基于蛋白質(zhì)半胱氨酸的活性蛋白表達(dá)譜分析

姜中堯，牛雅新，王楠，陳蓁蓁，唐波

山東師范大學(xué)化學(xué)化工與材料科學(xué)學(xué)院，分子與納米探針教育部重點實驗室，濟南 250014

1 活性蛋白表達(dá)譜分析(ABPP)

蛋白質(zhì)作為細(xì)胞、組織的重要成分，是生命過程中生理功能的重要執(zhí)行者和生命現(xiàn)象的直接體現(xiàn)者，對蛋白質(zhì)功能活性的研究將有助于闡明其對生理或病理過程的調(diào)控機制。蛋白質(zhì)組學(xué)能夠分析獲取生命過程中成千上萬種蛋白功能活性的信息，可以在大規(guī)模水平上鑒定蛋白質(zhì)的表達(dá)水平、修飾水平、相互作用等。在后基因組時代，如何準(zhǔn)確、快速地解析復(fù)雜生物體系內(nèi)蛋白質(zhì)的功能活性，揭示蛋白質(zhì)參與生命活動的方式，了解這些功能活性的變化對生命過程產(chǎn)生的影響，已經(jīng)成為蛋白質(zhì)組學(xué)亟需解決的一個重要科學(xué)問題[1]。

半胱氨酸(Cysteine，Cys)是存在于多數(shù)蛋白質(zhì)中頻次較低的氨基酸(1%–2%)，但由于其側(cè)鏈巰基的化學(xué)活潑性使其展現(xiàn)出較強的內(nèi)在活性，也成為多種蛋白質(zhì)的功能活性位點[2]。蛋白質(zhì)半胱氨酸殘基作為細(xì)胞內(nèi)的還原性物質(zhì)和與小分子介質(zhì)作用的重要主體，對于維持和調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的氧化還原內(nèi)環(huán)境起著重要作用[3]。它們參與調(diào)控細(xì)胞識別、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種生理過程，并與生物體內(nèi)還原性物質(zhì)變化的相關(guān)疾病有著密切的聯(lián)系[4]。此外，蛋白質(zhì)半胱氨酸上的巰基對細(xì)胞內(nèi)局部環(huán)境的變化很敏感，可以發(fā)生多種翻譯后修飾的類型[5]，如硫巰化(S-sulfhydration，―SSH)、亞硝基化(S-nitrosylation，―SNO)、次磺酸化(S-sulfenylation，―SOH)、亞磺酸化(S-sulfinylation，―SO2H)、棕櫚?；?S-palmitoylation)、異戊二烯化(S-prenylation)等(圖1)。這些翻譯后修飾能夠快速、動態(tài)地調(diào)控蛋白質(zhì)的構(gòu)型、活性，拓展生物體內(nèi)蛋白質(zhì)的功能多樣性，并能夠影響到人類許多重要疾病的發(fā)生發(fā)展。因此，對蛋白質(zhì)半胱氨酸及其翻譯后修飾的研究具有十分重要的生物學(xué)意義，一直是持續(xù)不斷的科研熱點。

圖1 蛋白質(zhì)半胱氨酸及其翻譯后修飾類型

近年來，質(zhì)譜技術(shù)的迅速發(fā)展，為蛋白質(zhì)研究提供了高通量、高靈敏和高分辨的分析平臺，并已成為研究蛋白質(zhì)組學(xué)最具突破性、應(yīng)用最廣泛的技術(shù)手段之一。利用不同化學(xué)探針對蛋白組中的活性位點進(jìn)行標(biāo)記，結(jié)合定量化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)的活性蛋白表達(dá)譜分析方法(ABPP)應(yīng)運而生[6]。該方法致力于在復(fù)雜的生命體系中系統(tǒng)地鑒定某些具有特定功能的蛋白質(zhì)分子(圖2)，并且這些功能蛋白質(zhì)的豐度往往不高，其他方法難以檢測。ABPP方法利用化學(xué)活性探針共價連接某些蛋白質(zhì)中的氨基酸位點，進(jìn)一步利用探針中的報告基團進(jìn)行富集，用于凝膠電泳分析或質(zhì)譜分析鑒定被化學(xué)探針標(biāo)記的蛋白組分以及潛在功能位點，進(jìn)而揭示它們的分子功能[7]。

