虎杖煮散工藝研究

朱樹強(qiáng) 盧 泳,2 甘國興,2 蔡燕華

1.廣東省清遠(yuǎn)市中醫(yī)院，廣東 清遠(yuǎn) 511500；2.廣東省鮮藥民族醫(yī)藥工程技術(shù)研究中心，廣東 清遠(yuǎn) 511500

虎杖是蓼科植物虎杖PolygonumcuspidatumSieb.et Zucc.的干燥根莖和根，具有利濕退黃、清熱解毒、散瘀止痛、止咳化痰等功效[1]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)虎杖的主要藥效成分為虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素和大黃素甲醚，具有抗細(xì)菌、抗真菌、抗病毒活性，對心肌損傷有一定的保護(hù)作用[2-3]。隨著廣大人民群眾越來越接受中醫(yī)藥，中藥材的使用量不斷增加，中藥材特別是道地中藥材的供應(yīng)出現(xiàn)了短缺。煮散是將飲片經(jīng)粉碎加工為粗粉后與水共煮去渣取汁而成，具有節(jié)省藥材、節(jié)省煎煮時間、方便患者使用的優(yōu)點(diǎn)，能緩解醫(yī)院中藥代煎候藥時間較長、中藥飲片費(fèi)用高等問題[4]。本文將考察虎杖煮散工藝的主要影響因素，為其優(yōu)選安全有效的煮散工藝，探索虎杖煮散飲片的科學(xué)性，為虎杖飲片形態(tài)改革提供一種新的思路。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀：Waters e2695液相色譜儀，2489UV紫外檢測器，Empower3數(shù)據(jù)分析軟件(美國沃特世公司)；梅特勒-托利多電子分析天平(梅特勒-托利多公司)；PS-100A型超聲波清洗器(東莞市潔康超聲波設(shè)備有限公司)；TG16-WS型高速臺式離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱XMTD-8222(上海精宏)。

1.2 試藥與試劑 虎杖飲片(廣州市志寧藥業(yè)有限公司，產(chǎn)地：安徽；批號：180801)，經(jīng)清遠(yuǎn)市中醫(yī)院藥學(xué)部黃玉明副主任中藥師鑒定為虎杖正品飲片?；⒄溶諏φ掌?批號：111575-201603；含量：87.3%)，大黃素對照品(批號：110756-201913；含量：96.0%)，購于中國食品藥品檢定研究院。色譜純乙腈(德國 Merk 公司)，分析純甲醇和甲酸(廣州化學(xué)試劑廠)，蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 虎杖苷和大黃素含量測定方法的建立

2.1.1 色譜條件 色譜柱：phenomenex Kinetex? XB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：乙腈(A)-0.1%甲酸(B)，梯度洗脫：0～15 min,15%～20%A；15～25 min，20%～40%A；25～38 min，40%～60%A ；38～43 min，60%A；43～45 min，60%～15%A；45～53 min，15%A；流速1.0 mL·min-1；檢測波長254 m和306 nm；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。色譜圖如圖1所示。

A.對照品溶液；B.虎杖飲片；1.虎杖苷；2.大黃素

2.1.2 對照品溶液制備 分別精密稱取適量虎杖苷和大黃素對照品，加入甲醇溶解，配成每1 mL含虎杖苷351.12 μg，含大黃素410.50 μg的混合對照溶液。

2.1.3 供試品溶液制備

2.1.3.1 飲片供試品溶液的制備 取虎杖粉末0.15 g，精密稱定，置100 mL錐形瓶中，加入精密吸取的50 mL甲醇，密塞，稱重，水浴中超聲處理30 min，放冷至室溫，稱重并加甲醇補(bǔ)足重量，搖勻，過濾，用0.45 μm的微孔濾膜過濾，濾液即為飲片供試品溶液。

2.1.3.2 煎煮液供試品溶液制備 取煎煮液樣品溶液，精密吸取5 mL濾液置10 mL容量瓶中，加入甲醇定容，8000 rp·min-1離心10 min，濾過，即得。

2.1.4 線性關(guān)系的考察 分別精密量取混合對照品溶液0.4 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL，按上述色譜條件進(jìn)樣，測定峰面積。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)行線性回歸，回歸方程及線性范圍見表1。結(jié)果虎杖苷和大黃素的相關(guān)系數(shù)均為0.9999，虎杖苷在70.34～703.45 ng，大黃素在41.05～820.99 ng范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，表明虎杖苷和大黃素進(jìn)樣量與峰面積之間均具有良好的線性關(guān)系。

