線粒體自噬在糖尿病腎病中作用機(jī)制的研究進(jìn)展

于光輝綜述,郭兆安審校

0 引 言

腎耗氧及耗能高,由線粒體生成的三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)參與管球反饋,影響腎血流與氧氣的運(yùn)輸。作為細(xì)胞的內(nèi)在動力,線粒體是調(diào)節(jié)細(xì)胞存活與死亡(凋亡、自噬、壞死)的關(guān)鍵,增強(qiáng)線粒體自噬可調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能,改善炎癥,延長壽命,但線粒體自噬不足與過度都會促使細(xì)胞損傷和死亡［1-2］。糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)是終末期腎病最常見的病因,主要病理是腎小球微血管損傷、足細(xì)胞丟失、腎小管與間質(zhì)病變,與氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等過程聯(lián)系緊密。輕度氧化應(yīng)激可以通過提高線粒體自噬水平、消除受損線粒體來維持腎細(xì)胞活力,過度則會促進(jìn)纖維化發(fā)生。在高糖作用下,線粒體呼吸鏈向細(xì)胞質(zhì)釋放過量活性氧以傳遞缺氧信號,誘導(dǎo)線粒體去極化,降低呼吸鏈的活性并抑制線粒體自噬,導(dǎo)致腎對代謝性酸中毒的適應(yīng)性下降,在多種炎癥因子與促凋亡因子的刺激下細(xì)胞凋亡,嚴(yán)重的ATP耗竭后發(fā)生細(xì)胞壞死［3-5］。因此,通過改善腎細(xì)胞的線粒體自噬,進(jìn)而減少炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激可能是治療DN的新方法。

1 線粒體自噬概述

線粒體自噬是指細(xì)胞通過自噬調(diào)控機(jī)制選擇性清除衰老及受損的線粒體的過程,具有防止有害物質(zhì)積累、維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)等作用。線粒體自噬可以通過裂變來調(diào)節(jié),在饑餓和氧化等刺激下,動力蛋白1(dynamic-related protein 1, Drp1)激活后募集并剪切線粒體外膜,從而分離出受損線粒體以供自噬［6］。自噬受體與其靶標(biāo)上的分子結(jié)合后,在含微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3, LC3)與LC3相互作用區(qū)(LC3-interacting regions, LIR)的作用下被引至自噬溶酶體,降解線粒體內(nèi)容物從而提供能量以求存活［7］。然而,當(dāng)線粒體頻繁碎裂或長期受損時,線粒體自噬紊亂,可與細(xì)胞凋亡、壞死協(xié)同作用,導(dǎo)致ATP和蛋白質(zhì)的合成受阻,膜的通透性改變甚至破裂,最終細(xì)胞死亡［8］。因此線粒體自噬具有促生存和促死亡的雙重功能。

2 哺乳動物中線粒體自噬的調(diào)控機(jī)制

許多蛋白具有LIR或泛素結(jié)合區(qū),通過參與自噬體之中靶細(xì)胞器或蛋白的包封,并融合溶酶體,從而促進(jìn)線粒體自噬。作為線粒體自噬調(diào)節(jié)因子的假定激酶蛋白1(PTEN induced putative kinase 1, PINK1)、帕金森病蛋白(parkinson protein, Parkin)、Nip3樣蛋白X(Nip3-like protein X, Nix)、腺病毒E1B相互作用蛋白3(adenovirus E1B 19 ku interacting protein 3, BNIP3)等因子的表達(dá)在糖尿病前期患者中顯著升高。

2.1PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬PINK1/Parkin途徑是控制線粒體質(zhì)量的關(guān)鍵。當(dāng)細(xì)胞受損時膜電位喪失,PINK1在去極化的線粒體表面積累后,以線粒體外膜基礎(chǔ)泛素為底物來初始化通路,激活并募集Parkin后,將泛素鏈結(jié)合到線粒體外膜上,此過程為PINK1提供了更多泛素以磷酸化,導(dǎo)致Parkin進(jìn)一步募集并迅速易位至受損的線粒體。此后,在LC3與LIR的作用下線粒體自噬被觸發(fā)［9-10］。PINK1對線粒體功能障礙的快速反應(yīng)、Parkin的快速激活和易位保障了線粒體自噬的有效開展。在PINK1/Parkin途徑中,視神經(jīng)蛋白(optineurin, OPTN)在泛素化運(yùn)載物附近放大信號環(huán)路,保障靶向自噬膜或者其泛素轉(zhuǎn)運(yùn)體的進(jìn)行［11］。