圖2 ABPP探針的結(jié)構(gòu)以及用于蛋白質(zhì)凝膠電泳分析與質(zhì)譜檢測

近幾年，針對蛋白質(zhì)半胱氨酸及其翻譯后修飾的ABPP方法的研究層出不窮。目前已有多種不同類型的化學(xué)探針被開發(fā)出來，用于捕獲蛋白質(zhì)半胱氨酸及其翻譯后修飾的活性位點；同時研究人員也通過這些方法發(fā)現(xiàn)了一些蛋白質(zhì)未被報道過的功能和翻譯后修飾類型，并對這些蛋白在體內(nèi)發(fā)揮的作用有了更加深入的認(rèn)識。本文將對近年來開展的基于蛋白質(zhì)半胱氨酸及其翻譯后修飾的活性蛋白表達(dá)譜分析方法的進(jìn)展情況進(jìn)行綜述，詳細(xì)探討其作用原理、優(yōu)缺點和應(yīng)用范圍，并探討ABPP方法發(fā)展的走向及其未來可能的拓展應(yīng)用。

2 針對蛋白質(zhì)半胱氨酸的ABPP方法

2.1 IA-alkyne探針標(biāo)記蛋白質(zhì)半胱氨酸的isoTOP-ABPP

碘乙酰胺的炔基衍生化探針(IA-alkyne)是一種在ABPP中應(yīng)用十分廣泛的親電小分子探針，其反應(yīng)基團主要與蛋白質(zhì)半胱氨酸殘基中的巰基共價交聯(lián)，標(biāo)簽基團通過點擊反應(yīng)偶聯(lián)熒光團或者生物素，進(jìn)而對靶向的蛋白質(zhì)進(jìn)行可視化檢測與富集。同位素標(biāo)記串聯(lián)正交水解酶-活性蛋白表達(dá)譜方法(isotopic tandem orthogonal proteolysis-ABPP，isoTOP-ABPP)是目前主要用于活性蛋白表達(dá)譜分析的定量方法，是一種在復(fù)雜的生物系統(tǒng)中直接探究蛋白質(zhì)活性的開創(chuàng)性技術(shù)(圖3a)[8]。isoTOP-ABPP方法使用IA-alkyne探針標(biāo)記蛋白質(zhì)半胱氨酸進(jìn)行定量化學(xué)蛋白組學(xué)分析主要包括以下步驟：(1) 用IA-alkyne處理細(xì)胞裂解物以標(biāo)記活性半胱氨酸(圖3b)；(2) 使用銅催化的疊氮-炔烴環(huán)加成反應(yīng)(Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition，CuAAC)將對照和實驗樣品中IA-alkyne標(biāo)記的半胱氨酸蛋白與同位素化的可裂解生物素-疊氮化物標(biāo)簽偶聯(lián)(圖3c)；(3) 在鏈霉親和素珠上富集IA-alkyne標(biāo)記的蛋白，然后進(jìn)行胰酶消化，并進(jìn)行l(wèi)inker切割以釋放IA-alkyne標(biāo)記的肽；(4) 使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(Liquid chromatography tandem-mass spectrometry，LC-MS/MS)分析所得的同位素標(biāo)記的輕、重肽對，以輕重肽段的峰面積比值對兩個樣品的反應(yīng)活性差異進(jìn)行定量。

圖3 isoTOP-ABPP技術(shù)

2010年，Scripps研究所Benjamin F. Cravatt教授課題組利用不同濃度的IA-alkyne探針對生理條件下的蛋白組裂解液進(jìn)行標(biāo)記，通過isoTOP-ABPP方法(圖4)系統(tǒng)地分析了MCF-7等多種人類癌癥細(xì)胞系和小鼠組織的蛋白組內(nèi)半胱氨酸的內(nèi)在反應(yīng)性，并發(fā)現(xiàn)半胱氨酸的內(nèi)在反應(yīng)活性與其功能具有非常明顯的關(guān)聯(lián)性[9]。該方法不僅可以對已知功能蛋白酶催化中心的半胱氨酸的活性進(jìn)行監(jiān)測，還發(fā)掘出一大批內(nèi)在化學(xué)反應(yīng)活性很高、功能尚待研究的半胱氨酸位點?；谥暗难芯炕A(chǔ)，該課題組利用isoTOP-ABPP策略的位點特異性識別和定量能力，開發(fā)了一種競爭性的isoTOP-ABPP策略來鑒定脂質(zhì)衍生親電試劑(lipid-derived electrophiles，LDEs)誘導(dǎo)的半胱氨酸修飾。LDEs能夠共價修飾蛋白質(zhì)中的半胱氨酸，因此能夠與IA-alkyne探針進(jìn)行競爭標(biāo)記。LDEs對蛋白質(zhì)中半胱氨酸的修飾程度最終通過isoTOP-ABPP策略的定量比值表示出來。研究人員通過幾組平行實驗的定量結(jié)果，精確地鑒定到了幾種LDEs修飾的半胱氨酸位點，并揭示出了一些對LDEs具有高反應(yīng)活性的半胱氨酸殘基[10]。此外，該策略還被拓展到鑒定微生物衍生的活性代謝物二肽醛對蛋白組中半胱氨酸的修飾[11]。

