點(diǎn)擊化學(xué)和生物正交化學(xué)中的化學(xué)基礎(chǔ)概念和前沿思想
——2022年諾貝爾化學(xué)獎淺析

李恒宇，賴鋮陽，黃思齊，陳興,＊

1北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，北京 100871

2北京大學(xué)附屬中學(xué)道爾頓學(xué)院，北京 100190

2022年10月5日，瑞典皇家科學(xué)院宣布將2022年諾貝爾化學(xué)獎頒發(fā)給美國化學(xué)家Carolyn R.Bertozzi、丹麥化學(xué)家Morten Meldal和美國化學(xué)家K. Barry Sharpless，以表彰他們開創(chuàng)并發(fā)展了點(diǎn)擊化學(xué)和生物正交化學(xué)(圖1a)[1]。

圖1 (a) Bertozzi (中)、Meldal (左)和Sharpless (右)三位科學(xué)家因開創(chuàng)點(diǎn)擊化學(xué)和生物正交化學(xué)獲得2022年諾貝爾化學(xué)獎；(b) 以一價(jià)銅催化的疊氮-炔環(huán)加成為代表的點(diǎn)擊化學(xué);(c) 基于生物正交化學(xué)的非天然糖代謝標(biāo)記

點(diǎn)擊化學(xué)(click chemistry)的概念由Sharpless于2001年創(chuàng)造并提出，指的是一類模塊化、高選擇性、條件溫和、高產(chǎn)率的偶聯(lián)反應(yīng)，以實(shí)現(xiàn)功能分子的高效快速合成[2]。在傳統(tǒng)的有機(jī)合成化學(xué)中，為了追求產(chǎn)率和效率，分子骨架的構(gòu)建通常需要在有機(jī)溶劑中進(jìn)行，并使用升溫、酸或堿、惰性氣體保護(hù)等條件。很多有機(jī)反應(yīng)還需要對活潑基團(tuán)進(jìn)行預(yù)先的保護(hù)，導(dǎo)致合成過程變得復(fù)雜和繁瑣。羥醛縮合就是這類反應(yīng)的一個(gè)典型例子，常在復(fù)雜分子合成中用以構(gòu)建碳―碳(C―C)鍵。相反地，大自然則熟練地在常溫、中性pH的水溶液中引發(fā)各種生化反應(yīng)，將各種單體分子模塊，通過脫水縮合形成碳―雜原子(C―X)鍵，合成各種生物大分子。師法自然，點(diǎn)擊化學(xué)的核心思想是強(qiáng)調(diào)反應(yīng)的高效性和功能性。2002年，Sharpless和Meldal分別獨(dú)立報(bào)道了一價(jià)銅催化的疊氮-炔環(huán)加成(copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition，CuAAC)反應(yīng)(圖1b)[3,4]。這個(gè)反應(yīng)在高分子、藥物分子、材料等的合成中迅速得到廣泛應(yīng)用，成為點(diǎn)擊化學(xué)“皇冠上的明珠”[5,6]。