2.2Nix/BNIP3途徑介導(dǎo)的線粒體自噬Nix以及其同源物BNIP3定位于線粒體,共享LIR序列,可錨定于線粒體外膜,與LC3B結(jié)合后觸發(fā)線粒體去極化從而誘導(dǎo)自噬［12］。Nix蛋白磷酸化后將線粒體引入自噬體或增強(qiáng)Parkin的募集以啟動線粒體自噬,然而Nix的表達(dá)隨Parkin沉默而受抑［13］。Vincent等［14］發(fā)現(xiàn),在炎癥過程中,小鼠上皮細(xì)胞中線粒體分裂與Nix介導(dǎo)的自噬均上調(diào),而在Nix敲除鼠中則存在異常線粒體的積聚。BNIP3具有促進(jìn)線粒體裂變,抑制融合的作用。缺氧誘導(dǎo)的BNIP3過表達(dá)可抑制活性氧的產(chǎn)生,增加自噬性死亡,從而保護(hù)機(jī)體免于細(xì)胞壞死［15-16］。因此,Nix與BNIP3是潛在的靶蛋白,可通過調(diào)控線粒體自噬從而在早期干預(yù)腎功能惡化與細(xì)胞死亡。

2.3FUN14結(jié)構(gòu)域包含蛋白1(FUN14 domain-containing 1, FUNDC1)/酪氨酸激酶(steroid receptor coactivator, SRC)途徑介導(dǎo)的線粒體自噬內(nèi)源性FUNDC1位于線粒體外膜,在缺氧時發(fā)揮促進(jìn)線粒體自噬的功能,其介導(dǎo)的線粒體自噬依賴LIR與LC3之間的相互作用從而為細(xì)胞存活提供優(yōu)勢［17］。正常情況下,位于LIR基序中的酪氨酸18經(jīng)SRC誘導(dǎo)后磷酸化,導(dǎo)致FUNDC1 LIR對LC3產(chǎn)生空間位阻,抑制線粒體自噬的發(fā)生。而缺氧會抑制SRC活化,并誘導(dǎo)LIR去磷酸化后增強(qiáng)對LC3的親和力進(jìn)而促進(jìn)自噬［18］。因此,FUNDC1 LIR的可逆磷酸化可作為線粒體自噬分子的開關(guān),SRC充當(dāng)線粒體自噬的負(fù)調(diào)節(jié)劑。此外,FUNDC1/SRC線粒體自噬軸還參與細(xì)胞侵襲與遷移、血管生成等多種過程,并與糖尿病、癌癥、腎纖維化等密切相關(guān)［19］。

2.4硫氧還蛋白互作蛋白(thioredoxin-interacting protein, Txnip)途徑介導(dǎo)的線粒體自噬Txnip是一種由高血糖誘導(dǎo)的促炎因子,定位于細(xì)胞核,具有抗增殖作用［20］。Txnip的激活是糖尿病邁向DN的關(guān)鍵一步,在高糖環(huán)境中,Txnip在活性氧的調(diào)節(jié)下轉(zhuǎn)移至線粒體,抑制LC3形成從而影響自噬,并促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的沉積,導(dǎo)致腎小球硬化與腎間質(zhì)纖維化;而抑制Txnip后,活性氧產(chǎn)生減少,氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)減輕,線粒體自噬恢復(fù)［21］。Txnip還可干預(yù)哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)從而調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡等過程。雖然Txnip在DN進(jìn)展中的作用并未超過代謝和血流動力學(xué)改變而產(chǎn)生的影響,但是腎靶向抑制Txnip可能是輔助治療DN的一種新型策略。