隨著種植密度的不斷增加會導(dǎo)致玉米興玉101的葉綠素A與葉綠素B的含量逐漸減少，同時也會對凈光合速率與凈同化率造成較為嚴(yán)重的影響，光合作用中的關(guān)鍵酶PEPcase與RuBPCase活性逐漸降低。與此同時，隨著種植密度的不斷在增加會導(dǎo)致葉肉細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)出現(xiàn)破裂或損壞的情況，細(xì)胞內(nèi)的葉綠體數(shù)量也會逐漸減少。通常情況下葉綠體的結(jié)構(gòu)屬于梭形，但由于種植密度的增加對玉米興玉101光合作用產(chǎn)生影響導(dǎo)致葉綠體的形狀變?yōu)闄E圓形，最終導(dǎo)致葉綠體膜結(jié)構(gòu)出現(xiàn)不完整的情況。除此之外，由于種植密度的增加導(dǎo)致玉米興玉101的光合作用受到影響最終會導(dǎo)致玉米成熟期被延長，整體光合作用下降導(dǎo)致玉米的產(chǎn)量降低。

表1 線性關(guān)系考察

2.1.5 精密度試驗(yàn) 取“2.1.2”項(xiàng)下對照品溶液，按上述色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，測定各成分峰面積，計算其RSD值。結(jié)果顯示，虎杖苷RSD為0.50%，大黃素RSD值為0.32%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一虎杖樣品6份，按“2.1.3.1”項(xiàng)下方法制備飲片供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣，測定各成分的含量，計算RSD值。結(jié)果顯示，虎杖苷、大黃素的平均含量分別2.08%、0.49%，RSD分別為1.16%，2.51%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一飲片供試品溶液，按上述色譜條件，分別于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h進(jìn)樣測定各成分峰面積，計算其RSD值。結(jié)果顯示虎杖苷峰面積的RSD為3.64%，大黃素峰面積的RSD為3.56%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一虎杖樣品6份，按“2.1.3.1”項(xiàng)下方法制備飲片供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣，測定各成分的含量，計算RSD值。結(jié)果顯示，虎杖苷、大黃素的平均含量分別2.08%、0.49%，RSD分別為1.16%，2.51%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱定已測含量的虎杖樣品9份(虎杖苷1.24%；大黃素0.61%)，每份0.15 g，加入虎杖苷和大黃素對照品適量，按“2.1.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣，計算各成分的回收率?；⒄溶蘸痛簏S素的平均回收率分別為102.25%、101.05%；RSD分別為0.88%、0.95%。結(jié)果表明方法準(zhǔn)確度良好。

2.2 干膏率的測定 精密吸取煎煮液50 mL，置于已恒定質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于105 ℃干燥至恒重，迅速精密稱定質(zhì)量，計算干膏率。

2.3 虎杖煮散工藝的考察

2.3.1 煮散粒徑考察

2.3.1.2 飲片煎煮液制備 稱取虎杖飲片100 g，加 8 倍量水浸泡 30 min，煎煮30 min，過濾，藥渣加 6 倍量水煎煮 30 min。合并濾液，濃縮成200 mL，得0.5 g·mL-1藥液。

2.3.1.3 煮散煎煮液制備 分別稱取不同規(guī)格的煮散飲片100 g，加10倍水浸泡5 min，煮沸15 min,過濾，濃縮成400 mL溶液，得0.25 g·mL-1藥液。

2.3.1.4 煮散粒徑選擇 分別精密吸取飲片和不同粒徑飲片煮散湯劑50 mL置于蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，105 ℃干燥至恒重，稱定質(zhì)量，計算干膏率。飲片的平均干膏率為(21.16±0.07)%、5～10目飲片煮散的平均干膏率為(17.39±0.06)%、10～24目飲片煮散的平均干膏率為(20.95±0.71)%，24～65 目飲片煮散的平均干膏率為(19.41±0.42)%。不同粒徑的干膏率有一定的差異，其中10～24 目和 24～65 目干膏率與飲片的相近，為了保持與臨床湯劑相同的療效，因此認(rèn)為 10～65 目的為最佳粒徑范圍。

2.3.2 煎煮時間考察 稱取5份50.0 g虎杖煮散飲片，加入10倍量水，浸泡5 min，分別煎煮5 min、10 min、15 min、20 min、25 min，用100目篩過濾后濃縮至200 mL,測定湯劑相對密度。結(jié)果5 min的相對密度為1.0174，10 min的相對密度為1.0186，15 min的相對密度為1.0207，20 min的相對密度為1.0213，25 min的相對密度為1.0206。15 min、20 min、25 min的相對密度相當(dāng)，所得湯劑均小于300 mL。故選擇5 min、10 min、15 min進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.3.3 加水量考察 稱取5份50.0 g虎杖煮散飲片，分別加入8倍、10倍、12倍、14倍、16倍水，浸泡5 min，煎煮10 min，用100目篩過濾，分別得湯劑230 mL、320 mL、430 mL、500 mL、630 mL。根據(jù)湯劑服用量300～600 mL，選擇10倍、12倍、14倍水進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.3.4 浸泡時間考察 稱取5份50.0 g虎杖煮散飲片，加入10倍量水，分別浸泡0 min、5 min、10 min、15 min、20 min，煎煮10 min，用100目篩過濾。靜置后觀察湯劑分層情況，根據(jù)分層情況選擇浸泡0 min、5 min、10 min進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.3.5 虎杖煮散煎煮工藝正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，考察煎煮時間(A)、加水量(B)、浸泡時間(C)對成分含量與干膏率的影響，每個因素考察3個水平，由上述單因素試驗(yàn)結(jié)果，各因素考察水平定為煎煮時間5 min、10 min、15 min，加水量10倍、12倍、14倍，浸泡時間0 min、5 min、10 min。按L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)。以虎杖苷含量(30%)、大黃素含量(30%)及干膏得率(40%)計算綜合加權(quán)評分，優(yōu)選虎杖煮散工藝。因素水平設(shè)計見表2。

