(yīng)也居于第二位（表7）；產(chǎn)量居第三位的組合華1015S/華84EP-1，其父本華84EP-1、母本華1015S的單株產(chǎn)量一般配合力分別是所有供試恢復系、不育系中的第1和第2位，且雙親特殊配合力效應(yīng)也居于前列。顯然，高產(chǎn)雜交組合都有一個共同點：單株產(chǎn)量性狀上單親或雙親的一般配合力效應(yīng)、雙親的特殊配合力效應(yīng)均居于前列，這樣才有可能育成強優(yōu)勢的組合[14-15]。

表8 雜交組合的產(chǎn)量表現(xiàn)和超標優(yōu)勢

3 討論與結(jié)論

自1996年批準商業(yè)化種植轉(zhuǎn)基因作物以來，抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物種植面積始終占據(jù)首位，在2014年達到最大（10260萬hm2），近幾年也維持在8000萬hm2以上[16]。近年來，轉(zhuǎn)復合性狀（多種性狀的結(jié)合）的轉(zhuǎn)基因作物種植面積持續(xù)增長且增幅顯著，可以預見未來幾年復合性狀轉(zhuǎn)基因作物將超過單抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物成為全球種植面積最大的性狀[16]。在中國，雜交水稻在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中扮演了重要的角色，中國每年雜交水稻種植面積約在1470萬hm2[17]，按每公頃22.5 kg用種量估算，每年中國雜交水稻種子約在30萬t以上。這其中雜交水稻品種純度是一個影響種子質(zhì)量的重要因素，這直接關(guān)系到水稻的產(chǎn)量。雜交水稻制種中，影響品種純度的一個關(guān)鍵因素是水稻光溫敏核不育系和少數(shù)核質(zhì)互作型雄性不育系的育性受溫度影響，制種過程遇異常低溫會導致其部分自交結(jié)實，從而使雜交種子中因混雜有不育系種子而失去種用價值[6-7]。

本研究中為了評估抗除草劑基因EPSPs在提高雜交水稻品種純度中的應(yīng)用潛力，選用抗除草劑恢復系（華84EP-1、華84EP-2、華84EP-3）與4份光溫敏核不育系（Y58S、廣占63-4S、華1015S、天源6S）和1份紅蓮細胞質(zhì)不育系紅香2A進行配組，這些雜交組合是在海南陵水的3—4月通過直接剪穎授粉進行配制，此時當?shù)販囟炔▌虞^大，導致配制的這些雜交組合純度較低，純度介于44.9%～52.6%之間（經(jīng)苗期除草劑抗性鑒定，表2），通過田間噴施除草劑可以在苗期去除假雜種，極大地提高雜交種純度，這可以通過移栽后小區(qū)的整齊度及結(jié)實情況得到驗證（各小區(qū)內(nèi)植株高矮、花期整齊一致、未出現(xiàn)不育植株，結(jié)實正常）。供試雜交組合中，初步篩選出3個雜交組合（天源6S/華84EP-1、紅香2A/華84EP-3、華1015S/華84EP-1）的產(chǎn)量優(yōu)勢超過對照10%以上，為進一步客觀評價這些組合的綜合表現(xiàn)，后面還需多年多點對其品質(zhì)、生育期、抗性等做出全面的評價，以期篩選出產(chǎn)量高、品質(zhì)優(yōu)、抗性強、生育期適宜的強優(yōu)勢雜交組合。