基于網(wǎng)絡藥理學方法探討黃連抗焦慮的潛在作用機制*

劉思潔，過偉峰，王君君，王小玲

南京中醫(yī)藥大學，江蘇 南京 210023

焦慮癥分為慢性焦慮和驚恐障礙兩種形式，主要表現(xiàn)為強烈、持續(xù)、與實際環(huán)境不符的擔憂和恐懼，常伴有心動過速、失眠等自主神經(jīng)功能紊亂癥狀。焦慮的病因、發(fā)病機制尚不明確，西醫(yī)治療以苯二氮卓艸類、非苯二氮類抗焦慮藥、選擇性5-羥色胺(5-hydroxy tryptamine，5-HT)再攝取抑制劑等抗焦慮藥為主，但常存在體質量增加、嗜睡、藥物依賴等不良反應。中醫(yī)藥治療焦慮癥具有較好療效，尤以黃連溫膽湯最為常用［1-4］?！侗静菥V目》謂黃連“瀉肝火，去心竅惡血，止驚悸”，是治療心煩、失眠、心悸不寧的常用藥物。本研究旨在利用網(wǎng)絡藥理學方法研究黃連抗焦慮的作用靶點和信號通路，為臨床應用提供依據(jù)。

1 研究方法

1.1 黃連有效成分及其蛋白靶點從中草藥系統(tǒng)藥理學平臺中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)數(shù)據(jù)庫（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）以“黃連”為關鍵詞搜索黃連的活性成分。按口服生物利用度（oral bioavailability，OB）＞30%、藥物相似性（drug-likeness，DL）＞0.18進一步篩選黃連的主要活性成分。運用TCMSP數(shù)據(jù)庫，獲得黃連所有蛋白靶點，借助Perl語言獲得黃連主要活性成分相對應的蛋白靶點，利用Uniprot數(shù)據(jù)庫、Perl語言將靶點蛋白名轉化成基因名。

1.2 藥物和疾病交集靶點篩選在GeneCards數(shù)據(jù)庫（http：//www.genecards.org/）和人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（OMIM，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/omim）中以“anxiety disorder”為關鍵詞搜索獲取疾病相關基因。利用R軟件篩選出疾病基因與藥物靶基因的共同交集，繪制韋恩圖。

1.3 “黃連-活性成分-靶點基因-焦慮”網(wǎng)絡和蛋白互作網(wǎng)絡構建利用Cytoscape 3.8.0軟件構建“藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡，運用String數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/cgi/input.pl）輸入藥物靶點基因與疾病基因的交集，定義物種為“Homo sapien”，構建黃連治療焦慮癥的蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡。最低互動評分設定為0.4，顯示設置隱藏游離點，其余保持默認值，得到蛋白互作網(wǎng)絡。前30名蛋白及節(jié)點連接數(shù)量用柱狀圖表示。

1.4 關鍵靶點的GO（gene ontology）富集分析和KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）通路富集分析用R軟件載入Bioconductor數(shù)據(jù)包及相關分析所用數(shù)據(jù)包，以pvaluecutoff=0.05，qvaluecutoff=0.05為標準進行GO富集分析和KEGG通路分析，并將結果可視化。

2 結果

2.1 黃連活性成分及靶蛋白基因篩選結果通過挖掘共得到黃連主要活性成分14種。去除不存在對應基因和重復存在的靶點，最終獲取黃連主要活性成分作用靶點84個。見表1。

表1 黃連有效活性成分

2.2 韋恩圖利用Genecard疾病數(shù)據(jù)庫和OMIM數(shù)據(jù)庫獲得焦慮相關疾病靶點信息，將其與黃連的主要活性成分靶點取交集，再利用R軟件繪制韋恩圖。藍色圓圈代表疾病相關靶點5311個，紅色圓圈代表黃連主要活性成分靶點84個，2個圓圈相交部分代表黃連和焦慮的67個共同靶點，為黃連抗焦慮的關鍵靶點。見圖1。

