GsERF6基因過表達(dá)對水稻耐鹽堿性的影響

才曉溪 胡冰霜 沈 陽 王 研 陳 悅 孫明哲 賈博為 孫曉麗

研究簡報(bào)

基因過表達(dá)對水稻耐鹽堿性的影響

才曉溪**胡冰霜**沈 陽 王 研 陳 悅 孫明哲 賈博為 孫曉麗*

1黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院 / 作物逆境分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室, 黑龍江大慶 163319

乙烯響應(yīng)因子(ERF)是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子, 在響應(yīng)非生物脅迫中具有重要作用。本研究通過生物信息學(xué)發(fā)現(xiàn), 野生大豆耐鹽堿ERF轉(zhuǎn)錄因子GsERF6與水稻ERF同源蛋白的氨基酸序列相似性很高, 均包含1個高度保守的AP2結(jié)構(gòu)域。為探究基因在水稻耐鹽堿應(yīng)答中的作用, 通過遺傳轉(zhuǎn)化、PCR和半定量RT-PCR鑒定, 獲得了2個純合的過表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻株系。表型鑒定表明, 200 mmol L–1NaHCO3處理下轉(zhuǎn)基因水稻的存活率、相對含水量、超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶活性、可溶性糖和脯氨酸含量均顯著高于對照, 活性氧積累則反之。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析表明, 40 mmol L–1NaHCO3處理6 h后滲透調(diào)節(jié)基因和在轉(zhuǎn)基因水稻中的表達(dá)量顯著高于對照。本研究表明, 水稻中的過表達(dá)可通過提高ROS清除水平、滲透調(diào)節(jié)能力及脅迫應(yīng)答基因的表達(dá)來提高其耐鹽堿性。

水稻; 耐鹽堿; 乙烯響應(yīng)因子; 野生大豆;

土壤鹽堿化嚴(yán)重影響作物的產(chǎn)量, 是全球糧食安全所面臨的巨大挑戰(zhàn)之一。鹽脅迫會引發(fā)植物細(xì)胞的離子毒害、滲透脅迫和氧化傷害, 造成植物體內(nèi)代謝紊亂[1]。植物遭受堿脅迫時(shí), 除了上述鹽脅迫造成的傷害外, 還需應(yīng)對外界高pH傷害和碳酸鹽脅迫。目前, 全球超過8.33×108hm2的土壤已經(jīng)受到鹽堿化的影響, 而我國有鹽堿地9.913×108hm2, 位居世界第三。其中, 東北蘇打鹽堿地面積高達(dá)3.73×106hm2[2], 開發(fā)利用這些后備土地資源, 對于我國糧食安全具有重大意義?？蒲腥藛T經(jīng)過多年研究, 提出了物理方法、化學(xué)措施、生物種植及農(nóng)藝管理措施等鹽堿地綜合改良技術(shù)。其中, 較為成熟的是利用改良鹽堿地種植耐鹽堿作物, 可有效解決鹽堿地改良過程中脫鹽和抑制返鹽的難題[3]。因此, 挖掘耐鹽堿基因, 培育特定的耐鹽堿作物新品種, 是鹽堿地資源開發(fā)利用的重要途徑。

乙烯響應(yīng)因子(ethylene responsive factor, ERF)是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子, 屬于AP2/ERF (APETALA2/ ethylene responsive factor)轉(zhuǎn)錄因子家族, 包含1個高度保守的AP2 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域, 可以特異地結(jié)合GCC-box (AGCCGCC)、DRE/CRT (A/GCCGAC)等順式作用元件, 在多種非生物逆境響應(yīng)中扮演重要角色[4-7]。研究表明在煙草(L.)中過表達(dá)小黑楊, 可通過抑制丙二醛(malondialdehyde, MDA)和活性氧(reactive oxygen species, ROS)積累, 提高轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽性[8]。過表達(dá)大豆(L.)可以增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因煙草對鹽堿和干旱脅迫的耐受性[9]。極耐寒的枳()中3個ERF轉(zhuǎn)錄因子基因和可直接調(diào)控過氧化物氧化還原酶基因、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、ACC合成酶基因和棉子糖合酶基因的表達(dá), 有效增強(qiáng)ROS清除和滲透調(diào)節(jié)能力提高耐寒性[10-12]。通過調(diào)節(jié)抗壞血酸(ascorbic acid, AsA)的生物合成, 增強(qiáng)擬南芥()的耐鹽性[13]。水稻(L.) ERF亞家族的轉(zhuǎn)錄抑制因子基因(ethylene-responsive element binding proteins 1/2)正向調(diào)控水稻耐鹽性[14], 而過表達(dá)降低了水稻對鹽脅迫的耐受性[15]。

