半夏厚樸湯治療咳嗽變異性哮喘的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

李 琦，唐以軍，王梅芳

湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬十堰市太和醫(yī)院，湖北 十堰 442000

咳嗽變異性哮喘（cough variant asthma，CVA）是以咳嗽為唯一或主要癥狀的哮喘亞型，是慢性咳嗽的主要病因。中國CVA患者在慢性咳嗽患病人數(shù)中占32.6%，高于西方國家和日本［1］。由于CVA沒有典型的臨床癥狀，在臨床診斷中容易被誤認(rèn)為呼吸道感染、支氣管炎、慢性咽炎等疾病，導(dǎo)致濫用抗生素、鎮(zhèn)咳藥物治療。CVA治療與哮喘類似，主要以糖皮質(zhì)激素、β2受體激動劑為主，起效快，但不良反應(yīng)較大。傳統(tǒng)中藥注重整體治療，具有應(yīng)用安全、有效、不良反應(yīng)小等優(yōu)勢。

半夏厚樸湯源自東漢張仲景《傷寒雜病論》，經(jīng)晉代王叔和重編后載于《金匱要略·婦人雜病脈證并治第二十二》。該方由半夏、厚樸、茯苓、生姜、蘇葉組成，全方辛苦合用行氣散結(jié)，降逆化痰。臨床用于治療各種情志不暢，痰氣互結(jié)所致的疾病，CVA為其中之一［2］。黃麗娜［3］、陳豪等［4］研究顯示半夏厚樸湯聯(lián)合特布他林治療CVA較單用特布他林能更快緩解患者咳嗽等呼吸道癥狀，降低血清嗜酸性粒細(xì)胞（eosinophil，EOS）、白細(xì)胞介素13水平，減輕氣道高反應(yīng)性，改善呼吸道炎癥情況。江麗平［5］、程娜娜等［6］研究顯示半夏厚樸湯聯(lián)合西藥治療CVA較單用西藥效果更優(yōu)，總有效率更高。盛梅［7］研究顯示半夏厚樸湯不僅能有效改善臨床療效，還能降低并發(fā)癥發(fā)生率，有臨床應(yīng)用價值。由于CVA的病理機(jī)制復(fù)雜，且中藥成分復(fù)雜，作用靶點廣泛，因此半夏厚樸湯治療CVA的靶點及分子機(jī)制尚不清楚。本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對半夏厚樸湯治療CVA的作用機(jī)制進(jìn)行研究，為其進(jìn)一步藥理作用研究及臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 半夏厚樸湯活性成分及靶點篩選以半夏、厚樸、茯苓、生姜、蘇葉為關(guān)鍵詞，通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)（http：//tcmspw.com/tcmsp.php），以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）＞30%，類 藥 性（drug-likeness，DL）＞0.18為條件，篩選出半夏厚樸湯的活性成分，通過TCSMP數(shù)據(jù)庫在線查詢篩選出的有效活性成分所對應(yīng)的相關(guān)靶點。然后使用UniProt數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/），物種限定為人，校正有效活性成分對應(yīng)的靶點，得到活性成分對應(yīng)的靶點基因名。

1.2 CVA靶點預(yù)測GeneCards數(shù)據(jù)庫是包含人類RNA基因、蛋白質(zhì)編碼基因、轉(zhuǎn)錄基因等基因組的綜合數(shù)據(jù)庫。登錄GeneCards（https：//www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫，檢索“cough variant asthma”，得到咳嗽變異性哮喘相關(guān)基因。將疾病靶基因與藥物靶基因輸入在線韋恩圖（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html），獲得疾病與藥物的共同靶點即半夏厚樸湯治療咳嗽變異性哮喘的潛在作用靶點。

1.3 半夏厚樸湯-活性成分-CVA靶點網(wǎng)絡(luò)圖將半夏、厚樸、茯苓、生姜、蘇葉的主要活性成分及其對應(yīng)的靶點與半夏厚樸湯治療CVA的潛在作用靶點進(jìn)行映射，然后將其導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件，得到半夏厚樸湯-活性成分-CVA靶點網(wǎng)絡(luò)。

