體外診斷的利器：化學發(fā)光免疫技術

蘇彥妮，呂弋，張立春

四川大學化學學院，成都 610064

2019年底以來，新冠疫情的持續(xù)蔓延徹底改變了人們原有的生活，世界格局、外交貿易、經濟民生均受到了嚴重沖擊。對新冠肺炎患者的快速確診能夠控制疫情的擴散，是戰(zhàn)“疫”的重點，所利用的工具便是“體外診斷(In vitro diagnosis，IVD)”技術。“體外診斷”具體是通過對人體的血液、體液及組織等樣本進行檢測而獲取臨床診斷信息，從而幫助判斷疾病或機體功能的產品和服務[1]。體外診斷在疾病的篩查、診斷和治后檢測的過程中具有重要的作用，被喻為醫(yī)生的“眼睛”。近年來，作為免疫診斷市場的主流技術之一的化學發(fā)光免疫分析法在我國臨床上不斷普及，其市場規(guī)?？焖僭鲩L，促使一系列的體外檢測企業(yè)的建立、成熟。化學發(fā)光免疫分析技術究竟有什么優(yōu)勢，它的原理以及未來的發(fā)展趨勢是怎么樣的呢？

1 體外診斷技術介紹

根據(jù)檢測原理和方法，體外診斷可主要分為：生化診斷、分子診斷、微生物診斷和免疫診斷[2]。

分子診斷是以分子生物學方法為基礎，對遺傳物質的結構或表達水平進行檢測的技術[2]。如核酸檢測利用的就是分子診斷方法，將病毒的RNA序列通過逆轉錄酶反轉錄為DNA并進行擴增，利用特異性Taqman探針對擴增得到的DNA“打上標記”，與靶標序列雜交時會產生熒光信號并被記錄下來進行判斷(圖1)[3]。臨床上，分子診斷還被應用于腫瘤早篩，針對明確的腫瘤進行相關標志物或基因檢測可對腫瘤情況、病因、治療效果、預后等進行評估。

圖1 RT-PCR檢測原理(Taqman探針法) [3]

免疫診斷是我國體外診斷領域中規(guī)模最大、市場上產品最多、發(fā)展速度不斷加快的領域之一。從熒光免疫分析(fluorescene immunoassay，F(xiàn)IA)[4]，放射免疫分析(radio immunoassay，RIA)[5]，免疫膠體金[6]，酶免疫分析(enzyme immunoassay，EIA)[7]到化學發(fā)光免疫分析(chemiluminescence immunoassay，CLIA)[8]，免疫診斷領域不斷發(fā)展?；瘜W發(fā)光免疫分析方法相較于其他的免疫診斷技術不必使用放射性元素來標記，同時具有更高的穩(wěn)定性，與其他技術的結合也給化學發(fā)光免疫分析技術的發(fā)展帶來新的契機。其在食品、環(huán)境等領域都有使用，但在臨床上我國從20世紀90年代才得到應用，而在歐美等國家，化學發(fā)光免疫技術已經在臨床項目中得到普及，自動化儀器的生產制造已進入成熟期。

微生物診斷是指利用病人的痰、尿、血液、穿刺液及創(chuàng)傷口等處的原液來擴大培養(yǎng)，最終確定微生物的種類和濃度，從而判斷病人的致病機理的方法[9]。臨床上最常見的微生物診斷就是尿常規(guī)檢測和大便常規(guī)檢測，可以判斷出體內的炎癥情況。

生化檢測是指通過基于生物化學反應，對人體內的大分子如蛋白質、糖類、脂肪，小分子如無機元素等的體外診斷方法[2]。臨床上可以通過生化診斷實現(xiàn)對肝功能、腎功能、血糖、血脂等的檢查。

2 化學發(fā)光免疫分析的原理和分類

化學發(fā)光免疫分析結合了化學發(fā)光反應和免疫學的特點，通過將發(fā)光物質或酶標記在抗原或抗體上，抗原或抗體與待測物質發(fā)生特異性結合，隨后加入氧化劑、化學發(fā)光底物或是電壓的激發(fā)，通過氧化劑氧化發(fā)光物質，酶催化發(fā)光底物或是發(fā)光物質在電壓的激發(fā)下形成高能的激發(fā)態(tài)，由于激發(fā)態(tài)不穩(wěn)定，再回到基態(tài)過程中會以光的形式釋放出能量，同時由于待測物濃度與發(fā)光強度在一定條件下呈線性定量關系，因此借助儀器檢測發(fā)光的強度就可以確定待測物的含量[10]。以測定人絨毛膜促性腺激素(HCG)為例(圖2)，待測物HCG首先與酶標記的抗體以及發(fā)光標記物標記的抗體反應，形成雙抗體夾心復合物，隨后再加入與含有與發(fā)光標記物結合的磁珠，通過磁鐵將復合物聚集，最后加入發(fā)光底物產生光信號進行定量[11]。