野生大豆(L.)耐鹽堿性狀突出, 是耐鹽堿基因挖掘與大豆新種質(zhì)創(chuàng)新不可或缺的資源[16]。課題組前期從野生大豆中克隆出多個耐鹽堿功能顯著的基因, 包括2個乙烯響應(yīng)因子基因和[17-18], 利用過表達(dá)技術(shù)確定了上述2個基因可以增強(qiáng)擬南芥對蘇打鹽堿脅迫(NaHCO3)的耐受性。鑒于優(yōu)異的耐蘇打鹽堿功能, 本研究將其在水稻中過表達(dá), 通過對比轉(zhuǎn)基因植株及其對照在鹽堿脅迫下表型、形態(tài)、生理指標(biāo)以及滲透調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá), 為下一步培育耐鹽堿水稻提供材料儲備。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選用粳型常規(guī)水稻‘農(nóng)豐1701’為試驗(yàn)材料, 生育期138 d左右, 由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)自主培育。大腸桿菌DH5α、農(nóng)桿菌EHA105菌株和植物載體pCAMBIA230035SU, 由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)作物逆境分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 ERF亞家族蛋白生物信息學(xué)分析

通過文獻(xiàn)檢索結(jié)合國家水稻數(shù)據(jù)中心數(shù)據(jù)庫, 查找已具有耐逆功能報(bào)道的水稻ERF轉(zhuǎn)錄因子。結(jié)合Blastp比對從水稻中鑒定相似性較高的同源蛋白(值4e-26), 下載其氨基酸序列, 并通過Pfam、SMART軟件分析確定蛋白保守結(jié)構(gòu)域。采用Clustal X軟件(Ver.1.81, European Bioinformatics Institute)分析蛋白序列相似性, 利用MEGA 6.0軟件的鄰接法(Neighbor-Joining, NJ)分析進(jìn)化關(guān)系。

1.3 GsERF6植物過表達(dá)載體構(gòu)建

采用USER克隆[19]技術(shù), 將具有新霉素抗性基因的pCAMBIA230035SU載體與GsERF6完整CDS區(qū)構(gòu)建重組質(zhì)粒。以前期獲得的pGEM-T-GsERF6質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 所用引物為GsERF6-F/R (表1)。PCR總反應(yīng)體系50 μL, 包括2×EasyPCR Super Mix 25 μL, 上下游引物(10 μmol L–1)各1.5 μL, ddH2O 21 μL以及質(zhì)粒pGEM-T-GsERF6 1 μL。反應(yīng)條件為: 95°C預(yù)變性5 min; 95℃變性30 s, 60℃退火30 s, 72°C延伸60 s, 30個循環(huán); 72℃終延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物與I及I消化的pCAMBIA230035SU片段連接, 轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α, PCR鑒定陽性菌落并送交測序。

表1 本研究所用的引物

1.3 水稻遺傳轉(zhuǎn)化

將上述構(gòu)建的過表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105, 并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對水稻愈傷組織進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化[20]。對飽滿和無菌斑的‘農(nóng)豐1701’水稻種子消毒后, 平鋪于水稻愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上(營養(yǎng)瓊脂, nutrient broth, NB, pH 5.8), 28℃暗培養(yǎng)4周左右誘導(dǎo)愈傷組織。挑選黃色顆粒狀愈傷組織依次轉(zhuǎn)接入繼代培養(yǎng)基(NB, pH 5.8)、共培養(yǎng)培養(yǎng)基(NB+20 mg L–1乙酰丁香酮, pH 5.2)、篩選培養(yǎng)基(NB+100 mg L–1G418+100 mg L–1阿莫西林克拉維酸鉀, pH 5.8)中, 篩選獲得的抗性苗轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基(Murashige and Skoog, MS+100 mg L–1阿莫西林克拉維酸鉀, pH 5.8)中, 得到T0代植株。繁種后收獲T1代種子, 本研究使用的是T3代純合轉(zhuǎn)基因水稻種子。