生物正交化學(xué)(bioorthogonal chemistry)的概念由Bertozzi于2003年正式提出，指一類應(yīng)用于生命體系的快速、選擇性標(biāo)記反應(yīng)，這類反應(yīng)與生物體內(nèi)的生物化學(xué)過程互不干擾，相互“正交”[7,8]。實(shí)際上，生物正交反應(yīng)的開發(fā)可以追溯至20世紀(jì)90年代末Bertozzi課題組為解決糖質(zhì)(glycan)標(biāo)記難題所做的工作[9]。細(xì)胞作為生命體的基本組成單元，其微小體積下的內(nèi)部結(jié)構(gòu)卻是復(fù)雜和擁擠的，需要依賴各種生物分子的協(xié)調(diào)配合才能行使正常的生物學(xué)功能。為了在細(xì)胞中研究糖質(zhì)這一重要生物大分子的功能，Bertozzi課題組發(fā)展了非天然糖代謝標(biāo)記(metabolic glycan labeling)技術(shù)，將含有生物正交反應(yīng)基團(tuán)的單糖代謝整合到糖質(zhì)中，繼而利用生物正交反應(yīng)連接熒光探針，實(shí)現(xiàn)糖質(zhì)特異性標(biāo)記和觀測(圖1c)[10]。1997年，他們運(yùn)用醛酮和酰肼的偶聯(lián)反應(yīng)，對細(xì)胞表面的唾液酸化糖質(zhì)進(jìn)行化學(xué)標(biāo)記[11]。然而，醛酮-酰肼偶聯(lián)反應(yīng)需要酸性條件，不利于活細(xì)胞標(biāo)記。為了解決這一問題，Bertozzi課題組1998年開發(fā)了疊氮和三苯基膦之間的Staudinger連接反應(yīng)，這是第一個(gè)生物正交反應(yīng)[12]。盡管Staudinger連接反應(yīng)在糖質(zhì)標(biāo)記等生物標(biāo)記中得到了廣泛的應(yīng)用，但它仍存在反應(yīng)速率不夠快等不足。另一方面，CuAAC反應(yīng)具有極佳的反應(yīng)動力學(xué)，然而一價(jià)銅催化劑具有細(xì)胞毒性，限制了其在生物標(biāo)記中的應(yīng)用。為了克服銅毒性的問題，2004年Bertozzi課題組報(bào)道了疊氮-環(huán)辛炔之間的環(huán)張力促發(fā)疊氮-炔環(huán)加成(strain-promoted azide-alkyne cycloaddition，SPAAC)反應(yīng)，也被稱為無銅催化的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)(copper-free click chemistry)[13]。隨著生物正交化學(xué)的發(fā)展，非天然糖代謝標(biāo)記也成為了在活細(xì)胞和活體中糖質(zhì)標(biāo)記和功能解析的主要方法之一[14]。

從此，生物正交化學(xué)和點(diǎn)擊化學(xué)逐漸被統(tǒng)一起來，二者分別從生物正交標(biāo)記和有機(jī)合成方法學(xué)出發(fā)，殊途同歸，成為了在化學(xué)合成、生物標(biāo)記、材料制備等領(lǐng)域最重要的化學(xué)反應(yīng)工具之一。作為在合成化學(xué)和化學(xué)生物學(xué)領(lǐng)域的開創(chuàng)性方法，點(diǎn)擊化學(xué)成功地借鑒了自然界合成生物分子的化學(xué)機(jī)制，而生物正交化學(xué)成功地建立了探究生命科學(xué)的化學(xué)方法，可以說它們分別是“源自生命的化學(xué)”和“探索生命的化學(xué)”。實(shí)際上，點(diǎn)擊化學(xué)和生物正交化學(xué)的開發(fā)和建立，運(yùn)用了許多有機(jī)化學(xué)和物理化學(xué)的基礎(chǔ)概念和理論。本文就這些基礎(chǔ)概念進(jìn)行一些探討，以期對讀者思考和探索化學(xué)前沿有些許啟發(fā)。

1 從Staudinger反應(yīng)到Staudinger連接反應(yīng)

1.1 葉立德和Staudinger反應(yīng)

葉立德(ylide)又稱鄰位兩性離子，通常指第三周期元素與碳或氮結(jié)合，碳原子或氮原子帶負(fù)電荷、雜原子帶正電荷且均保持完整電子隅的一類化學(xué)結(jié)構(gòu)，以磷葉立德和硫葉立德最為常見。磷葉立德的磷原子可以利用其3d軌道和碳原子或氮原子的p軌道形成具有強(qiáng)極性的p–d π鍵，具有很強(qiáng)的親核性(圖2a)。在Wittig反應(yīng)中，磷葉立德與酮或醛的羰基發(fā)生親核加成，形成烯烴(圖2b)。磷葉立德也常被稱為Wittig試劑。1919年，德國化學(xué)家Hermann Staudinger報(bào)道了疊氮化物與膦之間的Staudinger反應(yīng)[15]。以三苯基膦和疊氮化物的反應(yīng)為例，磷原子親核進(jìn)攻疊氮基團(tuán)末端的氮原子后生成氮雜四元環(huán)中間體，隨后氮?dú)怆x去生成氮雜磷葉立德，最終水解生成胺和三苯基氧膦(圖2c)。由于所形成的中間體會釋放氮?dú)猓琒taudinger反應(yīng)具有較強(qiáng)的驅(qū)動力和較快的反應(yīng)速率。

