酒精浸泡冷藏鮮印度塊菌貨架期評估、揮發(fā)性物質(zhì)與細(xì)菌群落變化及其相關(guān)性

黎 琦，鄒璐潞，馬沁沁，朱 林，何淑豪，梁詩慧，苗玉志

（四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610100）

鮮印度塊菌（Tuber indicum）因其營養(yǎng)豐富、芳香濃郁并富含抗氧化、抗菌、抗腫瘤、抗抑郁和免疫調(diào)節(jié)等生物活性物質(zhì)被譽(yù)為“餐桌上的鉆石”“地下黃金”，是世界上最美味、最珍貴的食用菌之一，受到國內(nèi)外消費(fèi)者的青睞，且由于國內(nèi)外市場價(jià)格高而具有極大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1-4]。但塊菌生長環(huán)境的特殊性和子囊果內(nèi)部結(jié)構(gòu)的獨(dú)特性造就了成熟塊菌子囊果內(nèi)含大量的微生物[5]，加之采后旺盛的新陳代謝和呼吸作用，使得塊菌在新鮮時(shí)極易腐爛變質(zhì)，失去營養(yǎng)作用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[6]，而傳統(tǒng)的凍藏技術(shù)會導(dǎo)致塊菌解凍后芳香物質(zhì)大量流失和質(zhì)地軟化，所以實(shí)現(xiàn)鮮印度塊菌采后貯藏保鮮，有效延長其貨架期，是塊菌產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的必經(jīng)之路。

國內(nèi)外學(xué)者已就黑孢塊菌（Tuber melanosporum）、夏塊菌（T.aestivum）、白塊菌（T.magnatum）以及印度塊菌（T.indicum）等不同種塊菌的貯藏保鮮技術(shù)進(jìn)行了研究，在已有報(bào)道中，多以添加劑處理結(jié)合氣調(diào)或真空包裝保藏為主，如Elena等[7]利用質(zhì)量濃度2.5 mg/mL沒食子酸處理黑孢塊菌后置于4 ℃冷藏保鮮，其貨架期可達(dá)28 d；Choo等[8]采用質(zhì)量濃度400 mg/L殼聚糖-納他霉素對鮮澳大利亞黑塊菌進(jìn)行涂膜處理，有效降低了塊菌微生物數(shù)量，將貨架期延長至28 d；Sara等[9]采用復(fù)配的混合氣體于聚丙烯容器中30 kPa氣壓包裝鮮黑孢塊菌后冷藏，其貨架期延長至28 d。研究表明，采用復(fù)合食品添加劑處理鮮印度塊菌后真空包裝并于4 ℃貯藏其貨架期延長至49 d[9-10]。但這些技術(shù)多存在處理和包裝工序復(fù)雜以及設(shè)備要求高等問題，難以在日常生活中得以有效應(yīng)用，從而限制了鮮印度塊菌的消費(fèi)。因此，開發(fā)一個簡單易行且能有效延長鮮印度塊菌貨架期的貯藏保鮮技術(shù)，不僅能保存鮮印度塊菌的營養(yǎng)價(jià)值而且能促進(jìn)鮮印度塊菌的消費(fèi)[11]。

鮮印度塊菌貯藏保鮮技術(shù)研發(fā)過程中，塊菌的感官、微生物數(shù)量、營養(yǎng)組分以及芳香物質(zhì)常被用作塊菌新鮮度、安全性的重要指標(biāo)，而其中塊菌的揮發(fā)性物質(zhì)尤其重要。研究表明，大多塊菌揮發(fā)性芳香成分由大約56 種芳香物質(zhì)組成，其中11～13 種處于嗅覺可感知的水平[12-14]，而未經(jīng)處理的鮮印度塊菌在貯藏保鮮過程中其揮發(fā)性芳香物質(zhì)含量會不斷下降而腐敗類異味物質(zhì)含量持續(xù)增加，雖然變化機(jī)制尚不完全清楚，但豐富的內(nèi)生微生物群落可能參與了這一過程[15-16]，并與塊菌貯藏期間產(chǎn)生的腐敗類異味物質(zhì)，如三甲基胺和2-甲基異茨醇等相關(guān)[17]。但關(guān)于鮮印度塊菌貯藏保鮮過程中營養(yǎng)組分、揮發(fā)性物質(zhì)和細(xì)菌群落在冷藏過程中的變化規(guī)律及其相關(guān)性迄今未知。