1.4 轉(zhuǎn)基因植株檢測

使用Axygen公司的AxyPrep Genomic DNA purification試劑盒, 提取水稻葉片基因組DNA。以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR檢測, 所用基因特異引物為GsERF6- PCR-F/R (表1)。反應(yīng)體系15 μL: 2×EasyPCR Super Mix 7.5 μL, 上下游引物(10 μmol L–1)各0.3 μL, ddH2O 4.9 μL以及模板DNA 2 μL。PCR反應(yīng)條件: 95℃預(yù)變性5min, 95℃變性30 s, 60℃退火30 s, 72℃延伸60 s, 30個循環(huán)后, 72℃終延伸10 min。

使用Thermo公司的TRIzol試劑法提取PCR陽性植株總RNA, 經(jīng)諾唯贊生物科技股份(南京)有限公司gDNA wiper清除基因組DNA, 再利用此公司試劑盒HiScript III RT SuperMix反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以此為模板進(jìn)行半定量PCR檢測, 所用基因特異引物為GsERF6-RT-F/R, 內(nèi)參基因引物為OsElf1-α-F/R (表1)。RT-PCR反應(yīng)體系20 μL: 2× EasyPCR Super Mix 10 μL, 上下游引物(10 μmol L–1)各0.4 μL, ddH2O 7.2 μL以及cDNA 2 μL。PCR反應(yīng)條件: 95℃預(yù)變性5 min, 95℃變性30 s, 60℃退火30 s, 72℃延伸15 s, 28個循環(huán)(內(nèi)參25個循環(huán)); 72℃終延伸10 min, 4℃終止反應(yīng)。

1.5 水稻鹽堿脅迫處理

將純合轉(zhuǎn)基因株系和野生型水稻種子浸泡發(fā)芽, 待破胸露白, 移植到田園土、君子蘭土、蛭石以體積比5∶3∶2均勻混合在營養(yǎng)缽中, 于人工氣候室(25℃、相對濕度70%、光照14 h/黑暗10 h)培養(yǎng)至三葉期。選取長勢一致的水稻幼苗, 分別用含有0 mmol L–1和200 mmol L–1NaHCO3(pH 8.4)溶液澆灌進(jìn)行鹽堿脅迫處理12 d, 每4 d澆灌1次處理液, 每次澆灌2 L[21]。觀察植株生長狀態(tài), 并測定存活率和地上部分相對含水量, 存活率(%)=存活株數(shù)/總株數(shù)×100, 地上部分相對含水量(%)=(鮮重-干重)/鮮重×100。每個處理設(shè)置3個獨(dú)立的生物學(xué)重復(fù), 每個生物學(xué)重復(fù)中每個株系不少于60株。

1.6 水稻鹽堿脅迫生理指標(biāo)檢測

分別在處理前和處理7 d后剪取水稻幼苗的地上部分,以單株水稻為1個樣本, 每個指標(biāo)測定20個樣本。按照李合生等[22]方法測定超氧化物歧化酶(SOD, EC: 1.15.1.1)、過氧化物酶(POD, EC: 1.11.1.7)和過氧化氫酶(CAT, EC: 1.11.1.6)活性; 采用氮藍(lán)四唑(nitrotetrazolium blue chloride, NBT)和3,3’-二氨基聯(lián)苯胺(3,3’-diaminobenzi-dine, DAB)染色液進(jìn)行染色[23]; 采用硫酸蒽酮比色法[24]測定可溶性糖含量; 采用茚三酮比色法[24]測定脯氨酸含量。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR表達(dá)水平檢測

