MALDI-TOF技術(shù)在重癥肺炎痰液樣本病原菌檢測(cè)和鑒定中的應(yīng)用

劉亞榮 羅軍 李冰瑤

（1. 電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬綿陽醫(yī)院，四川 綿陽 621000；2. 綿陽市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，四川 綿陽621000）

重癥肺炎作為一種常見的急危重癥，具有發(fā)病率高、病情進(jìn)展迅速等特點(diǎn)，易危及患者生命安全[1]。重癥肺炎多由毒力極強(qiáng)的革蘭陽性或陰性菌感染所致，病情嚴(yán)重，進(jìn)展迅速，常發(fā)生各種嚴(yán)重并發(fā)癥，如不及時(shí)救治，可危及生命。因此，快速檢測(cè)鑒定重癥肺炎患者病原菌類型，以采取針對(duì)性抗生素治療成為臨床備受關(guān)注的問題[2]。傳統(tǒng)的病原菌鑒定通常采用菌落形態(tài)、染色、顯微鏡檢查、趨向性試驗(yàn)以及自動(dòng)化鑒定儀等鑒定方法，但其操作過程繁瑣、鑒定時(shí)間過長(zhǎng)、主觀性較強(qiáng)，不能及時(shí)提供病原學(xué)診斷結(jié)果。因此，尋找一種快速、可靠的病原菌鑒定方法對(duì)臨床病原學(xué)診斷具有重要意義?；|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間（Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight，MALDI-TOF）技術(shù)是近年來飛速發(fā)展起來的一種新型軟電離質(zhì)譜技術(shù)，主要用于微生物鑒定，MALDI-TOF技術(shù)主要原理是利用不同菌種核糖體蛋白大小存在差異，通過檢測(cè)病原菌保守且獨(dú)特的蛋白峰特征性質(zhì)圖譜，將檢測(cè)所得圖譜與已知菌種數(shù)據(jù)庫參考圖譜作對(duì)比，以得到病原菌鑒定結(jié)果[3,4]。該技術(shù)具有方便、快速、高通量、特征性強(qiáng)且實(shí)驗(yàn)成本較低等優(yōu)點(diǎn)，已在微生物領(lǐng)域尤其是細(xì)菌鑒定中得到廣泛運(yùn)用[5]。然而目前該技術(shù)在肺炎痰液樣本病原菌臨床檢測(cè)中應(yīng)用研究較少，對(duì)此，本研究通過將MALDI-TOF技術(shù)與VITEK-2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)（VITEK 2 Compact automatic microbial analyze，VITEK-2）鑒定技術(shù)進(jìn)行比較，以觀察MALDI-TOF技術(shù)在重癥肺炎痰液樣本病原菌檢測(cè)和鑒定中的實(shí)際應(yīng)用效果，旨在為臨床及時(shí)進(jìn)行抗感染治療提供有利參考，現(xiàn)將其過程整理報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取我院2021年7月至2021年12月收治的214例重癥肺炎患者為研究對(duì)象，其中男126例，女88例；平均年齡44.17±11.62 歲；平均病程4.81±0.74 d。

納入標(biāo)準(zhǔn)：診斷為重癥肺炎患者[6]；患者均進(jìn)行痰液樣本培養(yǎng)、檢測(cè)；患者了解并愿參與此次研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：惡性腫瘤患者；合并血液系統(tǒng)性疾病者；感染病患者。本研究經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 基因測(cè)序

提取晨起時(shí)患者痰液樣本病原菌菌株，使用DNA提取試劑盒（賽默飛世爾科技(中國)有限公司）提取病原菌菌株DNA，將提取的DNA使用核酸溶度測(cè)定儀進(jìn)行測(cè)序，操作方法嚴(yán)格按試劑盒以及儀器說明書進(jìn)行，結(jié)果與基因庫NCBI GenBank已知序列同源性比較，確定病原菌種類。