圖4 基于isoTOP-ABPP的方法測定蛋白質(zhì)組中半胱氨酸反應(yīng)活性[9]

值得注意的是，競爭性isoTOP-ABPP策略不僅可用于研究代謝產(chǎn)物對蛋白組中半胱氨酸的修飾，而且還可用于研究天然產(chǎn)物或共價藥物所修飾的半胱氨酸[12,13]。例如，Withaferin A是一種已知具有癌癥抗增殖活性的親電性天然產(chǎn)物。Grossman等人評估了Withaferin A的靶向蛋白組的反應(yīng)活性，表明Withaferin A激活了腫瘤抑制酶磷酸酶PP2A[12]。Whitby等人通過isoTOP-ABPP方法研究了用肝毒性藥物如對乙酰氨基酚、曲格列酮、氯氮平和亞硝酸處理后，體內(nèi)產(chǎn)生的反應(yīng)性代謝產(chǎn)物對蛋白質(zhì)組的標(biāo)記[14]。同時該策略也被用來評估小分子片段庫中小分子標(biāo)記半胱氨酸的反應(yīng)活性，并從大量被認(rèn)為不具有成藥性的蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了獨特標(biāo)記位點，如Backus等人使用isoTOP-ABPP方法評估了包含氯乙酰胺和丙烯酰胺等親電基團的52個小分子對蛋白質(zhì)半胱氨酸的反應(yīng)活性[15]。

近些年，隨著生物質(zhì)譜的飛速發(fā)展，研究人員在isoTOP-ABPP的基礎(chǔ)上融合了多種定量方法衍生出多種定量化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)策略用于鑒定蛋白質(zhì)半胱氨酸活性，翻譯后修飾水平和藥物篩選等。如王初課題組結(jié)合穩(wěn)定同位素二甲基化標(biāo)記(stable isotope dimethyl labeling)開發(fā)了rd-TOPABPP策略[16]。楊靖等人利用一種碘乙酰胺類探針I(yè)MP結(jié)合iTRAQ (isobaric tags for relative and absolute quantification)標(biāo)記定量法構(gòu)建了多組分硫醇反應(yīng)譜分析(multiplexed thiol reactivity profiling，MTRP)方法來鑒定一些親電天然產(chǎn)物的蛋白靶標(biāo)[17]。Vinogradova等人利用脫硫生物素-碘乙酰胺探針(iodoacetamide-desthio-biotin，IA-DTB)結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽(Tandem mass tags，TMT)標(biāo)記和三級質(zhì)譜(MS3)定量模式繪制了人類初級T細(xì)胞中易受親電小分子共價修飾的蛋白質(zhì)半胱氨酸圖譜[18]。這些新的定量化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)方法極大地擴展了針對蛋白質(zhì)半胱氨酸的相關(guān)研究。

2.2 其他探針標(biāo)記蛋白質(zhì)半胱氨酸的ABPP

IA-alkyne探針標(biāo)記蛋白質(zhì)半胱氨酸的isoTOP-ABPP分析方法的局限性主要在于對細(xì)胞蛋白組半胱氨酸的覆蓋率較低。由于IA-alkyne探針本身和巰基反應(yīng)類型的限制以及在isoTOP-ABPP策略中所使用的濃度(100 μmol?L?1)較低，導(dǎo)致在每次實驗中只能鑒定到蛋白組內(nèi)的部分半胱氨酸。尤其是對低豐度蛋白質(zhì)中的半胱氨酸殘基的標(biāo)記的覆蓋率也會進(jìn)一步降低，可能會限制isoTOP-ABPP在某些應(yīng)用中的潛在用途。所以，人們又開發(fā)出一系列新的半胱氨酸反應(yīng)活性親電試劑和分析方法來克服這些isoTOP-ABPP的局限性。