1.4 蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將半夏厚樸湯治療CVA的潛在作用靶點輸入STRING（https：//string-db.org/cgi/input.pl）在線數(shù)據(jù)庫，種屬限定為“Homo sapiens”，最小連接評分（Combined score）為0.4，導(dǎo)出相應(yīng)結(jié)果文件。將所得文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件，利用軟件中的“Network Analyzer”工具，得到Degree值（連接度），根據(jù)Degree值調(diào)整節(jié)點的大小和顏色，獲得最終的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 基因富集分析DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）是一個整合了生物學(xué)數(shù)據(jù)和分析，為大規(guī)模的基因或蛋白列表提供系統(tǒng)綜合的生物功能注釋信息的生物信息數(shù)據(jù)庫。將靶點基因輸入DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫，限定物種為人，P＜0.05，對靶基因進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析和基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1 半夏厚樸湯活性成分共篩選出半夏厚樸湯活性成分44個，包括半夏13個、厚樸2個、茯苓15個、生姜5個、蘇葉14個，其中半夏、蘇葉、生姜有1個交集化合物，半夏、蘇葉有1個交集化合物，半夏、生姜有1個交集化合物，蘇葉、生姜有1個交集化合物。見表1。

表1 半夏厚樸湯活性成分基本信息

續(xù)表1

2.2 預(yù)測CVA靶點結(jié)果共得到CVA相關(guān)靶點基因2083個。利用在線工具Venny 2.1.0將CVA相關(guān)靶點基因與半夏厚樸湯靶點基因取交集，得到97個疾病-藥物共同靶點基因。

2.3 半夏厚樸湯-活性成分-CVA靶點網(wǎng)絡(luò)通過Cytoscape 3.7.1對97個疾病-藥物共同靶點基因與半夏厚樸湯的活性成分進(jìn)行映射，得到半夏厚樸湯-活性成分-CVA靶點網(wǎng)絡(luò)圖。網(wǎng)絡(luò)圖中共有133個節(jié)點，533條邊。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)原理計算后按度值排序，排前5名的活性成分分別是β-谷甾醇（beta-sitosterol）、木犀草素（luteolin）、豆甾醇（Stigmasterol）、β-胡蘿卜素（beta-carotene）、黃芩素（baicalein）。見圖1。

圖1 半夏厚樸湯-活性成分-CVA靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析將疾病-藥物97個共同靶點基因?qū)隨tring，獲取其相互作用關(guān)系，并導(dǎo)入Cytoscape中獲得相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)包括97個節(jié)點，1282條邊。圖中degree值越大節(jié)點越大，顏色越紅。Degree值大于50的節(jié)點共13個，按Degree值排序依次為血清白蛋白（albumin，ALB）、絲/蘇氨酸蛋白激酶1（serine/threoninekinase1，Akt1）、白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)、原癌基因（Fos protooncogene，F(xiàn)OS）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、原癌基因c（Jun protooncogene，JUN）、胱天蛋白酶3（Caspase-3，CASP3）、絲裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinases1，MAPK1）、禽髓細(xì)胞瘤病毒癌基因同源物（V-Myc avian myelocytomatosis viral oncogene homolog，MYC）、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（Prostaglandin-Endoperoxide Synthases 2，PTGS2）、細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1，CCND1）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase，MMP9）。見圖2。

圖2 半夏厚樸湯治療CVA的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 富集分析結(jié)果97個靶點經(jīng)GO富集分析共得到GO條目141個（P＜0.05），其中生物過程（biological process，BP）108個、分子功能（molecular function，MF）25個、細(xì)胞組成（cellular component，CC）8個。根據(jù)P值排序，通過每個模塊前5個條目（表2）。發(fā)現(xiàn)半夏厚樸湯可通過腺苷酸環(huán)化酶激活腎上腺素能受體信號通路、RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、外源性凋亡信號通路等生物學(xué)過程，蛋白質(zhì)同源二聚體激活、蛋白質(zhì)異源二聚體激活、腎上腺素結(jié)合、血紅素結(jié)合、α1腎上腺素能受體激活等分子功能，細(xì)胞核、原生質(zhì)膜、線粒體外膜、細(xì)胞外間隙等細(xì)胞組分治療CVA。KEGG通路富集分析得到97個P＜0.05的信號通路，主要在癌癥相關(guān)信號通路、HIF-1信號通路、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)信號通路、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號通路等通路富集，前20條通路見圖3。