在鹽堿脅迫基因表達(dá)檢測時(shí), 選擇水培法[20]對水稻進(jìn)行培養(yǎng)和鹽堿處理, 便于保證鹽堿處理強(qiáng)度的一致性, 減少誤差。將野生型和純合轉(zhuǎn)基因株系水稻種子浸泡發(fā)芽,待芽長約2 mm時(shí), 移至含有Youshida營養(yǎng)液(pH 5.5～5.8)的96孔水培盒里, 于人工氣候室培養(yǎng), 其間每2 d換1次營養(yǎng)液。挑選長勢一致的三葉期幼苗, 用0 mmol L–1和40 mmol L–1NaHCO3溶液處理6 h, 取相同部位相同長度水稻葉片, 迅速置于液氮速凍, 于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用全式金生物技術(shù)股份有限(北京)公司試劑盒TransStart Top Green qPCR SuperMix于實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀CFX96 Touch (BioRad公司)上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR (quantitative real-time PCR)檢測。反應(yīng)體系15 μL: 2×Top qMix 7.5 μL, 上游和下游引物(10 μmol L–1)各0.3 μL, ddH2O 4.9 μL以及cDNA 2 μL。PCR反應(yīng)條件: 94℃預(yù)變性30 s, 94℃變性5 s, 60℃退火15 s, 72℃延伸20 s, 40個循環(huán)。所用和基因特異引物見表1。以未處理時(shí)野生型水稻中基因表達(dá)量作為1, 采用2–DDCt法計(jì)算基因相對表達(dá)量。

1.8 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

采用Microsoft Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及繪圖, 用Student’s檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 GsERF6基因生物信息學(xué)分析

通過文獻(xiàn)檢索結(jié)合國家水稻數(shù)據(jù)中心數(shù)據(jù)庫, 查找已報(bào)道的水稻耐逆ERF轉(zhuǎn)錄因子, 結(jié)合Blastp比對從水稻中鑒定出5個相似性較高的同源蛋白(值4e-26), 分別為OsERF105 (LOC_Os04g46240)、OsSta2 (LOC_Os02g43820)、OsBIERF3 (LOC_Os02g43790)、OsAP23 (LOC_Os03g05590)和OsERF15 (LOC_Os03g64260) (圖1)。多重序列比對結(jié)果顯示, GsERF6與水稻的ERF家族蛋白序列相似性很高, 且均包含1個蛋白序列高度保守的AP2結(jié)構(gòu)域(圖2)。

2.2 GsERF6過表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻的獲得

2.2.1過表達(dá)載體的構(gòu)建 將含有基因CDS區(qū)的片段插入植物表達(dá)載體pCAMBIA230035SU, 該載體由組成型啟動子35S驅(qū)動基因表達(dá), 且含有新霉素植物選擇標(biāo)記基因(圖3-A)。采用基因特異引物PCR擴(kuò)增獲得長度為840 bp的目的條帶(圖3-B), PCR產(chǎn)物經(jīng)USER酶切后, 與經(jīng)I及I線性化的pCAMBIA230035SU連接。經(jīng)菌落PCR鑒定獲得陽性克隆pC35SU-GsERF6 (圖3-C), 用于下一步農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化。

2.2.2 水稻遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的鑒定 在獲得的多個抗性的水稻株系中, 隨機(jī)選擇8株(#1～#8)采用基因特異引物進(jìn)行PCR檢測。圖4-A顯示, 抗性植株均能擴(kuò)增出400 bp的特異性條帶, 而野生型(對照)中未檢測到條帶, 表明基因已整合到水稻基因組中。進(jìn)一步提取2個轉(zhuǎn)基因株系(#1和#2)總RNA, 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA后, 以水稻作為內(nèi)參基因,進(jìn)行半定量RT-PCR檢測。圖4-B顯示, 經(jīng)過25個循環(huán), 內(nèi)參基因均擴(kuò)增出條帶; 28個循環(huán), 對照未能擴(kuò)增出條帶,而轉(zhuǎn)基因水稻中可檢測到基因的轉(zhuǎn)錄。

圖1 GsERF6與水稻中同源ERF蛋白進(jìn)化關(guān)系分析

“?”代表水稻ERF基因; “D”代表野生大豆ERF基因。

“?” stands for ERF gene of rice; “D” stands for ERF gene of wild soybean.

