甘草查爾酮膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究*

孫 宇，賈智超，張 娟，徐曉琴，卿德剛△

1 新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所，新疆 烏魯木齊 830002；

2 烏魯木齊市中醫(yī)醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830000

脹果甘草（Glycyrrhiza inflataBatal.）為多年生草本，具有重要的藥用價(jià)值，近年研究表明，甘草查爾酮類化合物為脹果甘草特色化合物，在其他種類甘草如烏拉爾甘草、光果甘草中未見含有或含量較少［1-5］。甘草查爾酮類化合物不僅具有抑菌、抗真菌、抗氧化活性，其對(duì)HIV病毒和某些癌細(xì)胞的抑制作用甚至超過(guò)了甘草三萜類物質(zhì)；甘草查爾酮也具有抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)作用［6-8］。本研究在承擔(dān)國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目已完成甘草查爾酮提取工藝研究及治療潰瘍性結(jié)腸炎藥理藥效實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)甘草查爾酮提取物的膠囊制劑進(jìn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。近年使用發(fā)現(xiàn)，僅參照藥典標(biāo)準(zhǔn)（含量測(cè)定為甘草苷和甘草酸銨）不便于區(qū)分各種甘草，有時(shí)會(huì)導(dǎo)致使用過(guò)程中出現(xiàn)質(zhì)量差異性問(wèn)題［9-10］，尤其在甘草黃酮或查爾酮類制品的鑒別及含量測(cè)定方面。本研究以前期進(jìn)行的脹果甘草化學(xué)成分分離為基礎(chǔ)，篩選特征性成分并建立甘草查爾酮膠囊薄層鑒別及含量測(cè)定方法，以期為甘草查爾酮膠囊質(zhì)量控制提供依據(jù)，為甘草查爾酮類物質(zhì)的新藥研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器Waters e2695高效液相色譜儀；Waters 2998PDA檢測(cè)器；色譜柱：Waters XTerra RP C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；Mettler AE163電子天平；KQ3200型超聲波清洗儀；乙腈為色譜純；水為超純水，其他試劑均為分析純。

1.2 試藥甘草查爾酮A對(duì)照品購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，含量≥98%（CAS號(hào)：58749-22-7，批號(hào)：20190605001）；甘草查爾酮膠囊供試品3批（20190510、20190511、20190512）及陰性樣品（僅由輔料制備而成）均由新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 供試品及對(duì)照品溶液制備 取甘草查爾酮膠囊內(nèi)容物0.02 g，加丙酮10 mL，超聲提取15 min，放冷，濾過(guò)，提取2次，合并丙酮液，蒸干，殘?jiān)? mL甲醇使溶解，作為供試品溶液。另取甘草查爾酮A對(duì)照品，用甲醇配制成每毫升含0.1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.1.2 薄層板活化 將硅膠G薄層板于105 ℃烘箱中干燥30 min，取出放入干燥器中備用。

2.1.3 薄層層析 按照《中華人民共和國(guó)藥典》2020版四部0502薄層色譜法試驗(yàn)，吸取供試品溶液3 μL，對(duì)照品溶液3 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以丙酮-異丙醇-甲苯-水-氨水（20∶6∶6∶3∶1）為展開劑，展開，取出，晾干。日光下檢視后置紫外燈（365 nm）下檢視，供試品色譜中在對(duì)照品相應(yīng)的位置上顯相同斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾。見圖1—2。

圖1 甘草查爾酮膠囊薄層色譜圖（日光）

圖2 甘草查爾酮膠囊薄層色譜圖（紫外燈365 nm）

2.2 甘草查爾酮A含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Waters XTerra RP C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-1%磷酸溶液（58∶42）；流速：l.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：310 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取甘草查爾酮A對(duì)照品適量，加甲醇溶解制成每1 mL含2.5 mg的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液制備 取甘草查爾酮膠囊內(nèi)容物約0.85 g精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入25 mL甲醇，精密稱重，超聲處理30 min，冷卻后用甲醇補(bǔ)充減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

圖3 甘草查爾酮膠囊及甘草查爾酮A對(duì)照品色譜圖

2.2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取濃度為2.5 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液各0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得對(duì)照品溶液。每次取10 μL依次進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。以質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，色譜峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得甘草查爾酮A回歸方程Y=9635.2X+5.8384（r=0.9999）。結(jié)果表明甘草查爾酮A在0.05125～0.5125 mg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液10 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算得RSD值為0.57%。

2.2.6 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取同一批樣品6份，制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定含量，結(jié)果甘草查爾酮A的平均值為4.4839 mg/g，RSD為1.47%。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液分別在制備后0、1、2、4、8、12 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得甘草查爾酮A峰面積RSD為1.54%，表明供試品在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的供試品6份，每份0.25 g，精密稱定，分別加入一定量對(duì)照品，按“2.2.3”項(xiàng)制備供試品溶液，取續(xù)濾液10 μL進(jìn)樣，計(jì)算回收率，RSD為1.62%。見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.2.9 樣品含量測(cè)定 分別取本品內(nèi)容物約1 g，精密稱定，按“2.2.3”項(xiàng)制備供試品溶液，取續(xù)濾液10 μL進(jìn)樣，按“2.2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，見表2。

表 2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n=9） mg/g

3 討論

在甘草查爾酮A薄層鑒別實(shí)驗(yàn)中，常見的文獻(xiàn)方法對(duì)展開劑的選擇較多，有以丙酮-氯仿（4∶6）及環(huán)己烷-乙酸乙酯（5∶9）作為展開劑［11］等多種方法，本研究通過(guò)反復(fù)對(duì)比，發(fā)現(xiàn)以丙酮-異丙醇-甲苯-水-氨水（20∶6∶6∶3∶1）為展開劑時(shí)分離度良好，陰性無(wú)干擾。

在樣品的處理過(guò)程中，分別采用了甲醇回流提取法、甲醇超聲提取法、丙酮超聲提取法等方法進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)使用甲醇超聲提取法效果好，而且雜質(zhì)干擾較小。在提取的過(guò)程中考察了超聲時(shí)間和甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，發(fā)現(xiàn)超聲提取30 min效果優(yōu)于10、20 min［12-13］。

甘草查爾酮A屬于黃酮類物質(zhì)，通過(guò)PDA檢測(cè)器得到其以甲醇為溶劑時(shí)的紫外最大吸收波長(zhǎng)為310 nm，故選擇紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為310 nm。

近年，由于國(guó)內(nèi)外對(duì)甘草中黃酮類物質(zhì)尤其是查爾酮類物質(zhì)的深入研究，使得這類物質(zhì)的醫(yī)院制劑及新藥產(chǎn)品不斷涌現(xiàn)，但在使用過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，有些產(chǎn)品參照藥典標(biāo)準(zhǔn)（含量測(cè)定為甘草苷和甘草酸銨）或靠重量法、總黃酮測(cè)定法進(jìn)行質(zhì)量控制，導(dǎo)致使用過(guò)程中出現(xiàn)質(zhì)量差異性問(wèn)題（研究表明烏拉爾甘草和光果甘草中查爾酮類物質(zhì)含量很低）［9-10］。

本研究建立了甘草查爾酮膠囊的薄層鑒別方法和甘草查爾酮A含量測(cè)定方法，結(jié)果表明，該方法簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確，重現(xiàn)性良好，靈敏度高，可為該藥物質(zhì)量控制的建立提供依據(jù)，也為全面研究及開發(fā)甘草查爾酮類藥物提供參考。