本實(shí)驗(yàn)以鮮印度塊菌為原料，經(jīng)過溫開水清洗、食用酒精速泡和4 ℃冷藏等工序處理，以感官評價(jià)為標(biāo)準(zhǔn)研究簡單有效并能提升鮮印度塊菌貨架期的冷藏技術(shù)，并深入分析鮮印度塊菌冷藏期間營養(yǎng)組分、揮發(fā)性物質(zhì)和細(xì)菌群落變化及相關(guān)性，以期為進(jìn)一步研究鮮印度塊菌腐敗機(jī)制和貯藏保鮮新技術(shù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮印度塊菌采挖于四川攀枝花3 個塊菌自然產(chǎn)區(qū)，每個產(chǎn)區(qū)各約1000 g。采挖后立即用無菌濕巾紙單個包裹后置于裝有冰袋的隔熱泡沫盒中2 d內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，置于4 ℃冰箱備用。

葡萄糖 成都曼思特公司；苯酚、氫氧化鈉、濃硫酸、硫酸銅、硫酸鉀、硼酸、鹽酸、甲基紅、亞甲基藍(lán)、仲辛醇等常規(guī)化學(xué)試劑（均為分析純）、食用酒精（食品級） 成都科龍化工試劑廠；瓊脂 青島海博生物公司；Qubit dsDNA Assay Kit試劑盒 美國Life Technologies公司；Tks Gflex DNA ploymerase試劑盒美國Takara公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GI100DS型自動高壓蒸汽滅菌鍋 美國Zealway公司；THZ-98A型恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海一恒科技公司；K9840型全自動凱氏定氮儀 濟(jì)南海能儀器股份公司；Intuvo 9000/5977B型氣相色譜/單四極桿氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)、PAL型自動進(jìn)樣器和PDMS/DVB型自動固相微萃取頭 美國Agilent公司；2500型凝膠成像儀北京Tanon公司；MiSeqPE300 美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 冷藏塊菌樣品的制備

在充分預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上制備：從每個產(chǎn)區(qū)挑選成熟度和大小基本均勻一致的塊菌各16 個，用潤濕的軟毛刷除凈子囊果表面的泥土，于溫開水中淘洗干凈并于通風(fēng)櫥中風(fēng)干表面水，置于體積分?jǐn)?shù)75%食用酒精溶液中浸泡消毒30 s，立即用溫開水沖洗子囊果5 次再風(fēng)干表面水。分別將每個子囊果切分成1/9大?。ɑ? 個時(shí)間點(diǎn)取樣分析），混合均勻后均分到9 個無菌聚乙烯袋（20 cmh 22 cm）內(nèi)真空包裝后于4 ℃冷藏保鮮，貯藏環(huán)境的相對濕度控制在76%～80%，分別于冷藏的0、8、15、20、25、30、33、36 d和38 d取樣，進(jìn)行感官評定、營養(yǎng)和揮發(fā)性物質(zhì)含量分析，同時(shí)采用16S rRNA高通量測序技術(shù)測序，以不浸泡處理的鮮印度塊菌作為對照，每樣進(jìn)行3 個平行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 感官評定

感官評定采用9 分制評分標(biāo)準(zhǔn)，具體方法參考Rivera等[18]的評定標(biāo)準(zhǔn)稍作修改。由9 名經(jīng)過專業(yè)訓(xùn)練的評定人員（包含3 名行業(yè)專家）組成評價(jià)小組，通過擠壓質(zhì)地、嗅聞香氣、舌嘗風(fēng)味和眼觀樣品內(nèi)部顏色和紋理，并綜合評價(jià)各個樣品的可接受程度，評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 鮮印度塊菌感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criteria for sensory evaluation of fresh truffles

1.3.3 營養(yǎng)組分和質(zhì)量損失率測定

取待測樣品用無菌刀將其切碎，凍干至恒質(zhì)量、粉碎、過60 目篩，裝入清潔的廣口瓶密封，放入干燥器內(nèi)備用?？偺呛康臏y定參照GB/T 15672-2009《食用菌中總糖含量的測定》，蛋白質(zhì)含量測定參照GB 5009.5-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》，粗纖維含量的測定參照GB 5009.88-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中膳食纖維的測定》。冷藏期間塊菌質(zhì)量損失率通過塊菌貯藏前后的質(zhì)量變化計(jì)算[19]，如公式（1）所示。