圖2 GsERF6與水稻中同源ERF蛋白序列比對

圖3 GsERF6植物超量表達(dá)載體的構(gòu)建

A:過表達(dá)載體示意圖; B:基因的克隆; M: DNA marker; 1～3: GsERF6 PCR產(chǎn)物; C: pC35SU-GsERF6菌落PCR鑒定; M: DNA marker; ?: 陰性H2O對照; +: 陽性質(zhì)粒對照; 1: pC35SU-GsERF6。

A: theoverexpression vector; B: gene clone of; M:DNA marker; 1–3: PCR product of GsERF6; C: PCR identificationof recombinantclones harboring the pC35SU-GsERF6 con-struct; M: DNA marker; ?: negative H2O control; +: positive plas-mid control; 1: PCR products of the pC35SU-GsERF6 clones.

2.3 GsERF6轉(zhuǎn)基因水稻耐鹽堿性分析

選取2個pC35SU-GsERF6 T3代純合轉(zhuǎn)基因水稻株系(#1和#2), 以野生型水稻作為對照, 進(jìn)行耐鹽堿性分析。如圖5-A所示, 正常生長條件下(0 mmol L–1)時(shí)轉(zhuǎn)基因水稻長勢與對照不存在顯著差異; 而200 mmol L–1NaHCO3處理12 d后,轉(zhuǎn)基因水稻各株系生長狀況明顯優(yōu)于對照, 具體表現(xiàn)為對照植株地上部分嚴(yán)重萎蔫、失綠, 而轉(zhuǎn)基因水稻生長狀態(tài)較好。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示, 200 mmol L–1NaHCO3處理下,轉(zhuǎn)基因水稻#1、#2存活率分別為75%和61%, 顯著高于對照31% (圖5-B); 同時(shí)轉(zhuǎn)基因水稻地上部分相對含水量(85%、82%)也顯著高于對照(72%), 說明轉(zhuǎn)基因水稻耐鹽堿性明顯提高(圖5-C)。

2.4 GsERF6轉(zhuǎn)基因水稻ROS積累及抗氧化物酶活性分析

DAB和NBT染色結(jié)果顯示, 未進(jìn)行鹽堿處理時(shí)轉(zhuǎn)基因水稻與對照植株染色顏色較淺, 鹽堿處理后對照染色程度明顯深于過表達(dá)植株(圖6-A, B), 說明O2?和H2O2積累量高于過表達(dá)植株。進(jìn)一步對鹽堿處理前后的轉(zhuǎn)基因水稻和對照進(jìn)行SOD、POD和CAT活性測定。結(jié)果顯示, 正常情況下轉(zhuǎn)基因水稻與對照植株體內(nèi)SOD、POD和CAT活性無顯著差異, 鹽堿處理后上述抗氧化酶活性均有不同程度提高(圖6-C～E), 但轉(zhuǎn)基因水稻中酶活顯著高于對照, 表明可能通過提高抗氧化物酶活性, 減少ROS積累, 從而提高水稻耐鹽堿性。

2.5 GsERF6轉(zhuǎn)基因水稻滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量分析

對轉(zhuǎn)基因水稻滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量分析發(fā)現(xiàn), 鹽堿脅迫前,轉(zhuǎn)基因水稻與對照植株體內(nèi)可溶性糖和脯氨酸含量均無顯著差異; 鹽堿脅迫條件下, 上述2個物質(zhì)的含量均不同程度地提高, 但轉(zhuǎn)基因水稻中的可溶性糖和脯氨酸含量顯著高于對照(圖7-A, B)。