與IA-alkyne相比，光籠式溴代甲基酮(CBK)[19]和碘代甲基酮(CIK4)[20]顯示出較低的細(xì)胞毒性，并可通過對空間和時間的控制來分析活細(xì)胞中的半胱氨酸(圖5)。CBK被用來監(jiān)測A431細(xì)胞在表皮生長因子(the epidermal growth factor，EGF)刺激下釋放活性氧時半胱氨酸反應(yīng)性的變化。同時人們還開發(fā)了鹵代乙酰胺親電試劑的替代品，包括芳基鹵化物如對氯硝基苯RB2[21]，和高價碘試劑如乙炔基苯并惡唑啉酮(JW-RF-010) (圖5)[22]。JW-RF-010在水中穩(wěn)定，能夠在生理條件下對半胱氨酸進(jìn)行烷基化，具有較高的化學(xué)選擇性。并且研究人員通過該探針成功地鑒定了姜黃素在HeLa細(xì)胞中的生物靶點，證明了其可作為與IA-alkyne探針標(biāo)記結(jié)果互補的新型蛋白質(zhì)半胱氨酸標(biāo)記探針。近年來，研究人員還開發(fā)出能夠根據(jù)反應(yīng)基團附近取代基的不同來調(diào)諧對蛋白質(zhì)半胱氨酸的標(biāo)記能力的探針。如Brent R. Martin教授課題組嘗試在苯并噻唑上修飾不同的取代基來探究是否能改良其反應(yīng)活性，合成了一系列苯或砜上的取代衍生物。結(jié)果發(fā)現(xiàn)苯環(huán)的吸電子基團能夠使反應(yīng)活性變強，而給電子基團則能夠減弱活性。隨后該課題組還利用兩種脫硫生物素化的探針(BT-desthiobiotin和IA-desthiobiotin)進(jìn)行了HeLa細(xì)胞的活細(xì)胞標(biāo)記，質(zhì)譜檢測結(jié)果顯示兩者標(biāo)記肽段僅有50%重疊，總共可標(biāo)記約5000個獨立的半胱氨酸肽段，且對于Cys也有很強的選擇性[23]。Tokunaga等人利用雙環(huán)丁烷(BCB)的橋頭碳被親核試劑進(jìn)攻時會發(fā)生開環(huán)的性質(zhì)，設(shè)計合成了多種BCB類化合物，并應(yīng)用化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對BCB類型探針的反應(yīng)特異性進(jìn)行了評估。同時還通過對BCB類探針反應(yīng)性的調(diào)節(jié)發(fā)現(xiàn)反應(yīng)性較強的BCB酰胺可以用于半胱氨酸的廣譜標(biāo)記，而較弱的BCB酰胺則適合進(jìn)行共價抑制劑的開發(fā)[24]。近期還有課題組使用馬來酰亞胺激活的巰基反應(yīng)探針(NPM)來探究位點特異性半胱氨酸反應(yīng)性從超過800多個蛋白質(zhì)中獲得了1500多個獨特的半胱氨酸位點的相對定量結(jié)果(圖5)，提出了一種在氧化應(yīng)激反應(yīng)中測定半胱氨酸反應(yīng)性的方法[25]。