1.3.4 揮發(fā)性物質(zhì)分析

1.3.4.1 頂空固相微萃取提取

準(zhǔn)確稱量塊菌各凍干樣品2.0 g進(jìn)行如下操作，將樣品置于20 mL頂空硅膠隔墊進(jìn)樣瓶中，加入10 μL用超純水稀釋的仲辛醇溶液（質(zhì)量濃度0.52 μg/μL）作為內(nèi)標(biāo)，將頂空瓶置于53 ℃水浴鍋中平衡45 min，將老化后的萃取頭插入頂空進(jìn)樣瓶中，頂空吸附40 min后通過PAL自動進(jìn)樣器進(jìn)樣并采用氣相色譜/單四極桿氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)進(jìn)行測定[20]。

1.3.4.2 氣相色譜-質(zhì)譜分析

色譜柱為HP-INNOWax 毛細(xì)管色譜柱（30 mh 250 μmh 0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度240 ℃，解吸時(shí)間5 min，采用不分流模式進(jìn)樣。升溫程序：50 ℃保持5 min，3 ℃/min速率升溫至185 ℃，10 ℃/min速率升溫至200 ℃保持1 min，以10 ℃/min的速率升溫至250 ℃并保持3 min。載氣為高純氦氣，柱流速1 mL/min，進(jìn)樣量1.0 μL，不分流。質(zhì)譜條件：檢測器單四極桿，電子轟擊EI離子源，電子能量70 eV，接口溫度280 ℃，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，溶劑延遲0 min，全掃描信號采集，掃描范圍m/z20～550，掃描速率781 u/s。通過計(jì)算機(jī)標(biāo)準(zhǔn)譜庫（NIST 2017）比較分析塊菌的揮發(fā)性物質(zhì)，選擇匹配度大于80%的物質(zhì)并結(jié)合安捷倫質(zhì)譜系統(tǒng)進(jìn)行定性分析；數(shù)據(jù)定量分析采用內(nèi)標(biāo)法半定量分析，按照公式（2）計(jì)算各樣品揮發(fā)物質(zhì)的含量[20]。

1.3.5 高通量測序

將制取的不同冷藏時(shí)間鮮印度塊菌樣本用干冰包裝送至上海派森諾生物科技有限公司，基于Illumina MiSeq平臺進(jìn)行高通量測序，細(xì)菌多樣性鑒定對應(yīng)測序區(qū)域?yàn)?6S V3～V4區(qū)。實(shí)驗(yàn)操作參考趙萍等[21]描述的方法進(jìn)行。

樣本α-多樣性分析：1）Sobs稀釋性曲線，稀釋性曲線根據(jù)個體數(shù)量和物種數(shù)量構(gòu)建曲線，用來比較測序數(shù)據(jù)量不同的樣本中物種的豐富度，也用于指示測序數(shù)據(jù)量是否合理。利用Mothur軟件做Rarefaction分析，R語言繪圖；2）微生物多樣性是在生物群落水平上進(jìn)行研究的，通過對單樣本的菌群豐度指數(shù)（Chao1指數(shù)）和菌群多樣性指數(shù)（Shannon、Simpson指數(shù)和Coverage指數(shù)）進(jìn)行研究，可以反映微生物群落的豐度和多樣性；3）Shannon指數(shù)用于反映各樣本在不同測序量下各樣品的微生物多樣性。利用Mothur軟件計(jì)算不同隨機(jī)抽樣下的Shannon指數(shù)，并用R語言繪圖；4）主成分分析（principal component analysis，PCA），通過分析不同樣本的操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）（97%相似性），使用R語言作二維坐標(biāo)圖，可以反映樣本間的差異和距離。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

高通量測序完成后，對原始雙端系列去雜，利用Flash軟件進(jìn)行拼接，然后利用Uchime軟件檢測并去除序列中的嵌合體。有效序列采用Vsearch軟件，根據(jù)序列的相似性，將相似度≥97%的序列歸為多個OTU，使用Qiime軟件包挑選出各個OTU的代表序列，并將所有代表序列與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對比注釋。基于分類信息學(xué)信息，探討鮮印度塊菌冷藏期間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化。使用Excel軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理、匯總，采用SPSS 26軟件進(jìn)行顯著性分析，其中多重比較采用鄧肯法，P＜0.05、P＜0.01分別表示差異顯著和極顯著，利用Origin 2018軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 感官評定結(jié)果