圖1 黃連有效成分與作用靶點韋恩圖

2.3 “黃連-活性成分-靶點基因-焦慮”網(wǎng)絡圖利用Cytoscape 3.8.0構建“黃連-活性成分-靶點基因-焦慮”網(wǎng)絡，其中紅色圓圈代表藥物黃連，藍色圓圈代表疾病焦慮癥，綠色方塊為黃連治療焦慮癥的有效活性成分12個節(jié)點，黃色方塊代表相關靶點基因67個節(jié)點，見圖2。由圖可知，黃連抗焦慮具有多成分、多靶點的特點，可以看出核受體輔活化子2（NCOA2）、雌激素受體1（estrogen receptor 1，ESR1)、PRSS1、前列腺素內過氧化物合酶1（PTGS1）基因靶點與黃連活性成分聯(lián)系最密切。

圖2 黃連-活性成分-靶點基因-焦慮網(wǎng)絡圖

2.4 關鍵靶點蛋白互作網(wǎng)絡將交集靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫，為了網(wǎng)絡簡潔有效，關聯(lián)評分設定為0.4，顯示隱藏游離蛋白靶點，其余保持默認值，獲得關鍵靶點蛋白互作網(wǎng)絡，共64個節(jié)點，374條連線，節(jié)點表示靶點，邊表示各作用靶點間的關聯(lián)，兩靶點間的連線越多，表示兩者關系越密切。節(jié)點發(fā)出的邊越多表示其越可能成為核心靶點。用柱狀圖表示其中關聯(lián)度最高的前30個靶點。見圖3—4。

圖3 PPI網(wǎng)絡圖

圖4 關鍵靶點蛋白關聯(lián)度排名前30位節(jié)點度值柱狀圖

2.5 GO富集分析和KEGG通路富集分析GO和KEGG富集分析從基因功能和通路兩個方面解讀差異基因的生物學功能，GO富集分析涵蓋細胞組分（cellular component）、分子功能（molecular function）、生物過程（biological process）3部分。以p=0.05，q=0.05為篩選條件，得到相關條目共840條，生物過程721條，細胞組分36條、分子功能83條，取3部分中富集程度前10位基因功能繪制成圖。KEGG通路富集分析以p=0.05，q=0.05為篩選條件，得到相關條目78條，取富集程度前20位信號通路繪制成圖。見圖5—9。

圖5 GO功能富集分析柱狀圖

圖6 GO功能富集分析氣泡圖

圖7 KEGG功能富集分析柱狀圖

圖8 KEGG功能富集分析氣泡圖

圖9 AGE-RAGE信號通路

3 討論

焦慮癥屬中醫(yī)學“郁證”“驚悸”“不寐”“百合病”等范疇。病因以情志刺激為主，病位在心，與肝膽脾腎相關。肝氣郁結，肝郁化火，灼液成痰，痰熱互結，上擾心神而致焦慮煩躁?！夺t(yī)宗金鑒》中說：“心靜則藏神，若七情所傷，則心不得靜，而神躁不寧也?！狈麨槊瘢?］認為痰熱內擾是焦慮癥最常見的病機，以黃連溫膽湯治療焦慮癥效果顯著，其中黃連作為君藥起清心除煩之效。交泰丸由黃連、肉桂組成，交泰丸聯(lián)合烏靈膠囊可降低失眠伴焦慮患者的焦慮自評量表（self-rating anxiety scale，SAS)評分［5］，效果優(yōu)于艾司唑侖。黃連阿膠湯出自《傷寒論》，方用黃連瀉心火，使心氣下交于腎，其減輕焦慮的效果較西藥更明顯，且不良反應?。?］。