2.5雙特異性蛋白磷酸酶1(dual-specicity protein phosphatase 1, DUSP1)介導(dǎo)的線粒體自噬DUSP1具有蘇氨酸和酪氨酸雙重特異性,可穩(wěn)定膜電位,限制細(xì)胞色素C釋放,抑制半胱氨酸蛋白酶等凋亡因子的表達(dá),維持線粒體穩(wěn)態(tài)。在缺血再灌注損傷后,DUSP1的表達(dá)下調(diào)而Drp1、LC3、Bnip3隨之激活,出現(xiàn)線粒體分裂與自噬過度,導(dǎo)致線粒體代謝紊亂、ATP短缺與細(xì)胞壞死;重新引入DUSP1即可減弱Drp1與Bnip3的表達(dá),改善呼吸參數(shù),維持能量平衡從而逆轉(zhuǎn)細(xì)胞活力［22］。Lu等［23］的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),DUSP1過表達(dá)可促進(jìn)Parkin表達(dá),減少活性氧的產(chǎn)生并改善線粒體功能。總之,DUSP1通過參與線粒體裂變,調(diào)節(jié)Parkin、Bnip3介導(dǎo)的線粒體自噬從而在損傷中發(fā)揮防御作用。

3 線粒體自噬與DN

線粒體是所有細(xì)胞的動力,還可誘導(dǎo)線粒體生物發(fā)生以調(diào)控能量平衡［24］。腎細(xì)胞中線粒體含量豐富,近端小管細(xì)胞的線粒體含量最高,線粒體氧化磷酸化產(chǎn)生的ATP為各種物質(zhì)的重吸收提供了足夠的動力,而足細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和系膜細(xì)胞則主要依賴糖酵解供能。Coughla等［25］的試驗(yàn)指出,DN中線粒體功能受損早于蛋白尿和腎組織學(xué)變化出現(xiàn)。在糖尿病早期,腎激活線粒體自噬以求清除受損線粒體。隨著DN的進(jìn)展,Drp1持續(xù)激活,線粒體裂變增加但融合與自噬受阻,線粒體外膜破裂,受損線粒體碎片積累并加劇了ATP缺乏;持續(xù)高糖環(huán)境致使電子的產(chǎn)生增加,多余的電子被傳遞至氧氣,形成活性氧的前體O2-,導(dǎo)致線粒體活性氧生成增加,當(dāng)活性氧的產(chǎn)生超過了抗氧化機(jī)制的中和,就會導(dǎo)致內(nèi)皮損傷、足細(xì)胞骨架的重組、系膜擴(kuò)張,濾過屏障被破壞導(dǎo)致蛋白尿的出現(xiàn);細(xì)胞膜電位持續(xù)降低,反而提供自噬信號,引起線粒體自噬紊亂,加速DN進(jìn)程［26-28］。因此,線粒體自噬是DN發(fā)病的關(guān)鍵媒介。

3.1足細(xì)胞與線粒體自噬足細(xì)胞需要大量能量來合成細(xì)胞骨架與ECM以支持腎小球毛細(xì)血管,因此對線粒體功能極其敏感。持續(xù)性高糖環(huán)境會觸發(fā)線粒體損傷與碎片化,抑制自噬溶酶體的形成,并加速氧化應(yīng)激與足細(xì)胞損傷、凋亡。高血糖使Drp1活性增加并向線粒體募集,在絲氨酸600位點(diǎn)磷酸化后啟動線粒體分裂,線粒體的平均大小和周長顯著減少,而活性氧生成增多使線粒體功能紊亂,足細(xì)胞氧化呼吸顯著受限,肌動蛋白細(xì)胞骨架發(fā)生重塑;PINK1與LC3的共定位減少,線粒體自噬受阻,出現(xiàn)足細(xì)胞凋亡,下調(diào)Parkin后足細(xì)胞凋亡進(jìn)一步增強(qiáng)［29-31］。Zheng等［32］的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),高糖可以增加糖尿病小鼠足細(xì)胞中SRC的磷酸化水平,抑制FUNDC1介導(dǎo)的線粒體自噬;使用SRC抑制劑干預(yù)有助于逆轉(zhuǎn)自噬通量并恢復(fù)膜電位,阻抑足細(xì)胞凋亡,從而降低血肌酐、尿白蛋白水平,而在FUNDC1耗盡后SRC抑制劑卻無法保護(hù)足細(xì)胞。TXNIP與氧化應(yīng)激、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)以及足細(xì)胞表型有關(guān),敲除TXNIP可通過抑制mTOR活化從而減輕高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞nephrin、synaptopodin等表型改變和活性氧生成,破壞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化,保護(hù)糖尿病小鼠免受足細(xì)胞耗竭［33］。此外,PINK1介導(dǎo)的線粒體自噬與足細(xì)胞中胰島素信號傳導(dǎo)有關(guān),在高糖處理的足細(xì)胞中PINK1表達(dá)下調(diào),導(dǎo)致白蛋白的通透性顯著增加,足細(xì)胞對葡萄糖的攝取受限,使得胰島素信號通路失調(diào)［34］。以上研究表明PINK1/Parkin、FUNDC1/SRC、TXNIP介導(dǎo)的線粒體自噬是足細(xì)胞防御機(jī)制,旨在減輕氧化應(yīng)激,恢復(fù)膜電位,以及維持胰島素信號傳導(dǎo)和足細(xì)胞的適當(dāng)通透性。