2.6 GsERF6轉(zhuǎn)基因水稻鹽堿應(yīng)答基因表達(dá)分析

為進(jìn)一步探究基因調(diào)控水稻耐鹽堿性的作用機(jī)制, 我們分析了對照和轉(zhuǎn)基因水稻脅迫下2個鹽堿應(yīng)答標(biāo)記基因([25]和[26])的表達(dá)水平。如圖8所示, 正常生長條件下,和的表達(dá)在對照和轉(zhuǎn)基因水稻中無顯著差異; 經(jīng)40 mmol L–1NaHCO3處理6 h后二者表達(dá)水平在對照和轉(zhuǎn)基因水稻中均上調(diào)。其中, 鹽堿脅迫處理后轉(zhuǎn)基因水稻中(圖8-A)和(圖8-B)的表達(dá)水平均極顯著高于對照。綜上表明,過表達(dá)可通過提高水稻中鹽堿應(yīng)答基因的表達(dá), 來調(diào)控植株對鹽堿脅迫的響應(yīng)。

圖4 GsERF6轉(zhuǎn)基因株系的分子檢測

A: 轉(zhuǎn)基因抗性植株P(guān)CR檢測; B: 轉(zhuǎn)基因植株RT-PCR檢測; M: DNA marker; ?: 陰性H2O對照; +: 陽性質(zhì)粒對照; WT: 野生型對照; #1～#8: 獨(dú)立株系。

A: PCR detection of resistant plants transformed with; B: RT-PCR detection oftransgenic rice; M: DNA marker; ?: negative H2O control; +: positive plasmid control; WT: wild type control; #1–#8:resistant seedlings.

圖5 GsERF6轉(zhuǎn)基因水稻幼苗期耐鹽堿性分析

A: NaHCO3處理前后各株系生長狀態(tài); B: 水稻幼苗存活率; C: 水稻幼苗相對含水量。差異顯著性分析采用-test方法。

A: phenotype of WT and transgenic rice seedlings treated with NaHCO3; B: the survival rates of WT and transgenic rice seedlings; C: the relative water content of WT and transgenic rice seedlings. The significant difference was evaluated by the Student’s-test. *:< 0.05; **:< 0.01; ***:< 0.001.

圖6 GsERF6轉(zhuǎn)基因水稻鹽堿脅迫下ROS積累及抗氧化物酶活分析

A: DAB染色; B: NBT染色; C: SOD活性; D: POD活性; E: CAT活性。差異顯著性分析采用-test方法。

A: DAB staining; B: NBT staining; C: SOD activity; D: POD activity; E: CAT activity. The significant difference was evaluated by the Student’s-test. *:< 0.05; **:< 0.01; ***:< 0.001.

圖7 GsERF6轉(zhuǎn)基因水稻鹽堿脅迫后滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量分析

A: 可溶性糖含量; B: 脯氨酸含量。差異顯著性分析采用-test方法。

A: soluble sugar content; B: proline content. The significant difference was evaluated by the Student’s-test. *:< 0.05; **:< 0.01; ***:< 0.001.

圖8 GsERF6轉(zhuǎn)基因水稻鹽堿應(yīng)答基因表達(dá)分析

A:基因表達(dá)量變化; B:基因表達(dá)量變化。差異顯著性分析采用-test方法。

A: the relative expression level ofgenes; B: the relative expression level ofgenesThe significant difference was evaluated by the Student’s-test. *:< 0.05; **:< 0.01; ***:< 0.001.

3 討論

GsERF6是課題組前期從野生大豆中鑒定的1個調(diào)控蘇打鹽堿耐性的ERF轉(zhuǎn)錄因子。Yu等[18]發(fā)現(xiàn)在擬南芥中過表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因株系在HCO3?(NaHCO3和KHCO3)處理下的種子萌發(fā)和幼苗生長。本研究首先在水稻中鑒定到5個GsERF6同源蛋白(圖1), 都包含1個高度保守的AP2結(jié)構(gòu)域, 保守的氨基酸序列為丙氨酸-14 (Ala-14)和天冬氨酸-19 (Asp-19) (圖2)。有研究表明水稻、和基因均參與鹽脅迫應(yīng)答[27-29]。本研究證實(shí)NaHCO3處理后,轉(zhuǎn)基因水稻的存活率和相對含水量顯著高于野生型(圖5), 說明基因在水稻中過表達(dá)同樣提高了蘇打鹽堿脅迫的耐性。