表2 因素水平設(shè)計表

根據(jù)虎杖飲片煮散正交試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行評分。評分標(biāo)準(zhǔn)為虎杖苷含量(30%)、大黃素含量(30%)和總固體(40%)進(jìn)行綜合評分[綜合評分=(X/Xmax ×0.3+Y/Ymax ×0.3+Z/Zmax ×0.4) ×100%)]。直觀分析見表3。由表3 可知影響因素大小順序?yàn)榧铀?浸泡時間>煎煮時間，優(yōu)選工藝為A 2 B3 C 1 。根據(jù)正交試驗(yàn)得出優(yōu)選煎煮工藝為 A2 B3 C1 ，即加 14倍量水、浸泡 0 min 、煎煮 10 min 。

表3 正交試驗(yàn)表

2.8.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 為考察所選因素水平中最佳工藝的穩(wěn)定性及可行性，按照最佳工藝條件進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，工藝流程圖如圖2。結(jié)果提示，3 批虎杖飲片煮散中的虎杖苷濃度、大黃素濃度和總固體的RSD均<1.1%。表明所選虎杖飲片煮散工藝穩(wěn)定可行。結(jié)果見表4。

圖2 虎杖煮散工藝流程圖

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

2.9 煮散劑量選擇 稱取虎杖飲片150 g，按“2.6.2”方法制備湯劑，取煮散飲片按照“2.7”項(xiàng)下優(yōu)選的方法制備湯劑。以虎杖苷含量(30%)、大黃素含量(30%)和總固體(40%)為評價指標(biāo)，篩選虎杖煮散飲片臨床劑量。結(jié)果表明，75.0 g煮散飲片，與150 g飲片的分?jǐn)?shù)接近，因此推薦虎杖飲片與煮散飲片的臨床劑量比為2∶1。結(jié)果見表5。

表5 虎杖煮散飲片劑量選擇

3 結(jié)論

虎杖煮散工藝為:飲片粉碎至10～65目制備煮散飲片，稱取煮散飲片，加入14倍量的飲用水，煎煮10 min?；⒄戎笊嬈昧繛閭鹘y(tǒng)飲片的1/2。

4 討論

4.1 色譜條件選擇 本研究在2020年版中國藥典一部項(xiàng)下虎杖中虎杖苷與大黃素的含量測定方法基礎(chǔ)上，先考察了254 nm和306 nm波長下的色譜峰，發(fā)現(xiàn)虎杖苷和大黃素在這兩個波長條件下色譜峰的相應(yīng)值差異較大，因此，選擇254 nm和306 nm作為含量測定的吸收波長?？疾旒状?0.1%磷酸(80∶20，V/V)和乙腈-水(23∶77，V/V)流動相系統(tǒng)[5-6]，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)色譜峰分離度不好。為了提高色譜峰分離度并使出峰時間合理，采用乙腈-0.1%甲酸水溶液梯度洗脫的方法，通過改變流動相比例，優(yōu)選出乙腈-0.1%甲酸水溶液梯度洗脫系統(tǒng)作為虎杖苷和大黃素含量測定的流動相。

4.2 虎杖煮散工藝和劑量選擇 本研究首先考察了虎杖煮散飲片粒徑，通過考察出膏率，發(fā)現(xiàn)10～24目和24～65目的煮散飲片出膏率與飲片的相近，而且沒有出現(xiàn)粘鍋糊底現(xiàn)象，因此選擇10～65目作為虎杖煮散飲片粒徑。通過單因素考察，選擇浸泡時間、加水量、煎煮時間的3個水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，以虎杖苷含量(30%)、大黃素含量(30%)和總固體(40%)為評價指標(biāo)進(jìn)行加權(quán)評分，進(jìn)一步優(yōu)選虎杖煮散工藝，確定虎杖煮散工藝為加14倍量水、浸泡0 min、煎煮10 min。使用該工藝煮散，不需要浸泡，煎煮時間大幅減少，大大減少了候藥時間，體現(xiàn)了煮散快的特點(diǎn)。文獻(xiàn)[7-8]報道，煮散劑量與飲片劑量比在1/4～1/2之間，因此本研究選擇25%、30%、35%、40%、45%、50%的比例考察飲片煮散劑量，發(fā)現(xiàn)50%的飲片煮散的評分與飲片相近，因此推薦虎杖飲片煮散與飲片臨床劑量比為1∶2。