黃連的主要成分有生物堿類、黃酮醇類、微量元素等［7］。生物堿類中的黃連堿［7-8］、黃酮醇類中的槲皮素［9］已被證明可通過調節(jié)腦內神經(jīng)遞質起抗焦慮作用。此外，本研究顯示黃連的其他有效成分如小檗堿、巴馬汀、黃連苷、小檗浸堿等靶點與焦慮的靶點對接數(shù)目較多，也具有抗焦慮作用。

從PPI網(wǎng)絡圖可知，黃連抗焦慮的作用機制多樣，黃連作用靶點和焦慮癥靶點之間相互影響、關系復雜，主要有以下幾類：1）炎癥相關蛋白：白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)、原癌基因（Fos proto-oncogene，F(xiàn)OS）、芳香烴受體（Aryl hydrocarbon receptor，AHR）、C反應蛋白（C reactive protein，CRP）；2）性激素相關蛋白：雌激素受體1（estrogen receptor 1，ESR1）、AR、雌激素受體2（estrogen receptor 2，ESR2）；3）胰島素相關蛋白：過氧化物酶體增殖物激活受體α（peroxisome proliferator activated receptor alpha，PPARA）、胰島素樣生長因子結合蛋白3(insulin-like growth factor binding protein 3，IGFBP3)；4）脂類代謝相關蛋白：PPARA、窖蛋白-1（caveolin-1，CAV1）?？梢酝茰y黃連抗焦慮可能與調控炎性反應、調節(jié)性激素水平、調節(jié)胰島素水平、脂類代謝等相關?，F(xiàn)代研究提示焦慮與免疫系統(tǒng)［10］、內分泌系統(tǒng)［11］相互影響，表現(xiàn)為T細胞紊亂及下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸、下丘腦-垂體-性腺（HPG）軸的紊亂，這與本研究結果一致。

GO富集分析顯示，黃連抗焦慮的生物過程主要涉及對外源性刺激的反應、類固醇激素反應、氧化應激反應等；分子功能主要涉及核受體活性、配體激活轉錄因子活性、類固醇激素受體、G蛋白偶聯(lián)胺受體活性等；細胞組成包括突觸當中各部分、RNA聚合酶Ⅱ轉錄調節(jié)復合物、膽堿能突觸等。KEGG富集分析結果表示，黃連抗焦慮與糖尿病并發(fā)癥中AGE-RAGE信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號通路等78條通路有關。核轉錄因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)是與炎癥相關的經(jīng)典信號通路，NF-κB的激活誘發(fā)IL-6、白細胞介素8(interleukin-8，IL-8)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα，TNF-α)等大量促炎細胞因子的表達和釋放，引起焦慮［12］。AGE-RAGE信號通路中，糖基化終末產(chǎn)物AGEs升高引起晚期糖基化終產(chǎn)物異常高表達并與晚期糖基化終產(chǎn)物結合后激活p38大鼠肉瘤（rat sarcoma，ras）蛋白及絲裂原化蛋白激酶途徑，上調并激活NF-κB表達［13］?？úㄎ魅饬鱿嚓P皰疹病毒感染通路也包含NF-κB。TNF信號通路中TNF除了激活NF-κB外還通過調節(jié)5-HT及其轉運蛋白、調控氧化應激反應導致焦慮［14］。以此推斷，阻斷NF-κB通路可能成為研究黃連治療焦慮癥的新切入點。

綜上所述，黃連可通過多分子、多靶點、多途徑治療焦慮癥，其物質基礎可能為小檗堿、槲皮素，其機制可能是調節(jié)腦內神經(jīng)遞質、調控炎性因子表達、減輕氧化應激反應、調節(jié)內分泌及免疫紊亂等。本研究基于網(wǎng)絡藥理學獲得黃連抗焦慮的多個靶點及通路，同時本研究發(fā)現(xiàn)黃連抗焦慮的某些作用靶點如CASP、MYC及信號通路如卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染的相關文獻較少，本研究結果可為以后擴展黃連抗焦慮研究提供思路。