圖2 (a) 磷葉立德結(jié)構(gòu)式；(b) Wittig反應(yīng)；(c) Staudinger反應(yīng)；(d) Staudinger連接反應(yīng)

1.2 Staudinger連接反應(yīng)的驅(qū)動力改良

疊氮基團(tuán)在細(xì)胞中不存在，且在生理?xiàng)l件下具有優(yōu)異的化學(xué)穩(wěn)定性，具備作為生物正交反應(yīng)基團(tuán)用于非天然糖代謝標(biāo)記的基本條件。要實(shí)現(xiàn)糖質(zhì)的生物正交標(biāo)記，則還需要開發(fā)對疊氮進(jìn)行連接的生物正交反應(yīng)。盡管Staudinger反應(yīng)具有良好的反應(yīng)動力學(xué)，但是最后一步水解使得兩種反應(yīng)物無法生成偶聯(lián)產(chǎn)物?；谶@些考慮，Bertozzi課題組于2000年對Staudinger反應(yīng)的驅(qū)動因素進(jìn)行了改良，報(bào)道了終產(chǎn)物為偶聯(lián)形式的Staudinger連接反應(yīng)[12]。開發(fā)該反應(yīng)的關(guān)鍵是在三苯基膦的一個(gè)苯環(huán)的鄰位接上甲酸甲酯，因而所形成的氮雜磷葉立德不發(fā)生水解，而是生成五元環(huán)內(nèi)酰胺，最后水解形成偶聯(lián)產(chǎn)物(圖2d)。

相比于傳統(tǒng)的Staudinger反應(yīng)，Staudinger連接反應(yīng)的驅(qū)動力在以下兩方面發(fā)生了改變。首先，苯甲酸甲酯的羰基碳原子受到氮上孤對電子的進(jìn)攻，形成酰胺。對于羧酸衍生物，在酸催化或堿催化下發(fā)生親核取代的反應(yīng)活性從高到低依次為：酰鹵>酸酐>酯>酰胺[16]。相比于苯甲酸甲酯，生成的酰胺具有更高的穩(wěn)定性，因此在氮上孤對電子的進(jìn)攻后甲氧基易于離去而生成酰胺，然后再發(fā)生水解。再者，氮原子進(jìn)攻為分子內(nèi)反應(yīng)，且生成五元環(huán)。根據(jù)張力學(xué)說，五元環(huán)、六元環(huán)具有最好的穩(wěn)定性[16]。因此，這兩種驅(qū)動力使得反應(yīng)朝著形成內(nèi)酰胺的方向進(jìn)行。

通過增加以上兩種反應(yīng)驅(qū)動力因素，Bertozzi課題組成功地將Staudinger反應(yīng)從一個(gè)非連接反應(yīng)改造為連接反應(yīng)，成功開發(fā)出了疊氮與三苯基膦之間的生物正交反應(yīng)。在生物正交化學(xué)的發(fā)展歷程中，Staudinger連接反應(yīng)被普遍認(rèn)為是第一個(gè)真正意義上的生物正交反應(yīng)，也被稱為Staudinger-Bertozzi連接反應(yīng)。

2 一價(jià)銅催化的疊氮-炔環(huán)加成反應(yīng)

2.1 1,3-偶極體和疊氮-炔的1,3-偶極環(huán)加成

1,3-偶極體(1,3-dipole compound)是一類具有三原子四電子π體系，可以用偶極共振式來描述的化合物，例如臭氧、重氮甲烷和疊氮化合物等。這類化合物具有與烯丙基負(fù)離子類似的分子軌道，能與烯烴、炔烴等親偶極體發(fā)生環(huán)加成反應(yīng)，生成五元環(huán)狀化合物。根據(jù)前線軌道理論，化學(xué)反應(yīng)的發(fā)生要求一個(gè)反應(yīng)物分子的HOMO軌道和另一反應(yīng)物分子的LUMO軌道對稱性匹配且能級接近[17]。對于1,3-偶極環(huán)加成反應(yīng)，在符合這些要求的情況下，可以根據(jù)1,3-偶極體的不同分為若干反應(yīng)類型。