圖2 人絨毛膜促性腺激素化學發(fā)光測定原理

根據(jù)標記物的不同，化學發(fā)光可大致分為：利用吖啶酯、魯米諾等進行標記的直接化學發(fā)光免疫分析(Chemiluminescence immunoassay，CLIA)、利用如辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶等標記的酶促化學發(fā)光免疫分析(Chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA)和利用三聯(lián)吡啶釕等標記的電化學發(fā)光免疫分析(Electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA)。直接化學發(fā)光免疫分析發(fā)光過程十分快速，在幾秒鐘之內就可以完成，而酶在一般情況下穩(wěn)定性較好，如辣根過氧化物酶處于室溫下可以在幾周內保持穩(wěn)定，且具有較高的特異性，發(fā)光時間較直接化學發(fā)光法更長，可以持續(xù)幾分鐘到十幾分鐘，電化學發(fā)光法處于電解池介質中反應因而可以反復使用。利用不同類別的化學發(fā)光法就可以滿足分析所需要的不同要求，如快速檢測、穩(wěn)定性好、靈敏度高以及可循環(huán)利用，相較于分子診斷、生化診斷和微生物診斷具有極大的靈活性。

3 化學發(fā)光免疫分析的應用

化學發(fā)光免疫分析法首次被提出到現(xiàn)在已發(fā)展了40余年，其檢測的體系不斷成熟，所能檢測的標志物數(shù)量不斷增長，主要集中在醫(yī)學、食品衛(wèi)生、環(huán)境檢測領域。

3.1 疾病標志物檢測

對腫瘤標志物的檢測在腫瘤的早發(fā)現(xiàn)、早治療和治后檢測中都具有重要的作用。利用化學發(fā)光法可以實現(xiàn)對于腫瘤標志物如甲胎蛋白(AFP)[12]、癌胚抗原(CEA)[13]、糖類抗原(CA125、CA153、CA19-9)[14,15]、人附睪蛋白(HE4)[16]、磷狀細胞癌相關抗原(SCC)[17]、神經元特異性烯醇化酶(NSE)[18]、高爾基體蛋白(GP73)[19]等的檢測。若標志物在人體內的含量升高，可以初步判斷是否患有肝癌、胃腸道癌癥、卵巢癌、子宮癌等癌癥或是患有相關癌癥的傾向。同時，在術后對這些指標進行檢測還可以判斷恢復情況。如正常人血清中利用化學發(fā)光法檢測到的CA153參考值上限為35 U?mL?1[20]，若高于該值，那么就判斷患者可能患有乳腺癌或是一些其他的惡性腫瘤，需要進一步的檢測來明確診斷。而乳腺癌患者中若體內CA153的值相比前次診斷升高，那么就可能顯示著病情的惡化，若無變化則意味著病情穩(wěn)定。

除了應用于腫瘤標志物檢測外，化學發(fā)光免疫分析法還被應用于各類疾病的篩查。如對各類激素及其代謝產物包括人絨毛膜促性激素(total hCG)[21]、甲狀腺素(total T4)[22]、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌紅蛋白(Mb)[23]、甲型肝炎病毒抗體IgM (抗-HAVIgM)[24]等相關的聯(lián)合檢測，可以判斷關于甲狀腺、肝臟、腎臟、心血管、血液等方面疾病的患病可能性。在產前篩查中，應用化學發(fā)光法對游離-β-人絨毛膜促性腺激素(free β-hCG)、抑制素A (INH A)和胎盤生長因子(PLGF)等進行檢測，可以對胎兒是否患有唐氏綜合癥和神經管缺陷疾病進行初步判斷[25]。通過對轉鐵蛋白(TRF)、鐵蛋白(FER)、可溶性轉鐵蛋白受體(sTfR)、葉酸(FA)和維生素B12(VB12)等進行檢測則可以進行貧血的診斷以及原因判斷[26]。對皮質醇(Cortisol)、促腎上腺皮質激素(ACTH)、生長激素(GH)和胰島素樣生長因子結合蛋白-3 (IGFBP-3)等進行檢測可以判斷是否有皮質醇增多癥、腎上腺功能不全和多囊卵巢綜合征等[27]。常見的高血壓五項、TORCH項目、EB病毒六項和乙肝病毒五項均是利用化學發(fā)光免疫分析法進行檢測，其在臨床上還具有廣闊的應用空間。