按照評分標(biāo)準(zhǔn)對不同冷藏時(shí)間的實(shí)驗(yàn)組和對照組樣品進(jìn)行感官評定，結(jié)果見圖1A、C（單項(xiàng)得分）和圖1B、D（總分）。由圖1A可知，與貯藏0 d相比，冷藏15 d實(shí)驗(yàn)組塊菌的質(zhì)地、香氣、風(fēng)味和內(nèi)部紋理得分下降顯著（P＜0.05），15 d時(shí)實(shí)驗(yàn)組總得分37.00 分，但仍符合一級新鮮A，而對照組貯存30 d時(shí)樣本總得分下降極顯著（P＜0.01），總得分為9.33 分，達(dá)到腐敗標(biāo)準(zhǔn)，因而對15 d后的對照組樣本不再繼續(xù)研究；實(shí)驗(yàn)組樣本30 d時(shí)質(zhì)地、香氣、風(fēng)味和內(nèi)部紋理得分變化與0 d相比差異極顯著（P＜0.01），總得分降到19.00 分，品質(zhì)降到二級新鮮度B；在冷藏31～38 d時(shí)，塊菌質(zhì)地極軟，基本沒有塊菌的香氣和風(fēng)味，內(nèi)部顏色和大理石紋理消失，33 d時(shí)各項(xiàng)指標(biāo)總得分降到12.09 分，達(dá)到腐敗程度C，因而通過感官預(yù)測得到鮮印度塊菌貨架期為30 d，這同采用食品添加劑復(fù)合處理真空包裝鮮印度塊菌冷藏貨架期短19 d[10]，比采用輻射處理氣調(diào)包裝冷藏的貨架期短12 d[22]，比其他冷藏保鮮技術(shù)的28 d長2 d[9]。綜上，經(jīng)感官評定鮮印度塊菌在冷藏過程中歷經(jīng)一級新鮮A（0～15 d）、二級新鮮B（6～30 d）和腐敗C（31～38 d）3 個階段。

圖1 鮮印度塊菌冷藏期間的感官單項(xiàng)得分和總得分Fig.1 Sensory scores of fresh Tuber indium pretreated and not pretreated with alcohol during cold storage

2.2 營養(yǎng)組分和質(zhì)量損失率變化

對各樣品的總糖、總蛋白、粗纖維含量和質(zhì)量損失率分析結(jié)果見圖2，在冷藏15 d時(shí)，與0 d相比總糖相對含量由38.9%下降到31.1%（P＜0.01），而15～30 d內(nèi)，由31.1%下降到30.9%；總蛋白相對含量在0、15 d和30 d時(shí)分別為23.3%、22.9%和21.8%，但在38 d時(shí)，相對含量減少到17.1%（P＜0.05）；粗纖維相對含量在0、15 d和30 d時(shí)分別為43.9%、42.8%和41.4%，到38 d時(shí)粗纖維相對含量為36.8%，與0 d相比下降顯著（P＜0.05）；塊菌質(zhì)量損失率從0 d的2.55%升到38 d的6.95%，差異顯著（P＜0.05）。Saltarelli等[23]研究發(fā)現(xiàn)白塊菌、黑孢塊菌和夏塊菌的總蛋白相對含量沒有受到貯藏條件的影響，而波氏塊菌的總蛋白在冷藏30 d時(shí)含量顯著減少，說明塊菌冷藏過程中蛋白質(zhì)含量變化同塊菌品種相關(guān)。鮮印度塊菌在冷藏的0～38 d內(nèi)，總糖、總蛋白、粗纖維相對含量以及質(zhì)量損失率分別在0～15、15～30 d和30～38 d呈階段性變化，這進(jìn)一步印證了感官評定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

圖2 鮮印度塊菌冷藏過程中營養(yǎng)組分和質(zhì)量損失率變化Fig.2 Changes in nutritional components and mass loss percentage of fresh Tuber indium during cold storage

2.3 揮發(fā)性物質(zhì)變化

2.3.1 揮發(fā)性芳香和異味物質(zhì)