1960年代初，德國化學(xué)家Rolf Huisgen報(bào)道了一種疊氮化物與炔基化合物之間的1,3-偶極環(huán)加成反應(yīng)[18]。在加熱條件下，兩種反應(yīng)物發(fā)生總電子數(shù)6π體系的協(xié)同反應(yīng)，經(jīng)過五元環(huán)過渡態(tài)生成1,2,3-三氮唑并放出熱量(圖3a)。這個(gè)[2+3]環(huán)加成反應(yīng)大量放熱，且疊氮基和炔基均可在水相、開放的環(huán)境中穩(wěn)定存在，符合Sharpless所提出點(diǎn)擊化學(xué)基本要求的其中幾點(diǎn)。然而，該反應(yīng)歷程中形成五元環(huán)狀過渡態(tài)的活化能較高，因而需要加熱以提高反應(yīng)速率。此外，對于碳碳三鍵兩端取代基不同的炔基化合物，該反應(yīng)的區(qū)域選擇性較差，得到的是1,4-取代和1,5-取代的兩種產(chǎn)物的混合物。因此，如要將疊氮-炔間的1,3-偶極環(huán)加成開發(fā)成點(diǎn)擊化學(xué)，需要從降低活化能和提高區(qū)域選擇性兩方面進(jìn)行優(yōu)化。

2.2 一價(jià)銅催化的疊氮-炔環(huán)加成反應(yīng)

2002年，Sharpless和Meldal分別獨(dú)立發(fā)現(xiàn)一價(jià)銅催化劑可以完美地解決上述問題[3,4]。碳碳三鍵能夠和一價(jià)銅離子形成配位鍵，而且末端炔基容易電離氫離子并和另一個(gè)一價(jià)銅離子配位形成炔基銅化合物。隨后，疊氮取代另一個(gè)配體與一價(jià)銅鍵合，炔基β碳原子親核進(jìn)攻疊氮末端氮原子，形成一個(gè)獨(dú)特的六元環(huán)中間體，銅由一價(jià)變?yōu)槿齼r(jià)。這一反應(yīng)中間體不穩(wěn)定，容易發(fā)生縮環(huán)產(chǎn)生穩(wěn)定性更好的五元芳香雜環(huán)化合物，并使銅從三價(jià)回到一價(jià)，最終完成催化循環(huán)(圖3b)[19]。由于一價(jià)銅在水溶液中不穩(wěn)定，通常由抗壞血酸鈉等還原劑原位還原二價(jià)銅產(chǎn)生。除了一價(jià)銅以外，其他二價(jià)釕也被發(fā)現(xiàn)可以催化這一反應(yīng)[20]。

圖3 (a) Huisgen疊氮-炔環(huán)加成反應(yīng)；(b) CuAAC反應(yīng)；(c) SPAAC反應(yīng)

根據(jù)催化反應(yīng)動力學(xué)理論，催化劑通過改變反應(yīng)途徑從而降低反應(yīng)活化能，提高反應(yīng)速率[21]。在一價(jià)銅的催化下，疊氮-炔環(huán)加成反應(yīng)的反應(yīng)途徑發(fā)生了改變，活化能大幅降低，使得該反應(yīng)可以在常溫下高效快速進(jìn)行(圖4a)。除了優(yōu)異的反應(yīng)動力學(xué)外，CuAAC反應(yīng)還具有一系列優(yōu)點(diǎn)。例如，該反應(yīng)既可以在有機(jī)溶劑中進(jìn)行，也可以在水相和醇溶劑中發(fā)生。CuAAC反應(yīng)對底物兼容性很好，并且基本不受其他活性官能團(tuán)的干擾。該反應(yīng)所產(chǎn)生的三氮唑產(chǎn)物通常易于純化。這些特點(diǎn)使得CuAAC成為了一個(gè)簡單易用且溫和高效的反應(yīng)，迅速得到大量的應(yīng)用，也成為了點(diǎn)擊化學(xué)的代名詞。

圖4 (a) CuAAC反應(yīng)通過一價(jià)銅離子催化劑改變反應(yīng)過渡態(tài)，從而降低反應(yīng)活化能；(b) SPAAC反應(yīng)通過環(huán)張力活化反應(yīng)物，從而降低反應(yīng)活化能