ROS是參與調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育和響應(yīng)逆境脅迫的重要指標(biāo)[30]。植物在受到鹽堿脅迫時(shí), 會產(chǎn)生過量的O2?和H2O2等有害物質(zhì), 打破體內(nèi)ROS動態(tài)平衡狀態(tài), 造成細(xì)胞氧化損傷, 最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[31]。Wang等[6]研究表明, 擬南芥中ERF6可以被MPK6 (mitogen-activated protein kinase 6)磷酸化, 從而與ROSE7/GCC box (ROS- responsive cis-acting element 7)結(jié)合調(diào)節(jié)ROS響應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄參與氧化脅迫應(yīng)答。Zhang等[13]發(fā)現(xiàn),的過表達(dá)減少了鹽脅迫下擬南芥葉片中H2O2的積累, 且ROS清除基因(、和)的表達(dá)在轉(zhuǎn)基因植株中顯著上調(diào)。本研究與上述得出相似結(jié)論,在水稻中的表達(dá), 降低了鹽堿脅迫下O2?和H2O2含量的積累, 增強(qiáng)了抗氧化酶SOD、POD和CAT的活性(圖6), 通過提高ROS的清除效率, 減輕轉(zhuǎn)基因水稻氧化損傷。

可溶性糖、脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累有助于植物應(yīng)對外界逆境脅迫[32]。研究發(fā)現(xiàn)黃花苜蓿()中響應(yīng)高鹽、高溫、干旱等非生物脅迫, 在鹽脅迫下過表達(dá)植株體內(nèi)脯氨酸含量顯著提高[33]。此外,等多個ERF轉(zhuǎn)錄因子均被報(bào)道參與植物體內(nèi)氧化應(yīng)激和滲透調(diào)節(jié)過程[34-35]。本研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因水稻在鹽堿脅迫下的可溶性糖和脯氨酸含量顯著高于野生型(圖7), 表明基因參與鹽堿脅迫下植物體內(nèi)氧化還原和滲透調(diào)節(jié)過程。

本研究中, 我們發(fā)現(xiàn)鹽堿處理下,轉(zhuǎn)基因水稻中和基因的表達(dá)顯著高于對照(圖8)。有研究表明煙草中過表達(dá), 通過增加脯氨酸含量減輕高鹽、高滲透脅迫對煙草造成的氧化損傷[26]。與此結(jié)果一致,在擬南芥中過表達(dá)同樣促進(jìn)了、、等多個非生物脅迫應(yīng)答基因的表達(dá)[17]。PtrERF108可特異性結(jié)合棉子糖合酶基因啟動子的GCC-box, 并激活其表達(dá), 進(jìn)而調(diào)控植株體內(nèi)RafS活性和棉子糖含量, 增強(qiáng)枳的抗寒性[11]。我們前期通過酵母轉(zhuǎn)錄激活實(shí)驗(yàn)證實(shí)GsERF6蛋白具有轉(zhuǎn)錄激活活性, 且亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)表明GsERF6蛋白定位于細(xì)胞核[17]。我們推測可能直接或間接調(diào)控和基因的表達(dá), 從而參與水稻鹽堿脅迫應(yīng)答過程。鑒于其與其他ERF轉(zhuǎn)錄因子高度保守的AP2 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域, 我們推測GsERF6也能夠識別和結(jié)合DRE/CRT和GCC-box元件。

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Effects ofoverexpression on salt-alkaline tolerance in rice

CAI Xiao-Xi**, HU Bing-Shuang**, SHEN Yang, WANG Yan, CHEN Yue, SUN Ming-Zhe, JIA Bo-Wei, and SUN Xiao-Li*

Crop Stress Molecular Biology Laboratory, College of Agriculture, Heilongjiang Bayi Agriculture University, