Slc7a11通過E-cadherin/β-catenin信號通路誘導自噬促進乳腺癌細胞侵襲轉移的作用機制研究#

李曉華 郭欣怡

（1. 福建醫(yī)科大學附屬福州市第一醫(yī)院乳腺外科，福建 福州 350009；2. 福建醫(yī)科大學附屬協(xié)和醫(yī)院普通外科，福建 福州 350009）

乳腺癌是全世界婦女常見的惡性腫瘤之一，在我國女性惡性腫瘤中的發(fā)病率也排在第一位[1]。細胞遷移和侵襲在乳腺癌中已被腫瘤研究者廣泛研究，具體發(fā)生機制尚未可知，所以對其遷移侵襲的機制值得我們深入探討。細胞黏附分子的異常表達意味著腫瘤的侵襲轉移[2]，整合素家族、選擇素家族，免疫球蛋白超家族及鈣黏素超家族這些都屬于與細胞遷移相關的黏附分子。E-鈣黏蛋白（E-cadherin）主要在各種上皮組織中表達，是參與細胞之間黏附連接的Ca2+依賴性跨膜糖蛋白，它通過與β-連環(huán)蛋白（β-catenin）形成穩(wěn)定的復合物發(fā)揮相互黏附作用，抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲[3]。重組蛋白溶質載體家族7成員11（Solute carrier family7 member11，Slc7a11）位于細胞膜上，它的主要作用是將胞外的胱氨酸轉運到胞內，胱氨酸在胞內迅速被還原為半胱氨酸[4]。多項研究表明[5,6]，Slc7a11在乳腺癌組織中的高表達在介導乳腺癌細胞鐵死亡方面發(fā)揮著重要作用。目前關于Slc7a11促進乳腺癌細胞侵襲和轉移的機制尚未有研究，Slc7a11與介導腫瘤細胞侵襲和轉移高度相關的E-cadherin/β-catenin信號通路是否有關也尚未可知。本研究擬通過Slc7a11在人乳腺癌細胞中，對遷移及黏附分子相關蛋白表達的調控情況，探討Slc7a11對人乳腺癌細胞侵襲遷移的影響，為臨床上治療乳腺癌腫瘤提供參考價值

1 材料與方法

1.1 細胞

人乳腺癌細胞系MDA-MB-231于中國科學院細胞庫上海生命科學研究院生化與細胞研究所購入。

1.2 儀器與試劑

高糖 DMEM(Dulbecco's modified eagle medium，DMEM）培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、胰酶消化液及青霉素-鏈霉素抗生素均購自Gibco公司，二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxid，DMSO）和兔甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）單克隆抗體購自Sigma公司，E-cadherin（Cat No：3195）和兔單克隆抗體β-catenin（Cat No：8480）購自美國CST公司，Slc7a11-PCDNA3.1-FLAG過表達質粒由安徽通用生物股份有限公司合成，其中耗材包含Transwell小室（8 μm）、24孔板、培養(yǎng)皿（美國Coring公司），儀器包含Bio-Rad成像儀、Thermo CO2培養(yǎng)箱、尼康倒置相差顯微鏡。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)與轉染

人乳腺癌細胞系MDA-MB-231用含10%胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、1%青霉素-硫酸鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中放置在37℃、5%二氧化碳（Carbon dioxide，CO2）培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，每天在顯微鏡下觀察生長情況，密度達到85%即可傳代。凍存一定數(shù)量的人乳腺癌細胞后，可進行轉染實驗，先將MDA-MB-231少量接種于6孔板中，觀察細胞生長密度達到80%后用Slc7a11-PCDNA3.1-FLAG轉染質粒，其中一組轉染過表達Slc7a11-PCDNA3.1-FLAG質粒（Slc7a11過表達組），一組轉染sh-Slc7a11質粒（干擾Slc7a11表達組），一組不轉染質粒作為對照組，其余實驗操作保持一致。每孔轉染4 μg，并用新霉素篩選陽性克隆用于后續(xù)實驗。

1.3.2 Western blotting檢測

細胞在六孔板中長滿后提取細胞總蛋白，加入上樣緩沖液后渦旋30 s混勻后，將金屬煮沸儀調至95℃，加熱樣品5 min，使蛋白煮沸變性，酶標儀測定計算蛋白濃度。Western blotting免疫印記操作步驟如下：每孔上樣量為30 μg，進行SDS-PAGE電泳1 h，結束后進行轉膜，提前裁剪好適宜大小的聚偏二氟乙烯膜（Polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，轉膜時調節(jié)電壓為120 V恒壓轉移至PVDF膜 1 h，用5%的脫脂奶粉放在搖床上均勻封閉1 h，封閉結束后TBST洗膜進行裁剪，然后加入一抗（1:1000）放置4℃冰箱中孵育過夜，第二天以TBST洗膜3次，每次10 min，加入二抗（1:10000）在室溫搖床上孵育2 h，以化學發(fā)光法顯影。