圖5 多種標(biāo)記蛋白質(zhì)半胱氨酸的ABPP探針

3 蛋白質(zhì)半胱氨酸翻譯后修飾的ABPP方法

蛋白質(zhì)翻譯后修飾(protein post-translational modifications，PTMs)是指一些基團通過酶或體內(nèi)化學(xué)反應(yīng)的方式被共價引入到蛋白質(zhì)氨基酸側(cè)鏈或末端，它可以改變目標(biāo)蛋白的物理化學(xué)性質(zhì)，并導(dǎo)致結(jié)構(gòu)變化、活性和蛋白間相互作用等，進(jìn)一步促進(jìn)了從基因組水平到蛋白質(zhì)組復(fù)雜性的增加。因此，近些年科研人員開發(fā)了多種化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)的方法來對PTMs進(jìn)行研究[26–28]。蛋白質(zhì)半胱氨酸上的翻譯后修飾主要包括氧化還原依賴的修飾(redox dependent modification)、脂質(zhì)修飾(lipidation)、脂質(zhì)衍生親電分子修飾(LDEs)、其他代謝產(chǎn)物修飾等。其中氧化還原依賴的修飾主要通過兩種途徑實現(xiàn)，一是活性氧(reactive oxygen species，ROS)、活性氮(reactive nitrogen species，RNS)、活性硫(reactive sulfur species，RSS)介導(dǎo)半胱氨酸發(fā)生多種可逆修飾，如次磺酸化、亞磺酸化、亞硝基化、硫巰化等；二是利用復(fù)雜多樣的還原酶系統(tǒng)介導(dǎo)上述翻譯后修飾的還原，進(jìn)而實現(xiàn)對諸多生物學(xué)進(jìn)程與信號通路的精細(xì)調(diào)控[29]。脂質(zhì)修飾主要是在相關(guān)酶的催化下將脂質(zhì)分子轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)半胱氨酸上，如S-棕櫚?；蚐-異戊二烯化等。LDEs等是細(xì)胞代謝和脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，具有很高的生物反應(yīng)活性，能與蛋白質(zhì)半胱氨酸發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)，從而改變蛋白質(zhì)的功能，甚至損傷細(xì)胞機制，如4-羥基壬烯醛(4-hydroxy-2-nonenal，HNE)修飾。除上述三種翻譯后修飾外，在細(xì)胞復(fù)雜的代謝過程中一些代謝產(chǎn)物也可能會與蛋白質(zhì)巰基進(jìn)行作用產(chǎn)生代謝產(chǎn)物修飾，比如衣康酸修飾、富馬酸修飾等。為了對這些種類豐富、形式多樣的蛋白質(zhì)半胱氨酸翻譯后修飾進(jìn)行研究，一系列用于組學(xué)鑒定、機制表征以及功能探究的定量化學(xué)蛋白質(zhì)組技術(shù)相繼被開發(fā)出來。下面分別介紹針對蛋白質(zhì)半胱氨酸翻譯后修飾的生物素置換、競爭標(biāo)記、直接標(biāo)記等不同方式的ABPP方法。

3.1 生物素置換法

蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域以生物素置換法(Biotin-Switch Assay，BSA)對蛋白質(zhì)半胱氨酸翻譯后修飾進(jìn)行檢測的應(yīng)用較為廣泛(圖6a)。其工作流程一般是通過烷基化試劑如甲基硫代磺酸甲酯(S-Methyl Methanethiosulfonate，MMTS)封閉蛋白質(zhì)中的游離半胱氨酸，再用選擇性試劑(如抗壞血酸)還原半胱氨酸翻譯后修飾基團產(chǎn)生新的半胱氨酸，然后用生物素化試劑如Pyridyldisulfide-biotin (Biotin-HPDP)標(biāo)記新產(chǎn)生的半胱氨酸，之后將利用鏈霉親和素-生物素親和純化蛋白質(zhì)，最后胰酶消化并進(jìn)行質(zhì)譜分析，得到修飾蛋白和位點信息。如Snyder, S. H.課題組在檢測半胱氨酸亞硝基化修飾時，先通過MMTS封閉游離半胱氨酸，之后用抗壞血酸還原亞硝基化半胱氨酸，使其還原后，將新形成的半胱氨酸與Biotin-HPDP反應(yīng)，再檢測出發(fā)生亞硝基化修飾的蛋白質(zhì)[30]。再如，硫化氫(H2S)作為信號分子氣體遞質(zhì)，在心血管和神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，蛋白質(zhì)半胱氨酸的過硫化修飾是將H2S信號轉(zhuǎn)化為生物反應(yīng)的機制。Carroll, K. S.報道的檢測半胱氨酸過硫化修飾的研究中，蛋白質(zhì)首先被MMTS烷基化，以封閉游離半胱氨酸，同時保留過硫化物。接著用Biotin-HPDP使過硫化物發(fā)生烷基化反應(yīng)并形成蛋白質(zhì)-生物素復(fù)合物以檢測過硫化修飾[31]。但是這類方法往往操作繁瑣，受多步反應(yīng)的影響，富集效率較低；此外，內(nèi)源性生物素化蛋白等可能會帶來背景干擾，而且富集材料的性質(zhì)也會影響富集效果。