通常情況下，揮發(fā)性芳香化合物對塊菌香氣的貢獻(xiàn)由其含量和氣味閾值共同決定，含量高的揮發(fā)性芳香物質(zhì)對塊菌的風(fēng)味具有重要作用，但一些含量低且氣味閾值也低的化合物可能對塊菌整體風(fēng)味也具有顯著促進(jìn)作用[24]?；趽]發(fā)性物質(zhì)的離子流圖，從樣本中共檢測到67 種揮發(fā)性物質(zhì)（圖3A），其中揮發(fā)性芳香物質(zhì)合計(jì)38 種（圖3B），包括12 種酯類、9 種醇類、8 種醛類、5 種醛酮類、2 種酸類以及2 種其他類化合物，變化趨勢為從0 d的38 種減少到15 d的17 種，到38 d時(shí)僅有7 種被檢出且含量極低；而1-辛烯-3-醇是印度塊菌香氣中最重要的揮發(fā)性物質(zhì)之一，也是印度塊菌“蘑菇味”最主要的來源[25]，從冷藏0 d的塊菌中檢出0.43 μg/g 1-辛烯-3-醇，而在15 d后未檢出，對鮮印度塊菌香氣貢獻(xiàn)程度較大的揮發(fā)性物質(zhì)還有1-辛烯-3-酮、苯甲醛、己醛、2-辛酮等[26]在0 d的樣本中均檢出，但隨著冷藏時(shí)間的延長，其含量下降明顯，到30 d時(shí)均未檢出。二甲基硫醚被認(rèn)為是塊菌最重要和特有的芳香化合物，能呈現(xiàn)塊菌獨(dú)特的香氣[27]。Richard等[28]研究表明二甲基硫醚對黑孢塊菌和意大利白塊菌的芳香品質(zhì)貢獻(xiàn)程度最大，但本研究在印度塊菌中未檢出二甲基硫醚，而Zhang Bo等[29]則在新鮮印度塊菌中檢測到該物質(zhì)的存在，分析認(rèn)為酒精處理可能對印度塊菌中二甲基硫醚有影響，這一結(jié)論有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

由圖3C可知，“不愉快”“刺激性”的揮發(fā)性異味物質(zhì)從塊菌冷藏15 d的1 種持續(xù)增加，至38 d時(shí)增加到24 種；從含量方面看，3-甲基-1-丁醇自第8天開始出現(xiàn)，貯藏30 d增加到13.55 μg/g，再增加到38 d的40.52 μg/g；乙酸含量由2.06 μg/g（8 d）增加到10.44 μg/g（25 d），再到14.77 μg/g（36 d）；二甲醚含量由0.22 μg/g（8 d）增加到13.30 μg/g（25 d），再到31.72 μg/g（36 d）；3-甲基丁酸含量由0.15 μg/g（8 d）增加到3.39 μg/g（25 d）再增加到8.81 μg/g（36 d）；另外，具有酸敗味的庚醛、“不愉快的干椰肉油氣味”的己酸以及“腥臭味”的吡啶[24]，分別從0 d的0 μg/g增加到30 d的1.15、0.30 μg/g和0.99 μg/g，在38 d時(shí)分別達(dá)到1.31、1.31 μg/g和1.61 μg/g；此外，還有多達(dá)17 種異味物質(zhì)在30 d后才檢出，其出現(xiàn)的原因可能和塊菌子囊果內(nèi)大量存在的微生物有關(guān)[15-16]。另外，研究發(fā)現(xiàn)在冷藏過程中還存在含量基本保持不變的5 種揮發(fā)性物質(zhì)，其出現(xiàn)的原因和在塊菌中的作用有待進(jìn)一步研究。

圖3 鮮印度塊菌冷藏期間揮發(fā)性物質(zhì)離子流圖（A）、含量下降（B）和上升（C）的揮發(fā)性物質(zhì)Fig.3 Chromatogram (A) of volatile compounds from fresh Tuber indium,volatile compounds that decreased (B) and those that increased (C) during cold storage