1.2.2 全自動(dòng)微生物鑒定VITEK-2技術(shù)鑒定

將痰液樣本病原菌菌株接種至瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)24 h，選取單一菌落進(jìn)行革蘭染色，根據(jù)其病原菌生長(zhǎng)特征和染色性，由梅里埃VITEK-2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果與配套的GN鑒定板進(jìn)行對(duì)比，確定病原菌種類，鑒定方法選擇嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)室操作說明書進(jìn)行。

1.2.3 MALDI-TOF技術(shù)鑒定

挑取痰液樣本病原菌菌落，不要帶有任何瓊脂，靶板涂抹，涂一個(gè)點(diǎn)位或兩個(gè)點(diǎn)位后立刻加入 1 μLα-氰 基-4-羥 基 肉 桂 酸（α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid，CHCA）基質(zhì)，同時(shí)涂點(diǎn)樣校準(zhǔn)菌株大腸埃希菌 ATCC 8739，待樣本干燥后，使用梅里埃MALDI-TOF生物質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)，操作方法參考儀器說明書。檢測(cè)結(jié)果與MALDI Biotyper 3.0數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，樣本圖譜與數(shù)據(jù)庫中的相應(yīng)菌株圖譜高度相似時(shí)確定病原菌種類。其他注意事項(xiàng)：所有操作過程均應(yīng)遵守實(shí)驗(yàn)室生物安全要求以及相應(yīng)無菌操作；涂菌時(shí)注意涂菌量，過多或過少均會(huì)影響鑒定結(jié)果；每個(gè)靶板有48個(gè)點(diǎn)位，16個(gè)點(diǎn)位為一組，可分3次使用，每組中心的小點(diǎn)位用于涂校準(zhǔn)菌株。

1.3 觀察指標(biāo)

①以基因測(cè)序法為“金標(biāo)準(zhǔn)”，比較兩種檢測(cè)方法對(duì)病原菌的鑒定結(jié)果。②對(duì)比其他兩種檢測(cè)技術(shù)對(duì)病原菌的鑒定率。③對(duì)比其他兩種檢測(cè)技術(shù)對(duì)病原菌的鑒定結(jié)果的差異性，包括對(duì)病原菌的鑒定準(zhǔn)確率、漏診率、誤診率，其中鑒定準(zhǔn)確率=已鑒定出的正確菌群數(shù)量/菌群總數(shù)量×100%，漏診率=未鑒定出的菌群數(shù)量/菌群總數(shù)量×100%，誤診率=鑒定錯(cuò)誤菌群數(shù)量/菌群總數(shù)量×100%。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料使用例（n）或百分?jǐn)?shù)（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三種檢測(cè)方法對(duì)病原菌的鑒定結(jié)果

三種檢測(cè)方法對(duì)金黃葡萄球菌、表皮葡萄球菌、頭部葡萄球菌、孔氏葡萄球菌、糞腸球菌、銅綠假單胞桿菌、肺炎克雷伯桿菌、不動(dòng)桿菌、大腸埃希菌、陰溝腸桿菌、嗜麥芽桿菌、其他類型病菌等病原菌的鑒定結(jié)果見表1。

表1 三種檢測(cè)方法對(duì)病原菌的鑒定結(jié)果（n（%））

2.2 兩種檢測(cè)技術(shù)對(duì)病原菌的鑒定率比較

兩種檢測(cè)技術(shù)對(duì)病原菌各類菌種的鑒定率比較見表2。

表2 兩種檢測(cè)技術(shù)對(duì)病原菌的鑒定率比較（n（%））

表3 兩種檢測(cè)技術(shù)對(duì)病原菌的鑒定結(jié)果差異比較（n（%））

2.3 兩種檢測(cè)技術(shù)對(duì)病原菌的鑒定結(jié)果差異比較

MALDI-TOF技術(shù)對(duì)重癥肺炎痰液樣本病原菌的總鑒定率明顯高于VITEK-2技術(shù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），兩組檢測(cè)技術(shù)漏診率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），MALDI-TOF技術(shù)對(duì)重癥肺炎痰液樣本病原菌誤診率明顯低于VITEK-2技術(shù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