圖6 生物素轉(zhuǎn)換方式(a)和競爭標(biāo)記方式(b)標(biāo)記蛋白質(zhì)的翻譯后修飾

3.2 競爭標(biāo)記方式

蛋白質(zhì)半胱氨酸發(fā)生翻譯后修飾后不會再被標(biāo)記半胱氨酸的化學(xué)探針?biāo)鶚?biāo)記，利用這種特性，可通過與化學(xué)探針“競爭”的方式，來間接反映特定蛋白質(zhì)半胱氨酸位點上的修飾情況(圖6b)。最為經(jīng)典的競爭標(biāo)記方式是之前所介紹的競爭性isoTOP-ABPP策略。例如，富馬酸是一種與遺傳性平滑肌瘤病和腎細(xì)胞癌(hereditary leiomyomatosis and renal cell carcinoma，HLRCC)高度相關(guān)的腫瘤代謝產(chǎn)物，它可以通過邁克爾加成與蛋白質(zhì)中的半胱氨酸共價反應(yīng)。Meier, J. L課題組在富馬酸水合酶(fumarate hydratase，F(xiàn)H)突變的細(xì)胞模型中采用IA-alkyne競爭性isoTOP-ABPP方法，發(fā)現(xiàn)了對FH突變敏感的半胱氨酸[32]。衣康酸被認(rèn)為是一種參與病原體-巨噬細(xì)胞界面的抗炎代謝產(chǎn)物。由于衣康酸弱的親電性，它可以修飾Kelch-like ECH-associated protein 1 (KEAP1)上的半胱氨酸和谷胱甘肽，從而發(fā)揮抗炎作用。但是，人們還尚未對巨噬細(xì)胞中衣康酸修飾的底物進(jìn)行系統(tǒng)分析，這在很大程度上阻礙了對其在免疫反應(yīng)中作用的理解。王初課題組和陳興課題組共同開發(fā)了一種特定的半胱氨酸反應(yīng)性探針3,4,6-O-Ac3ManNAz (1-OH-Az)，并通過競爭性的isoTOP-ABPP策略提供了其蛋白質(zhì)組反應(yīng)性的整體描述[33]。

3.3 直接標(biāo)記方式

前面介紹的兩種檢測方法步驟比較繁瑣，耗時相對較長，最為重要的是這些方法不能更為真實、直接地獲得蛋白質(zhì)半胱氨酸所發(fā)生的翻譯后修飾的信息。因此，利用化學(xué)活性探針與蛋白半胱氨酸翻譯后修飾位點直接進(jìn)行作用，進(jìn)行標(biāo)記的方式應(yīng)用越來越廣泛，以下介紹幾種利用該策略檢測蛋白質(zhì)半胱氨酸翻譯后修飾的ABPP方法(圖7)。

圖7 用于蛋白質(zhì)半胱氨酸翻譯后修飾直接檢測的ABPP探針

次磺酸(RSOH)是氧化應(yīng)激的重要生物標(biāo)志物[34–36]，它是半胱氨酸被過氧化氫氧化為亞磺酸、磺酸反應(yīng)過程的中間體。目前用于蛋白質(zhì)半胱氨酸的次磺酸化修飾檢測的探針有4-chloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole (NBD-Cl)、環(huán)炔、二甲酮和降冰片烯等。Daniel C. Liebler課題組使用以雙甲酮為反應(yīng)基團的ABPP探針1 (圖7a)，選擇性標(biāo)記了細(xì)胞中約1000個發(fā)生次磺酸化修飾的蛋白質(zhì)[37]。受雙甲酮啟示，Carroll等人對各種以碳為中心的雙甲酮親核試劑進(jìn)行了廣泛的研究，不斷提高它們與RSOH的反應(yīng)速率，設(shè)計的五個化學(xué)探針(DYn-2，TD，PYD，PRD，BTD)共在761種蛋白質(zhì)上發(fā)現(xiàn)了1283個―SOH位點[38]。Justin M. Chalker等人設(shè)計的降冰片烯衍生物探針2 (圖7a)一端帶有RSOH特異性響應(yīng)的烯基基團，另一端帶有可進(jìn)行點擊反應(yīng)的炔基，用于探究蛋白質(zhì)和活細(xì)胞中RSOH。與傳統(tǒng)的二甲酮試劑相比，該探針顯示出不同的反應(yīng)活性和優(yōu)越的化學(xué)選擇性，利用該探針發(fā)現(xiàn)的148個新―SOH蛋白促進(jìn)了對于氧化還原信號和與氧化應(yīng)激相關(guān)的疾病的研究與理解[39,40]。另外，S. Bruce King課題組提出的環(huán)炔烴可以與RSOH快速反應(yīng)生成烯基亞砜加合物，環(huán)炔烴探針3 (圖7a)利用生物素進(jìn)行免疫蛋白印跡驗證與RSOH的特異性響應(yīng)，有助于發(fā)現(xiàn)未知的RSOH位點及其母蛋白[41]。