2.3.2 揮發(fā)性物質(zhì)的PCA結(jié)果

含量下降的揮發(fā)性芳香物質(zhì)的PCA結(jié)果如圖4A所示，第一主成分（PC1）對原變量變化的解釋率為88.7%，第二主成分（PC2）對原變量變化的解釋率為7.8%，總解釋率為96.5%，解釋可信度極高，表明鮮印度塊菌在冷藏的0～20 d揮發(fā)性芳香物質(zhì)種類多濃度較高是維護(hù)鮮印度塊菌芳香的主要因子；同樣，含量上升的揮發(fā)性異味物質(zhì)PCA結(jié)果如圖4B所示，第一主成分（PC1）對原變量變化的解釋率為77.9%，第二主成分（PC2）對原變量變化的解釋率為14.9%，總解釋率為92.8%，解釋可信度較高，表明塊菌在冷藏0～15 d揮發(fā)性異味物質(zhì)種類少濃度低對塊菌質(zhì)量影響不明顯，在冷藏的20～30 d揮發(fā)性臭味物質(zhì)出現(xiàn)并隨冷藏時(shí)間的延長而增多，在30 d后揮發(fā)性臭味物質(zhì)種類多濃度高，對冷藏塊菌質(zhì)量影響明顯。

圖4 鮮印度塊菌冷藏期間揮發(fā)性芳香物質(zhì)（A）和異味物質(zhì)（B）的PCA圖Fig.4 PCA plots of volatile aroma compounds (A) and odor compounds (B) in fresh Tuber indium during cold storage

2.4 細(xì)菌群落變化

2.4.1 細(xì)菌α-多樣性

采用16S rRNA Illumina Hiseq測序，從27 個樣品中共獲得1130829 條優(yōu)化序列，每樣平均長度為41882，有效序列百分比達(dá)75%以上，表明樣本的有效序列滿足后續(xù)微生物多樣性分析要求。OTU分類表明它們分屬于21 個門、50 個綱、110 個目、216 個科、411 個屬和615 個種。根據(jù)97%相似度水平的OTU信息，通過Sobs、Chao1、Shannon、Ace指數(shù)和Simpson指數(shù)等對樣品的細(xì)菌α-多樣性進(jìn)行評估，結(jié)果見表2，各個樣品的Coverage指數(shù)在99.66～99.82之間，表明樣品基因序列檢出數(shù)據(jù)可靠；各樣品的細(xì)菌α-多樣性指數(shù)組間差異不明顯，即在冷藏的0～38 d內(nèi)細(xì)菌群落變化不明顯。進(jìn)一步對各樣品的α-多樣性指數(shù)比較，發(fā)現(xiàn)隨著冷藏時(shí)間的延長，各樣本中的Sobs（OTU數(shù)目）、Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)呈下降趨勢，且從冷藏15 d后下降明顯，說明冷藏前期鮮印度塊菌細(xì)菌多樣性比冷藏后期更豐富。冷藏15 d后的樣本同冷藏30 d相比，各指數(shù)均有一定幅度的變化，根據(jù)各指數(shù)的變化特點(diǎn)，可將冷藏過程區(qū)分為冷藏前期（0～15 d）、冷藏中期（15～30 d）、冷藏后期（30～38 d），各時(shí)期之間細(xì)菌α-多樣性指數(shù)變化較明顯，這同感官評估獲得的一級新鮮度A、二級新鮮B和腐敗C 3 個階段相印證。

表2 鮮印度塊菌不同冷藏時(shí)間細(xì)菌α-多樣性指數(shù)Table 2 Alpha diversity indices of bacteria communities in fresh Tuber indium during cold storage

2.4.2 細(xì)菌群落變化

鮮印度塊菌冷藏期間細(xì)菌群落在門分類水平上相對豐度變化見圖5A，從各樣本中檢出的主要菌門有變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）和疣微菌門（Verrucomicrobia）。絕對優(yōu)勢菌門為Proteobacteria，相對豐度在76.28%～81.48%之間，從0 d的78.89%緩慢增加到30 d的81.48%，38 d時(shí)下降為80.98%；其次為Bacteroidetes，相對豐度在7.21%～19.78%之間，從0 d的10.86%緩慢增加到15 d的19.78%，38 d時(shí)下降為7.32%；Actinobacteria、Firmicutes和Verrucomicrobia的相對豐度在0.57%～7.41%之間，Actinobacteria從0 d的4.27%下降到15 d的2.13%，38 d時(shí)上升到7.41%；Firmicutes和Verrucomicrobia在冷藏期間變化不明顯；其他菌門相對豐度均小于1%?？傮w上，門水平上的Proteobacteria、Bacteroidetes、Actinobacteria、Firmicutes和Verrucomicrobia是鮮印度塊菌冷藏中的優(yōu)勢菌門，它們同冷藏期鮮印度塊菌品質(zhì)密切相關(guān)，這和其他研究結(jié)果[30-31]基本一致。