表2 半夏厚樸湯治療CVA的GO分析結(jié)果

圖3 半夏厚樸湯治療CVA的KEGG代謝通路富集情況

3 討論

CVA與支氣管哮喘發(fā)病機(jī)制相似，主要是由多種炎癥細(xì)胞及細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病，其主要特征是氣道高反應(yīng)性和氣道重塑［8］。本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探究半夏厚樸湯治療CVA的作用機(jī)制，共收集半夏厚樸湯44個活性成分，排名前5的活性成分分別是β-谷甾醇、木犀草素、豆甾醇、β-胡蘿卜素、黃芩素，且它們的degree值均大于40，可能是半夏厚樸湯治療CVA的關(guān)鍵有效成分。β-谷甾醇是最常見的植物甾醇，膳食植物甾醇中β-谷甾醇占50%～65%，其結(jié)構(gòu)與膽固醇類似，已被證明具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤和平喘作用［9］。β-胡谷甾醇能減輕哮喘動物模型中EOS浸潤，降低白細(xì)胞介素4（interleukin-4，IL-4）、白細(xì)胞介素5（interleukin-5，IL-5）、TNF、活性氧（reactive oxygen species，ROS）等炎性因子和血清及肺泡灌洗液中免疫球蛋白E(immuno globulin E，IgE)水平，對氣道慢性炎癥具有保護(hù)作用。同時β-谷甾醇通過抑制細(xì)胞反應(yīng)和Th2型細(xì)胞因子的釋放/合成發(fā)揮平喘作用［10-11］。

木犀草素是一種天然的黃酮類化合物，存在于許多植物中，具有抗氧化、傷口愈合、抗糖尿病、抗炎、抗癌和抗菌等多種作用［12］。2003年DAS等［13］研究發(fā)現(xiàn)木犀草素可以降低卵清蛋白（ovalbumin，OVA）誘導(dǎo)的哮喘小鼠支氣管肺泡灌洗液（BALF）中IL-4、IL-5水平，增加干擾素γ（interferonγ，IFN-γ）水平，降低血清IgE水平，調(diào)節(jié)氣管支氣管收縮和支氣管高反應(yīng)性，減輕實驗小鼠的哮喘癥狀。隨后國內(nèi)外多項研究顯示木犀草素在治療哮喘中發(fā)揮重要作用。其可以通過抑制TLR4/NF-kB信號活化、抑制COX-2信號通路、調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡等多種途徑減少炎性細(xì)胞因子IL-4、IL-5、IL-6、TNF-α等的合成和分泌，緩解肺部炎癥反應(yīng)，通過降低血清特異性IgE水平降低哮喘氣道高反應(yīng)性［14-16］。

豆甾醇是植物甾醇的典型代表之一，研究發(fā)現(xiàn)其具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、降血糖、降膽固醇等作用［17］。ANTWI等［18］研究發(fā)現(xiàn)在OVA誘導(dǎo)的哮喘小鼠模型中，豆甾醇可減少嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞增殖，同時減少細(xì)支氣管周圍、血管周圍和肺泡周圍炎性細(xì)胞浸潤，抑制血清血管細(xì)胞黏附分子1（VCAM-1）和IgE的過度表達(dá)；組織病理學(xué)顯示豆甾醇可逆轉(zhuǎn)膠原沉積，抑制氣道重塑?？梢?，豆甾醇具有顯著的平喘作用，并對過敏原誘導(dǎo)哮喘的關(guān)鍵特征有抑制作用。