臨床研究指出MALDI-TOF技術(shù)能快速、準(zhǔn)確地鑒定出病原菌病原學(xué)信息，且實(shí)驗(yàn)成本較低，在臨床檢測(cè)和鑒定中存在一定優(yōu)勢(shì)[7]。在本次研究中，MALDI-TOF技術(shù)對(duì)重癥肺炎患者痰液樣本病原菌鑒定準(zhǔn)確率明顯高于VITEK-2技術(shù)，這與孟令緣等[8]研究結(jié)論相類似。分析其原因，MALDI-TOF技術(shù)通過將痰液病原菌樣本和CHCA基質(zhì)混合，利用激光作為能量來源，輻射病原菌標(biāo)本與基質(zhì)共結(jié)晶，基質(zhì)吸收激光能量傳遞給病原菌蛋白質(zhì)，使其發(fā)生電離；因離子飛行時(shí)間與質(zhì)量呈正比，經(jīng)過飛行時(shí)間檢測(cè)期，到達(dá)檢測(cè)器后，根據(jù)不同離子飛行時(shí)間的不同而形成質(zhì)量圖譜，再將其與質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)庫的已知特征質(zhì)譜圖作對(duì)比，篩選并確定特異性圖譜，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)病原菌的區(qū)分和鑒定[9,10]。

MALDI-TOF技術(shù)以病原菌表面蛋白為檢測(cè)對(duì)象，受培養(yǎng)基、培養(yǎng)時(shí)間以及其他培養(yǎng)條件等外部因素影響較小，具有較好的穩(wěn)定性和可重復(fù)性；還能對(duì)未經(jīng)純化的樣本進(jìn)行檢測(cè)鑒定，節(jié)省了培養(yǎng)時(shí)間，使得臨床醫(yī)師可根據(jù)鑒定結(jié)果，及時(shí)為患者提供抗生素治療[11]。本研究結(jié)果顯示，兩組檢測(cè)技術(shù)漏診率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但MALDI-TOF技術(shù)對(duì)重癥肺炎痰液樣本病原菌鑒定誤診率明顯低于VITEK-2技術(shù)，這與李曲文等[12]研究結(jié)果相類似。這可能是因?yàn)樵谥匕Y肺炎痰液樣本中，病原菌復(fù)雜，且存在其他大量干擾物質(zhì)，使得廣譜采集不準(zhǔn)確，進(jìn)而影響MALDI-TOF技術(shù)檢測(cè)敏感度。實(shí)際檢測(cè)可通過樣本通過濃縮、微量化等步驟在提高其敏感度，但卻會(huì)以增加樣本處理時(shí)間和成本為代價(jià)。并且在實(shí)際臨床檢測(cè)過程中，VITEK-2技術(shù)還可進(jìn)行相應(yīng)藥敏測(cè)試分析，以檢測(cè)病原菌對(duì)相應(yīng)抗菌藥物的耐藥情況，而MALDI-TOF技術(shù)無法分析病原菌對(duì)抗菌藥物的敏感情況，無法為臨床急性靶向抗感染治療提供準(zhǔn)確的藥物使用方案。綜上所述，在重癥肺炎痰液樣本病原菌檢測(cè)和鑒定中，MALDI-TOF技術(shù)能快速為臨床提供高度可信的病原菌鑒定結(jié)果。然而該檢測(cè)技術(shù)還存在一定不足之處，因無法代替經(jīng)典的抗菌藥物敏感性試驗(yàn)，僅能為臨床做出一定的抗感染指導(dǎo)，無法為臨床醫(yī)生急性靶向抗感染治療提供準(zhǔn)確依據(jù)。