蛋白質(zhì)半胱氨酸的亞磺酸化修飾(―SO2H)是活性氧進(jìn)一步氧化RSOH為半胱氨酸亞磺酸(RSO2H)的產(chǎn)物，是由生理信號和氧化還原應(yīng)激誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)天然發(fā)生的翻譯后修飾[42,43]。Carroll團隊設(shè)計了兩種基于與RSO2H形成穩(wěn)定化合物的探針：一種是名為NO-Bio的亞硝基苯甲酸酯，另一種是名為Diazenes的含電子缺陷的二嗪探針4 (圖7b)[44–46]。后者具有優(yōu)異的靈敏度和與質(zhì)譜的兼容性，便于蛋白質(zhì)RSO2H的位點定量分析。另外，基于RSO2H的親核性，Gregory R. J. Thatcher課題組根據(jù)亞磺酸與亞硝酸作用可以形成穩(wěn)定的硫代磺酸鹽設(shè)計了含亞硝酸的探針5 (圖7b)和含亞磺酸的探針6 (圖7c)來分別研究蛋白質(zhì)半胱氨酸的亞磺酸化和亞硝基化[47]。

蛋白質(zhì)半胱氨酸的亞硝基化(―SNO)是一氧化氮作用于半胱氨酸殘基形成亞硝酸(RSNO)的過程，是介導(dǎo)一氧化氮生物活性的最重要的信號通路[48]。Tannenbaum等人將還原連接技術(shù)與生物素轉(zhuǎn)換策略相結(jié)合，利用一種基于磷化氫的ABPP探針7 (圖7c)直接檢測RSNO[49]。

3.4 含有生物正交基團的代謝標(biāo)記方法

除了上述所說的三種標(biāo)記方式，針對脂質(zhì)修飾、脂質(zhì)衍生親電分子修飾和其他代謝產(chǎn)物修飾等代謝標(biāo)記，研究人員在原本的代謝物上引入正交基團合成相應(yīng)的探針來對這些蛋白質(zhì)半胱氨酸的翻譯后修飾進(jìn)行研究。例如，蛋白質(zhì)半胱氨酸的S-棕櫚?；揎?S-Palmitoylation)，是16-碳飽和脂肪酸在S-?；D(zhuǎn)移酶的作用下通過硫酯鍵共價修飾到蛋白質(zhì)半胱氨酸形成的動態(tài)可逆的脂質(zhì)修飾，可增加蛋白質(zhì)疏水性，調(diào)控蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能等，在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面發(fā)揮重要作用。Rami N.Hannoush課題組利用炔基棕櫚酸類似物代謝標(biāo)記的方法，實現(xiàn)高通量的S-palmitoylation修飾蛋白質(zhì)組的定性和定量研究[50]。蛋白質(zhì)半胱氨酸的4-羥基壬烯酸修飾(S-HNE)，由HNE和半胱氨酸發(fā)生邁克爾加成產(chǎn)生，能夠改變蛋白質(zhì)的功能，甚至破壞細(xì)胞機制。Yang等利用一種含炔基HNE的類似物，利用輕重同位素選擇性標(biāo)記HNE修飾的蛋白質(zhì)，從RKO細(xì)胞中鑒定出386個含炔基HNE類似物的半胱氨酸的蛋白質(zhì)[51]。另外，蛋白質(zhì)異戊二烯化(S-Prenylation)也是一種半胱氨酸翻譯后修飾的脂質(zhì)修飾類型，在細(xì)胞定位、信號傳導(dǎo)等方面發(fā)揮重要作用。Guillaume Charron等設(shè)計了炔基-法尼醇這類ABPP探針實現(xiàn)異戊二烯蛋白質(zhì)組的分析[52]。在用競爭標(biāo)記方法間接鑒定了衣康酸修飾的半胱氨酸位點后，王初課題組又開發(fā)了帶有炔基的新型衣康酸修飾探針工具，結(jié)合定量化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，首次實現(xiàn)了炎癥巨噬細(xì)胞中衣康酸修飾半胱氨酸位點的大規(guī)模直接鑒定，并且進(jìn)一步揭示了衣康酸對細(xì)胞程序性壞死過程的調(diào)節(jié)作用[53]。