為細(xì)化研究鮮印度塊菌不同樣品中細(xì)菌群落差異，進(jìn)一步在屬水平上分析鮮印度塊菌冷藏過程中細(xì)菌群落多樣性，結(jié)果如圖5B所示，在冷藏的0～15 d內(nèi)相對豐度最高的是慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium），相對豐度在18.72%～23.19%之間，從0 d的22.36%降到15 d的18.72%，25 d時(shí)上升到23.19%，而后保持穩(wěn)定；其次是假單胞菌屬（Pseudomonas），相對豐度分別從0 d的4.23%開始一直上升，在30 d時(shí)達(dá)到最高的24.02%，而后保持穩(wěn)定；根瘤菌屬（Rhizobium）從0 d的8.97%下降到25 d時(shí)的7.00%，在38 d時(shí)上升為7.87%；劍菌屬（Ensifer）、貪食菌屬（Variovorax）、Dyadobacter和地桿菌屬（Pedobacter）在0 d時(shí)相對豐度分別為3.10%、4.25%、1.57%和1.47%，在15 d時(shí)達(dá)到最高（6.81%，6.55%、5.47%和6.06%），此后一直下降，在38 d時(shí)分別為4.89%，3.65%、0.66%和2.98%；鞘氨醇桿菌屬（Chitinophaga）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、沙雷氏菌屬（Serratia）、紫色桿菌屬（Janthinobacterium）以及叢毛單胞菌屬（Comamonas）這些菌屬在冷藏的0～38 d間相對豐度為1%～2%；另外，包括壤霉菌屬（Agromyces）、博斯氏菌屬（Bosea）、假黃色單胞菌屬（Pseudoxanthomonas）在內(nèi)的6 個菌屬隨著冷藏時(shí)間的延長，其相對豐度逐漸降低，到20 d消失；其余屬相對豐度均小于1%。

圖5 樣本中細(xì)菌群落在門（A）和屬（B）水平上相對豐度分布Fig.5 Relative abundance of bacterial communities at phylum (A) and genus (B) level

2.5 相關(guān)性分析

相對豐度前10的細(xì)菌群落與各樣本營養(yǎng)組分、典型性揮發(fā)性物質(zhì)含量的相關(guān)性分析見圖6，塊菌冷藏過程中各樣本分布情況為A階段樣本在0、8 d和15 d均分離，B階段各樣本在20 d和25 d重合但與30 d樣本分離，而C階段所有樣本在3 個時(shí)間點(diǎn)幾乎重合，這表明冷藏的A階段塊菌中細(xì)菌多樣性更高，到了冷藏的B和C階段細(xì)菌組成較為單一[32]。營養(yǎng)組分變化與細(xì)菌群落的PCA結(jié)果見圖6A，樣品總糖含量對細(xì)菌群落影響較大，其次是總蛋白含量和粗纖維含量，樣品質(zhì)量損失率影響最小；相關(guān)性方面，A階段的總糖、總蛋白和粗纖維含量與Bosea、Janthinobacterium、Pedobacter、Dyadobacter、Variovorax、Bradyrhizobium、Ensifer與Rhizobium相對豐度呈正相關(guān)，Pseudomonas相對豐度與各樣本營養(yǎng)組分含量呈負(fù)相關(guān)；B和C階段時(shí)，Pseudomonas和Serratia相對豐度同各樣本質(zhì)量損失率呈正相關(guān)。揮發(fā)性芳香物質(zhì)變化與細(xì)菌群落的PCA結(jié)果見圖6B，樣品揮發(fā)性芳香物質(zhì)同細(xì)菌群落的相關(guān)性主要集中在冷藏的A階段，這期間1-辛烯-3-醇、正戊酸正戊酯對細(xì)菌群落影響較大，其次是乙酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、2-辛酮、1-辛烯-3-酮、己醛、正己醇；上述所有芳香物質(zhì)含量與Bradyrhizobium、Rhizobium、Bosea、Variovorax、Dyadobacter、Janthinobacterium、Pedobacter相對豐度均呈正相關(guān)，其中1-辛烯-3-醇、正戊酸正戊酯含量分別與Rhizobium、Bosea相對豐度有正相關(guān)性；Ensifer、Pseudomonas和Serratia相對豐度與所有揮發(fā)性芳香物質(zhì)含量呈負(fù)相關(guān)。揮發(fā)性異味物質(zhì)變化與細(xì)菌群落的PCA結(jié)果見圖6C，樣品揮發(fā)性異味物質(zhì)同細(xì)菌群落的相關(guān)性主要集中在冷藏的C階段，其中吡啶、二甲醚、3-甲基丁酸、己酸、庚醛、巴豆醇、3-甲硫基丙醇以及3-甲基-1-丁醇含量同Ensifer、Pseudomonas、Serratia相對豐度呈正相關(guān)，而與Bradyrhizobium、Rhizobium、Bosea、Variovorax、Dyadobacter、Janthinobacterium和Pedobacter相對豐度呈負(fù)相關(guān)。冗余分析（redundancy analysis，RDA）結(jié)果印證了鮮印度塊菌冷藏期間所有營養(yǎng)組分含量、揮發(fā)性芳香物質(zhì)含量的下降和異味物質(zhì)含量的上升都與細(xì)菌群落存在較大的相關(guān)性，而且不同揮發(fā)性物質(zhì)在不同冷藏時(shí)期關(guān)聯(lián)的細(xì)菌群落不同，這也反映了不同冷藏期樣品中細(xì)菌群落的差異性。