1.3.3 遷移實驗

遷移實驗前一天先用無血清培養(yǎng)基饑餓細胞24 h。用胰酶消化細胞，當在顯微鏡下細胞形態(tài)縮小有少量飄起立刻用培養(yǎng)基終止消化，離心并小心吸棄上層培養(yǎng)液，用磷酸緩沖鹽溶液（Phosphate buffered saline，PBS）清洗兩遍，用無血清培養(yǎng)基重懸后在顯微鏡下計數(shù)，調整細胞密度至2×105個·mL-1。取200μL細胞懸液加入24孔板Transwell小室的上室，下室加入500 μL含20% FBS的高糖培養(yǎng)基，放置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，取出Transwell小室用4%的多聚甲醛溶液室溫固定15 min，吸棄多聚甲醛溶液并加入0.5 mL的結晶紫溶液染色30min，用棉球將上室細胞擦去后在顯微鏡下觀察，隨機選取6個視野記錄遷移細胞數(shù)量。

1.3.4 侵襲實驗

人乳腺癌細胞用胰酶消化后，用無血清DMEM培養(yǎng)基終止消化，調整細胞密度為1×105個·mL-1。在Transwell小室中鋪好基質膠，下室加入含20%FBS的高糖培養(yǎng)基500 μL，上室加入200μL細胞懸液。放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h后，用4%多聚甲醛溶液室溫固定15 min，吸棄多聚甲醛溶液并加入0.5 mL的結晶紫溶液染色30 min，用棉球將上室細胞擦去后在顯微鏡下觀察，隨機選取6個視野并記錄侵襲細胞數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以均值±標準差（±SD）表示，組間兩兩比較采用t檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)（%）表示，采用χ2檢驗。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 過表達Slc7a11促進乳腺癌細胞的侵襲和轉移

Western blotting 實驗結果顯示，與對照組比較，過表達Slc7a11組E-cadherin和β-catenin蛋白表達明顯降低（P＜0.05）。Transwell小室細胞體外遷移侵襲實驗發(fā)現(xiàn)，穿過細胞小室的細胞數(shù)量明顯升高（P＜0.05）。見表1。

表1 Slc7a11 基因過表達后對MDA-MB-231細胞侵襲轉移的影響（±SD，n=3）

表1 Slc7a11 基因過表達后對MDA-MB-231細胞侵襲轉移的影響（±SD，n=3）

注：與對照組相比，*P＜0.05。

分組 細胞遷移數(shù)(個) 細胞侵襲數(shù)(個) Slc7a11 E-cadherin β-catenin對照組 108.00±11.67 79.99±11.99 1.00±0.04 1.03±0.05 1.10±0.06 Slc7a11過表達組 309.67±12.50* 287.33±11.70* 3.80±0.02* 0.43±0.05* 0.67±0.09*

2.2 干擾Slc7a11促進MDA-MB-231細胞的侵襲和轉移

Transwell小室細胞體外遷移侵襲實驗和Western blotting檢測結果顯示，與對照組比較，干擾Slc7a11組E-cadherin和β-catenin蛋白表達明顯升高（P＜0.05），穿過細胞小室的細胞量明顯降低（P＜0.05）。見表2。

表2 干擾SLC7A11基因表達后對MDA-MB-231細胞侵襲轉移的影響（±SD，n=3）

表2 干擾SLC7A11基因表達后對MDA-MB-231細胞侵襲轉移的影響（±SD，n=3）

注：與對照組相比，*P＜0.05。

分組 細胞遷移數(shù)(個) 細胞侵襲數(shù)(個) Slc7a11 E-cadherin β-catenin對照組 262.337±12.05 214.33±12.05 1.00±0.04 1.00±0.05 1.10±0.05干擾Slc7a11表達組 60.33±12.50* 46.67±13.94* 0.41±0.03* 1.73±0.10* 1.61±0.03*

2.3 過表達Slc7a11誘導乳腺癌細胞自噬水平

MDA-MB-231細胞過表達Slc7a11后，自噬相關基因Beclin-1和LC3II的表達明顯上調（P＜0.05），p62表達明顯降低（P＜0.05）。詳見表3。