3.2系膜細(xì)胞與線粒體自噬系膜細(xì)胞約占腎小球細(xì)胞的三分之一,在腎小球毛細(xì)血管袢之間構(gòu)成支撐框架,并通過改變血管形狀而影響腎血流［35］。高血糖會誘發(fā)系膜細(xì)胞分泌過量膠原蛋白和纖連蛋白促使ECM大量積聚,隨后系膜擴(kuò)張、喪失活力并阻塞毛細(xì)血管,導(dǎo)致系膜纖維化發(fā)生,線粒體自噬與上述過程密切相關(guān)［36］。系膜細(xì)胞中Drp1在高糖誘導(dǎo)的6 h內(nèi)上調(diào)并異位至線粒體維持36 h,生成的過多活性氧促進(jìn)了ECM的產(chǎn)生［37］。Wei等［38］指出,高糖培養(yǎng)的系膜細(xì)胞LC3陽性表達(dá)率降低,而活性氧、纖連蛋白的生成與mTOR的活化增加,促進(jìn)白細(xì)胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α等炎性因子轉(zhuǎn)錄,引起線粒體自噬受阻,發(fā)生系膜增殖與纖維化。Chen等［39］的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),高糖處理的小鼠系膜細(xì)胞中SRC磷酸化的時間增加并伴隨膠原蛋白IV積聚,使用SRC抑制劑即可阻斷膠原蛋白IV合成,開啟FUNDC1介導(dǎo)的線粒體自噬并預(yù)防DN與纖維化。盡管目前研究較少,但靶向線粒體自噬的抗系膜纖維化作用,深入研究SRC、mTOR等相關(guān)通路有望出現(xiàn)延緩DN進(jìn)展的新思路。

3.3內(nèi)皮細(xì)胞與線粒體自噬腎小球內(nèi)皮細(xì)胞依靠獨(dú)特的窗孔特征以及糖萼蛋白發(fā)揮濾過功能,與足細(xì)胞損傷相比,內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙和糖萼損傷與蛋白尿的關(guān)系更密切。糖尿病患者存在廣泛的內(nèi)皮窗孔與糖萼減少,持續(xù)的高血糖環(huán)境使一氧化氮的產(chǎn)生受阻,誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激增強(qiáng),促進(jìn)血管炎癥與動脈硬化,微量白蛋白尿?qū)е聝?nèi)皮進(jìn)一步受損,出現(xiàn)多種大血管和微血管并發(fā)癥［40］。內(nèi)皮細(xì)胞能量需求相對較低,其線粒體主要發(fā)揮對環(huán)境信號的響應(yīng)的作用。線粒體自噬是內(nèi)皮細(xì)胞的適應(yīng)性反應(yīng),促進(jìn)自噬可改善血管功能,延緩內(nèi)皮細(xì)胞衰老,而自噬基因缺陷會導(dǎo)致毛細(xì)血管稀薄［41］。在高糖培養(yǎng)下,內(nèi)皮細(xì)胞Drp1、PINK和Parkin表達(dá)降低,靶向照射內(nèi)皮細(xì)胞線粒體誘導(dǎo)的氧化損傷可促進(jìn)Parkin向去極化線粒體轉(zhuǎn)移,使LC3-II的形成增加,膜電位升高,從而延長內(nèi)皮細(xì)胞的壽命［42-43］?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),腎小球存在足細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞串?dāng)_,內(nèi)皮細(xì)胞線粒體自噬缺陷會導(dǎo)致窗孔結(jié)構(gòu)缺失和足細(xì)胞耗竭［44］。內(nèi)皮細(xì)胞損傷是造成足細(xì)胞凋亡和腎小球硬化的必要條件,反過來足細(xì)胞凋亡也會導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞線粒體自噬失調(diào)和氧化應(yīng)激［45］。線粒體自噬可以保護(hù)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞抵抗高糖造成的損傷,并在腎小球細(xì)胞間串?dāng)_間發(fā)揮重要作用,未來側(cè)重探索線粒體自噬、氧化應(yīng)激在延緩內(nèi)皮衰老及參與足細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞串?dāng)_等方面可能有助于DN的治療。