結合不同的技術，針對各種標志物的化學發(fā)光分析方法也在不斷的發(fā)展，如Huang等[28]利用CdTe量子點標記與磁性納米顆粒結合的抗體，通過電化學發(fā)光免疫測定方法，實現(xiàn)了對于甲胎蛋白的高效檢測，在1.0–200 ng?mL?1內都具有線性，檢測限為0.32 ng?mL?1，同時還具有檢測其他標志物的潛力。Chen等[29]設計了一種利用免疫傳感器陣列的成像方法，實現(xiàn)了對于甲胎蛋白、糖類抗原和癌胚抗原的測定，并用于對于肝癌、乳腺癌和卵巢癌患者的篩查。市場上基于化學發(fā)光免疫方法所構建的試劑產品不斷出現(xiàn)，如Wang等[30]利用直接化學發(fā)光免疫分析法開發(fā)了一款檢測降鈣素的新型試劑盒，具有高靈敏度。

3.2 食品和環(huán)境安全檢測

農藥的濫用、藥物的隨意丟棄、污染物的任意排放以及食物腐敗等問題會對人類健康造成影響，因此實現(xiàn)對這些影響物質的檢測可以在一定程度上加強人們對食品和環(huán)境安全的重視程度。目前，化學發(fā)光免疫分析法已經被應用在針對農產品中福美雙農藥[31]、甲基對硫磷和吡蟲啉農藥[32]殘留的檢測，對食品中沙門菌和李斯特菌的檢測[33]，以及對人體內分泌有干擾的外源性雌二醇的檢測[34]等。如Wang等[35]利用魯米諾還原的金納米粒子，開發(fā)了針對芬戊酸鹽的免疫層析化學發(fā)光檢測方法，具有分析效率高、成本低的特點。Liu等[36]設計了一種新型且靈敏的增強化學發(fā)光酶聯(lián)免疫方法用于測定農業(yè)樣品中的吡蟲胺和噻蟲啉，結果與高效液相色譜方法一致。Juachon等[37]利用直接化學發(fā)光方法的猝滅效應來檢測甲胺磷殘留，甲胺磷濃度與化學發(fā)光系統(tǒng)的光輸出成反比，線性范圍為100–10000 μg?mL?1。Pang等[38]利用電化學化學發(fā)光免疫分析法監(jiān)測蜂產品中四環(huán)素類和土霉素抗生素殘留，檢出限分別為4.0 ng?mL?1和3.8 ng?mL?1，靈敏度高于絕大多數(shù)方法。

4 化學發(fā)光免疫分析技術發(fā)展趨勢

21世紀以來，各種新標記物和標記方法，和其他技術的聯(lián)用以及各種自動化、微型化的儀器不斷被開發(fā)出來，化學發(fā)光免疫分析也朝著高靈敏度、多組分聯(lián)合檢測和自動化檢測方向發(fā)展[31]。

4.1 高靈敏度檢測

實際樣品的豐度低，在檢測過程中也存在著信噪比低的問題，同時如果檢測方法穩(wěn)定性不好的話也會對結果造成影響?；瘜W發(fā)光免疫測定中，使用新發(fā)光試劑、增強劑，構建新的發(fā)光體系以及優(yōu)化反應時間、選擇合適的緩沖液等方法，可以大大提高檢測范圍和檢出限及穩(wěn)定性[39,40]。得益于納米技術的發(fā)展，各種納米粒子及結構也被引入化學發(fā)光體系中，如金納米粒子、銀納米粒子、鉑納米粒子等，由于它們具有高比表面積及電子密度，對于化學發(fā)光體系有很強的催化作用[41]。作為最廣泛使用的金屬納米粒子，金納米粒子可以作為模擬酶以及酶或大分子的載體。如Li等[42]以辣根過氧化物酶功能化的金納米顆粒作為抗體標記物，利用三明治標記法，實現(xiàn)對人免疫紅蛋白的信號放大檢測，比原來工作中沒有利用金納米顆粒的方法信號提高了7.4倍，基本原理如圖3所示。He等[43]則利用魯米諾官能化的銀納米粒子，結合主成分分析，實現(xiàn)對于五種有機磷酸鹽和氨基甲酸酯農藥的區(qū)分，準確率為95%。磁性納米粒子則可以作為免疫反應的載體，通過磁場將免疫復合物與原始溶液分離，大大縮短了檢測的時間，提高了檢測的靈敏度[44,45]。隨著納米技術領域的不斷發(fā)展，利用納米材料輔助的化學發(fā)光技術未來仍然具有廣闊的發(fā)展空間。

圖3 用于人血紅蛋白測定的三明治式化學發(fā)光免疫分析原理

在免疫反應中，抗體是免疫測定性能的關鍵組成部分。隨著基因工程的發(fā)展，通過基因重組技術已經獲得了多種抗體片段或多功能抗體。如Ouyang等[46]利用雜交瘤策略設計了一種新型雙特異性單克隆抗體BsMcAb，實現(xiàn)對于甲基對硫磷和吡蟲啉的同時檢測，在1.0–500 ng?mL?1有線性關系，檢測限為0.33 ng?mL?1。隨著基因工程抗體研究的不斷深入，相信會為化學發(fā)光免疫檢測帶來新的應用[47,48]。