圖6 塊菌冷藏過程中營養(yǎng)組分（A）、芳香（B）和異味物質(zhì)（C）變化與細(xì)菌群落屬水平冗余分析結(jié)果Fig.6 Redundancy analysis of nutrition components (A),aroma compounds (B) and odor compounds (C) versus bacterial communities at genus level in fresh Tuber indium during cold storage

3 結(jié)論

通過對75%食用酒精速泡、真空包裝、4 ℃冷藏期9 個時(shí)間點(diǎn)共27 個鮮印度塊菌樣品的感官評估，預(yù)測出其貨架期，并對冷藏期樣品的營養(yǎng)組分、揮發(fā)性物質(zhì)和細(xì)菌群落變化及相關(guān)性進(jìn)行分析，主要結(jié)論如下：1）預(yù)測得到酒精速泡處理的鮮印度塊菌貨架期為30 d；2）在0～38 d的冷藏期內(nèi)營養(yǎng)組分總體變化規(guī)律為總糖相對含量由38.9%下降到30.9%，總蛋白相對含量由23.3%下降到17.1%，粗纖維相對含量由43.9%下降到36.8%，質(zhì)量損失率從0 d的2.55%升到38 d的6.95%；3）冷藏期揮發(fā)性芳香物質(zhì)從0 d的38 種減少到15 d的17 種，到38 d時(shí)僅有7 種存在；揮發(fā)性異味物質(zhì)從塊菌冷藏15 d的1 種持續(xù)增加，38 d時(shí)增加到24 種；4）細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化和相關(guān)性分析表明，鮮印度塊菌在冷藏過程中的絕對優(yōu)勢菌門為Proteobacteria、Bacteroidetes、Actinobacteria、Firmicutes和Verrucomicrobia。基于屬水平的RDA結(jié)果表明，在A階段，營養(yǎng)組分（總糖、總蛋白和粗纖維）和特征性揮發(fā)芳香物質(zhì)（1-辛烯-3-醇、正戊酸正戊酯、乙酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、2-辛酮、1-辛烯-3-酮、己醛以及正己醇）含量變化與Bradyrhizobium、Rhizobium、Bosea、Variovorax、Dyadobacter、Janthinobacterium以及Pedobacter相對豐度呈正相關(guān)，其中總蛋白、1-辛烯-3-醇、正戊酸正戊酯含量與Bosea相對豐度呈正相關(guān)，Pseudomonas和Serratia相對豐度同質(zhì)量損失率在25 d后呈正相關(guān)；在冷藏的30～38 d，吡啶、二甲醚、3-甲基丁酸、己酸、庚醛、巴豆醇、3-甲硫基丙醇以及3-甲基-1-丁醇含量同Ensifer、Pseudomonas、Serratia相對豐度呈正相關(guān)。綜合分析表明鮮印度塊菌營養(yǎng)組分、揮發(fā)性芳香物質(zhì)和異味物質(zhì)在冷藏期間的不同階段發(fā)生變化，這種變化與特定的細(xì)菌群落密切相關(guān)。該結(jié)果可為進(jìn)一步深入研究鮮印度塊菌腐敗機(jī)制和貯藏保鮮新技術(shù)提供參考。