3.4小管細(xì)胞與線粒體自噬小管細(xì)胞占皮質(zhì)的90%,對離子的重吸收依賴線粒體主動轉(zhuǎn)運(yùn)。DN研究的焦點(diǎn)已漸漸由腎小球病變轉(zhuǎn)移至腎小管損傷,包括腎小管炎癥、萎縮與間質(zhì)纖維化。在DN早期,高糖改變了血流動力學(xué),使近端小管過度重吸收,輸送至致密斑和遠(yuǎn)端腎單位的鈉減少,管球反饋下調(diào),近端小管缺氧導(dǎo)致線粒體斷裂和ATP生成降低,最終小管坍塌萎縮。暴露在高糖環(huán)境48 h之內(nèi)的近端小管細(xì)胞即出現(xiàn)膜電位喪失、線粒體腫脹碎裂與線粒體活性氧增加,PINK1/Parkin通路受抑［46］。隨著DN進(jìn)程,腎小管損傷的加劇,腎DUSP1、Nix表達(dá)隨之降低,自噬體的形成顯著受阻,受損線粒體聚集導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞的早衰和腎功能障礙;而過表達(dá)DUSP1與Nix即可恢復(fù)自噬通量,改善線粒體自噬功能,并減少活性氧的產(chǎn)生與小管細(xì)胞凋亡［47-48］。DN晚期,腎小管間質(zhì)、腎小球的損傷形成纖維化,線粒體自噬與纖維化過程中細(xì)胞凋亡、炎性細(xì)胞浸潤和氧化應(yīng)激等機(jī)制的失衡有關(guān)。高糖導(dǎo)致腎小管細(xì)胞線粒體嵴破壞嚴(yán)重,自噬清除減少而氧化應(yīng)激過度,表現(xiàn)為LC3、BNIP3、線粒體活性氧的增加與ATP產(chǎn)生率下降,而抑制LC3的表達(dá)并逆轉(zhuǎn)高糖對ATP生成率的抑制后,腎間質(zhì)膠原與ECM的生成也隨之減少［49-50］。Txnip敲低可以抑制BNIP3過表達(dá)導(dǎo)致的自噬性死亡,改善小管細(xì)胞中高糖誘導(dǎo)的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化,抑制白細(xì)胞介素-1β與半胱氨酸蛋白酶-1等炎性因子的轉(zhuǎn)錄從而延緩小管間質(zhì)纖維化［51］。Chen等［52］的研究發(fā)現(xiàn),DN患者OPTN水平與白細(xì)胞介素-1β/18、核苷酸結(jié)合域樣受體蛋白3等炎性因子呈負(fù)相關(guān),OPTN通過結(jié)合泛素化底物并通過LIR將其轉(zhuǎn)運(yùn)到自噬體,促進(jìn)PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬,抑制炎性小體的激活從而減輕小管間質(zhì)炎癥。腎小管病變在DN的病理過程中逐漸得到重視,線粒體損傷出現(xiàn)時間早,靶向PINK1/Parkin、DUSP1、Nix/ BNIP3、TXNIP等線粒體自噬相關(guān)通路可能是預(yù)防和治療DN腎小管病變的一種新的治療策略。

4 總 結(jié)

由于腎固有細(xì)胞對線粒體的依賴,線粒體在DN中處于關(guān)鍵地位。線粒體自噬在緩解炎癥反應(yīng)與細(xì)胞衰老、維持濾過屏障的完整、抑制腎纖維化等方面潛力無窮。了解DN中線粒體自噬的病理生物學(xué),選擇性調(diào)節(jié)線粒體自噬因子,包括OPTN、Txnip、SRC和DUSP1等,將有助于新治療方案的開發(fā)。然而針對自噬機(jī)制的研究仍處于單一階段且多為動物研究,信號通路之間的相互作用仍是未知,DN的線粒體自噬的藥理學(xué)研究仍處于初級階段,臨床上也缺乏易于檢測自噬的標(biāo)志物與靶向自噬的藥物,如何正確利用這把“雙刃劍”將成為醫(yī)學(xué)工作者的新挑戰(zhàn)。