4.2 多組分檢測

相比于單個組分的分析，對多組分進行聯(lián)合分析可以獲得更多的信息，得出的結論也更加具有說服力。若對多組分中的每種組分都進行單個分析，存在著耗時長、試劑消耗多的問題。通過結合空間分辨技術與陣列檢測器的同時分析方法則可以實現(xiàn)對于高通量樣品的快速檢測，而且試劑消耗少[49,50]。如Fu等[51]設計了一個雙通道流通池，實現(xiàn)了對于CA153、CA125、CA199和CEA四種腫瘤標志物的檢測，移動光柵就可以獲得被光電倍增管收集到的不同通道的信號(圖4)。微流控芯片是實現(xiàn)多組分分析的有利工具。通過材料基質上刻蝕或壓模便可形成所需要的微通道來實現(xiàn)所需的功能[52]。Hu等[53]設計了一種微流控芯片用于檢測睪丸激素和C反應蛋白，芯片的頂部為試劑儲存區(qū)，中部為抗原抗體儲存區(qū)，底部為硅樹脂基板。不同的試劑預先裝載在儲存區(qū)并通過程序控制的閥門避免進入微通道，當樣品引入后預加載到微流體裝置的單個儲層中，并在關閉狀態(tài)下通過片上機械閥從微通道中隔離。將樣品引入后，閥門開啟，通過發(fā)光儀可實現(xiàn)自動化檢測。

圖4 空間分辨化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)[51]

毛細管電泳(CE)和高效液相色譜(HPLC)具有極強的分離能力，可應用在化學發(fā)光免疫分析方法的前處理階段[39]。除此之外，層析技術也實現(xiàn)了與化學發(fā)光技術的耦合。免疫層析技術(圖5)通過樣品在基質上的流動可以實現(xiàn)復雜組分中不同組分的分離以及反應產物與未反應產物的分離，不需要在分析過程中沉淀或是洗滌復合物，具有操作簡便、簡單經濟的特點[54]。如Gao等[55]設計了免疫層析試紙條，通過記錄在硝酸纖維素膜的兩個測試區(qū)捕獲的探針的化學信號，實現(xiàn)對于萊克多巴胺和沙丁胺醇的檢測，基本原理如圖5所示。

圖5 結合免疫層析法對萊克多巴胺和沙丁胺醇的酶促化學發(fā)光檢測原理

4.3 自動化檢測

傳統(tǒng)免疫分析需要將免疫物質人工混合導致反應效率降低，會耗費較多的時間。流動注射分析(flow injection analysis，F(xiàn)IA)由于不需要人工來進行操作，能夠自動化地進行分析，可以減少誤差，縮短反應的時間，已經被利用在基于化學發(fā)光方法的免疫測定中[56]。通過加快反應動力學如利用容易控制的電場來加快免疫物質的傳質速率或是采用電磁攪拌等常用的方法同樣可以減少分析時間，并且由于這些方法容易構建，可以大大提升化學發(fā)光免疫分析的自動化水平[33,57]。隨著技術的發(fā)展，結合各類輔助方法，具有各類不同功能的全自動免疫發(fā)光儀不斷被開發(fā)出來并應用在臨床檢測中。然而，目前自動化的化學發(fā)光免疫分析儀仍然由國外公司占主導地位，以羅氏(Roche)、貝克曼(Beckman)等公司產品為主[58,59]，國產化學發(fā)光免疫分析儀距離替代進口產品還有很大的進步空間。隨著化學發(fā)光免疫分析法在我國臨床上的普及，市場規(guī)模仍在不斷增長，幾大主要頭部企業(yè)如亞輝龍(YHLO)、邁克生物(maccura)等的化學發(fā)光診斷設備及試劑已在檢測結果和檢測速度等方面接近進口產品[60,61]。相信隨著國家一系列自主創(chuàng)新政策的落實以及對技術創(chuàng)新研發(fā)的推動，國產自動化儀器與國外產品之間的差距會逐漸縮小。

5 結語

化學發(fā)光免疫分析法作為免疫診斷市場的主流技術之一，具有高特異性和靈敏度的特點，在臨床和食品、環(huán)境領域得到了廣泛的應用。通過結合各種新標記物和標記方法，以及和其他技術的聯(lián)用，能夠大大提高化學發(fā)光免疫分析的檢測能力?；瘜W發(fā)光分析儀器的微型化、自動化、集成化和便攜化，可以擴大化學發(fā)光免疫分析法的應用范圍，具有很大的發(fā)展前景。相信隨著化學發(fā)光分析法在臨床上應用的普及以及我國企業(yè)的加速發(fā)展，必將縮小與國際上的差距，會有更多具有獨立自主知識產權的國產商品出現(xiàn)在市場中。