3 環(huán)張力驅(qū)動的疊氮-炔環(huán)加成反應(yīng)

Bertozzi課題組于2004年報(bào)道的SPAAC反應(yīng)則利用環(huán)張力來取代一價(jià)銅催化劑，從而解決CuAAC在生物應(yīng)用中的毒性問題(圖3c)[13]。除了通過合適的催化劑來降低反應(yīng)的活化能(圖4a)，提高反應(yīng)物自身的能量也可以使活化能降低(圖4b)。根據(jù)這一思路，Bertozzi等人設(shè)計(jì)了八元環(huán)炔類化合物。由于炔基的碳碳三鍵中的碳原子是sp雜化，鍵角為180°，八元環(huán)的張力使得環(huán)辛炔活性增加，可以在室溫下與疊氮基高效快速地發(fā)生反應(yīng)。更小的環(huán)炔(如環(huán)庚炔和環(huán)己炔等)則由于環(huán)張力過大，在室溫下不穩(wěn)定。當(dāng)然，SPAAC也不可避免地會得到1,4-取代和1,5-取代的兩種產(chǎn)物。不過，對于生物標(biāo)記的應(yīng)用來說，這一影響不大。SPAAC也被稱為無銅催化的點(diǎn)擊化學(xué)，在實(shí)際應(yīng)用中也漸漸模糊了點(diǎn)擊化學(xué)和生物正交化學(xué)的界線，逐漸將兩種化學(xué)反應(yīng)統(tǒng)一起來。

4 結(jié)語

點(diǎn)擊化學(xué)和生物正交化學(xué)是化學(xué)概念和理念上的創(chuàng)新和突破?？v觀現(xiàn)代科學(xué)的發(fā)展歷程，科學(xué)新發(fā)現(xiàn)和新概念是最重要的兩類驅(qū)動力，而且這兩者之間是相輔相成、相互促發(fā)的。Sharpless教授在2001年前瞻性地提出了點(diǎn)擊化學(xué)的概念，開創(chuàng)了點(diǎn)擊化學(xué)這個(gè)領(lǐng)域。這應(yīng)是得益于這位最富創(chuàng)造性的化學(xué)家長期以來對有機(jī)化學(xué)合成在理念層面深入的思索。Sharpless課題組還于2014年開發(fā)出了“第二代”點(diǎn)擊化學(xué)——六價(jià)硫氟交換(sufer(VI)-fluoride exchange，SuFEx)反應(yīng)，繼續(xù)引領(lǐng)點(diǎn)擊化學(xué)的發(fā)展前沿[22]。Bertozzi教授則在2003年歸納了其課題組在之前5年利用化學(xué)標(biāo)記進(jìn)行糖質(zhì)成像的工作，抽象并提出了生物正交化學(xué)這一全新的概念，從而促進(jìn)這個(gè)領(lǐng)域的迅猛發(fā)展。當(dāng)前，生物正交反應(yīng)仍然是化學(xué)生物學(xué)中最活躍的一個(gè)方向，發(fā)展出了包括反式環(huán)辛烯和四嗪分子之間的Diels-Alder反應(yīng)等一系列新型的生物正交化學(xué)[23]。在實(shí)際學(xué)習(xí)和科學(xué)研究中，我們往往會在一定程度上忽視提出和歸納新概念的重要性。點(diǎn)擊化學(xué)和生物正交化學(xué)概念的提出，值得我們認(rèn)真體會和借鑒。

重大的科學(xué)突破常常離不開基本知識和原理。點(diǎn)擊化學(xué)和生物正交化學(xué)的開發(fā)和發(fā)展過程，正是化學(xué)基礎(chǔ)概念在解決前沿科學(xué)問題中發(fā)揮關(guān)鍵作用的體現(xiàn)。三位科學(xué)家巧妙地運(yùn)用化學(xué)的基礎(chǔ)概念和原理，對傳統(tǒng)的化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行改造，使之成為目前在化學(xué)、生命科學(xué)、材料科學(xué)等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用價(jià)值的化學(xué)反應(yīng)。這也再次提醒我們，扎實(shí)掌握基礎(chǔ)知識是取得科學(xué)前沿突破的必要條件。