β-胡蘿卜素是維生素A的前體，能與含氧自由基作用發(fā)揮抗氧化、清除自由基作用。β-胡蘿卜素是人類膳食中維生素A的主要來源，主要在腸道內(nèi)被吸收，在腸黏膜中轉(zhuǎn)化為活性維生素A，被吸收入血，再通過血液運輸?shù)饺砥渌衅鞴伲l(fā)揮作用。大量研究表明［19］維生素A缺乏與哮喘密切相關(guān)。ALLEN S等［20］進(jìn)行的薈萃分析顯示哮喘患者的膳食維生素A攝入量低于非哮喘患者，重癥哮喘患者低于輕癥患者。TIAN等［21］的研究顯示新生兒肺炎鏈球菌感染后補(bǔ)充維生素A可以通過改變CD4+T細(xì)胞亞群抑制哮喘發(fā)展。李愛斌等［22］的研究顯示β-胡蘿卜素聯(lián)合布地奈德吸入劑治療哮喘，療效確切，β-胡蘿卜素抗氧化功能可增強(qiáng)機(jī)體免疫力，起到抗炎、協(xié)調(diào)免疫因子、改善呼吸功能的作用，從而提高治療效果。

黃芩素是從黃芩根部分離出來的一種天然黃酮類物質(zhì)，具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗血栓、抗腫瘤等作用［23］。研究發(fā)現(xiàn)黃芩素能降低OVA誘導(dǎo)的小鼠肺組織內(nèi)炎癥細(xì)胞數(shù)量，降低IL-1β、IL-4、IL-5水平及OVA特異性IgE、IgG1產(chǎn)生，能上調(diào)IFN-α水平，降低OVA誘導(dǎo)的氣道高反應(yīng)性（airway hyperreactivity，AHR）、氣道炎癥及氣道周圍膠原沉積，減輕哮喘癥狀［23-24］。通過分析藥物治療CVA的97個關(guān)鍵靶點，提示半夏厚樸湯治療CVA具有途徑多樣、靶點廣泛、功能豐富的特點。PPI網(wǎng)絡(luò)圖提示半夏厚樸湯治療CVA機(jī)制復(fù)雜，主要的靶蛋白有ALB、Akt1、IL-6、FOS、EGFR、VEGFA等。富集分析結(jié)果顯示，去除廣泛信號通路，半夏厚樸湯主要通過HIF-1信號通路、PI3K-Akt信號通路、TNF信號通路等發(fā)揮作用。HIF-1信號通路在機(jī)體氧供需失衡的條件下被激活，介導(dǎo)相關(guān)基因表達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧濃度。HIF-1由α亞基和β亞基共同組成，可以通過多途徑參與哮喘氣道炎癥機(jī)制［25］。血管VEGF是HIF-1α下游的主要靶點，KIM等［26］的研究顯示在OVA誘導(dǎo)的小鼠和小鼠上皮細(xì)胞中抑制HIF-11α可以通過調(diào)節(jié)VEGF介導(dǎo)的血管生成和血管通透性改變減輕抗原誘導(dǎo)的氣道炎癥和高反應(yīng)性。PI3K-Akt信號通路參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的應(yīng)激、增殖、分化、凋亡等過程，是人體重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。大量研究表明，PI3K/Akt信號通路可通過調(diào)節(jié)氣道高反應(yīng)性、炎癥反應(yīng)和血管通透性參與哮喘的發(fā)生發(fā)展［27-28］。有研究表明，阻斷PI3K/Akt信號通路可以調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的異常過程，減輕哮喘早期氣道重構(gòu)［29］。李鑫等［30］研究表明在小鼠模型中IL-27可通過抑制PI3K-Akt信號通路抑制氣道炎癥和氣道重塑。TNF是通過與細(xì)胞膜上特異性受體結(jié)合，激活JUN、核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)及凋亡等信號通路發(fā)揮多種生物效應(yīng)的細(xì)胞因子［31-32］。大量研究顯示TNF-α對哮喘的病理生理過程起重要作用。SONG等［33］研究表明大黃酚可抑制TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB信號通路激活，可以減輕OVA誘導(dǎo)的哮喘小鼠氣道炎癥和氣道重塑。XU等［23］研究表明，黃芩素可通過抑制TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB信號通路激活，減輕哮喘氣道慢性炎癥。

綜上所述，半夏厚樸湯可能通過多成分、多靶點、多通路對CVA發(fā)揮治療作用，但仍需結(jié)合體內(nèi)外實驗驗證其可靠性。