表3 Slc7a11 基因過表達后對MDA-MB-231細胞自噬蛋白的影響（±SD，n=3）

表3 Slc7a11 基因過表達后對MDA-MB-231細胞自噬蛋白的影響（±SD，n=3）

注：與對照組相比，*P＜0.05。

分組 Slc7a11 Beclin-1 LC3II p62對照組 1.00±0.04 1.03±0.20 1.09±0.18 1.03±0.08 Slc7a11過表達組 0.41±0.03* 1.67±0.21* 1.76±0.02* 0.63±0.27*

3 討論

惡性腫瘤后期表現(xiàn)為易擴散且易轉移，因此臨床上腫瘤患者常常治療無果，需要繼續(xù)二線治療。當外界各種理化刺激因素或者自身致病因素導致同質細胞間黏附性降低時，腫瘤細胞都有可能從瘤塊脫落并向其他部位遷移，從局限期轉變?yōu)閺V泛期[7]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，在侵襲性的MDAMB-231中過表達Slc7a11，與對照組相比，Ecadherin和β-catenin兩個黏附蛋白明顯降低，侵襲轉移能力明顯升高；與此同時，自噬相關蛋白Beclin-1和LC3II的表達上調，而p62表達降低。當干擾Slc7a11基因時，E-cadherin和β-catenin蛋白表達明顯上升，侵襲轉移細胞數(shù)明顯降低。以上結果表明Slc7a11能夠調控細胞自噬促進乳腺癌細胞侵襲和轉移，其主要機制可能與其下調細胞黏附分子E-cadherin/β-catenin復合體表達有關。

據(jù)研究報道，鈣黏蛋白家族中的E-cadherin蛋白與β-catenin蛋白共同構成的E-cadherin/βcateninn復合體是完成細胞間黏附的重要黏附分子[8]。E-cadherin蛋白的表達與婦女乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關，且E-cadherin蛋白量表達越低，淋巴結轉移數(shù)量越多[9]，婦女乳腺癌轉移重要的生物學標志之一即E-cadherin蛋白表達的下調或缺失[10]，通過檢測E-cadherin蛋白表達情況來對早期乳腺癌患者的診斷并制定個體化治療方案具有重要的意義。如果通過干預使E-cadherin表達正?；蛱岣咂浔磉_，對腫瘤的侵襲轉移可以起到有效抑制作用，成為降低腫瘤初始治療后轉移復發(fā)的新的治療靶點。β-catenin作為一種可溶性蛋白在腫瘤細胞免疫抵抗中奠定了重要得生物學功能基礎，主要存在于細胞膜上，在細胞質則以游離型和結合型兩種形式存在。β-catenin在正常上皮細胞和非侵襲性腫瘤細胞中主要定位于細胞膜，在細胞質中存在少量游離的β-catenin，在經歷上皮-間質轉化的細胞中，β-catenin多分布于細胞質或細胞核，β-catenin在細胞質中的定位反映了其與E-cadherin的分離[11]。大量研究顯示，在包括乳腺癌在內的多種腫瘤中，E-cadherin和β-catenin都有不同程度的分布異常和表達下調[12,13]。因此，不少研究希望通過促進或調節(jié)E-cadherin和βcatenin的表達抑制腫瘤細胞的遷移與侵襲。

Slc7a11為谷胱甘肽的合成提供底物，主要參與調節(jié)氧化還原狀態(tài)、鐵死亡和細胞間信號傳導。研究表明，Slc7a11在多種癌組織中高表達，特別是在對化療和放療等治療有抵抗力的腫瘤中，被認為是一種重要的致癌蛋白，對腫瘤生長、侵襲、轉移和不良預后產生多重影響[14,15]。細胞自噬屬于Ⅱ型程序性細胞死亡，屬于機體抵御不良環(huán)境的一種自我保護機制，對維持細胞穩(wěn)定有著較好的作用。隨著生物學研究的不斷深入發(fā)現(xiàn)自噬在腫瘤發(fā)生、進展過程中起著關鍵作用，同時在腫瘤化療藥物細胞毒性也發(fā)揮作用。

本研究目前未能對Slc7a11促進乳腺癌細胞侵襲轉移的分子機制進行深入探索。目前研究只能說明Slc7a11有促進細胞自噬作用，而自噬又參與了乳腺癌侵襲轉移過程，但其具體的調控機制尚需進一步研究?；诖?，Slc7a11是一個非常有價值的靶點，可通過對其的抑制進而調控細胞自噬，抑制乳腺癌細胞的侵襲和轉移，達到增強抗癌治療效果。