3.5 蛋白質(zhì)半胱氨酸翻譯后修飾的ABPP方法的比較

蛋白質(zhì)半胱氨酸翻譯后修飾受到越來越多的關(guān)注，其分析方法層出不窮，各有千秋。利用生物素轉(zhuǎn)換方式的分析方法，能夠彌補翻譯后修飾形式探針缺乏或探針選擇性差的缺陷，間接得到修飾蛋白及其修飾位點信息，但這類方法操作繁瑣，富集效率受多步反應(yīng)的影響，內(nèi)源性生物素化蛋白等可能會造成背景干擾，而且富集材料的理化性質(zhì)也會在很大程度上影響富集的效果。此外，基于半胱氨酸探針的競爭性標(biāo)記技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于鑒定共價藥物和代謝物在蛋白質(zhì)組中的半胱氨酸修飾位點，能夠最大程度地保持原代謝物的原有活性，可省去探針繁瑣的合成步驟。而利用成熟的商品化的探針間接地研究半胱氨酸翻譯后修飾原位標(biāo)記，在受到背景標(biāo)記影響的同時也會漏掉一些潛在的修飾靶點。探針直接標(biāo)記翻譯后修飾位點的方法，可避免了耗時長且操作繁瑣的弊端，但要求探針高效專一。含有生物正交基團的代謝標(biāo)記方法分析半胱氨酸上的修飾，能夠有效研究動態(tài)、可逆的修飾，減小對蛋白質(zhì)的膜定位和下游信號傳導(dǎo)的干擾，但需要在代謝物上引入正交反應(yīng)的基團并且在質(zhì)譜分析過程中可能會產(chǎn)生中性丟失。因此，對于氧化還原依賴的修飾，設(shè)計相應(yīng)的探針來對其進(jìn)行直接標(biāo)記檢測更能瞬時捕獲這些動態(tài)修飾，能夠最大程度地真實反映細(xì)胞在某些狀態(tài)下的氧化翻譯后修飾。對于脂質(zhì)修飾、脂質(zhì)衍生親電分子修飾和其他代謝產(chǎn)物修飾等代謝標(biāo)記要根據(jù)特定的生物學(xué)問題或環(huán)境下來競爭標(biāo)記或者含有生物正交基團的代謝標(biāo)記方法，同時這兩種方法還可以同時應(yīng)用，其結(jié)果相互補充，最大范圍內(nèi)的鑒定出相應(yīng)的修飾靶點。

4 總結(jié)與展望

蛋白質(zhì)半胱氨酸及其各種翻譯后修飾形式在蛋白質(zhì)功能的發(fā)揮中扮演著十分重要的角色，因此對它們的研究熱度一直居高不下。近些年，隨著生物質(zhì)譜的更新?lián)Q代和各學(xué)科間的交叉融合，化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)也被推上了新的高度。在諸多化學(xué)生物學(xué)方法中，ABPP技術(shù)因其是借助化學(xué)小分子從功能角度直接切入蛋白質(zhì)組的研究，能夠直接對蛋白質(zhì)組中感興趣的靶蛋白的活性進(jìn)行檢測而得到很多化學(xué)生物學(xué)研究者的青睞。本文介紹了一些針對蛋白質(zhì)半胱氨酸及其翻譯后修飾研究的代表性ABPP技術(shù)和分析策略，盡管它們各有長短，但都可作為相互補充的方法。研究人員應(yīng)該根據(jù)研究對象所處的具體環(huán)境來選擇合適的技術(shù)來開展相關(guān)的研究，尤其是要選擇合適的蛋白組定量方法，才能盡可能地避免樣品制備過程中所帶來的誤差。面向未來，針對蛋白質(zhì)半胱氨酸及其翻譯后修飾的ABPP技術(shù)的研究除繼續(xù)開發(fā)更為高效的探針與富集技術(shù)，以及更靈敏的質(zhì)譜檢測方法外，還要更加針對具體的生物學(xué)問題、圍繞需求來發(fā)展，比如開發(fā)能夠在活細(xì)胞內(nèi)靶向(亞)細(xì)胞器中蛋白質(zhì)半胱氨酸及其翻譯后修飾的化學(xué)探針、將質(zhì)譜的蛋白定量信息轉(zhuǎn)化為所需研究結(jié)果等。ABPP技術(shù)將繼續(xù)探索復(fù)雜生物系統(tǒng)中更多蛋白質(zhì)半胱氨酸及其翻譯后修飾類型的蛋白靶點，以研究和闡明蛋白質(zhì)半胱氨酸在生物學(xué)功能中的調(diào)節(jié)機制，深入挖掘這些蛋白靶點作為藥物治療靶標(biāo)的潛力，為疾病治療提供重要的理論基礎(chǔ)。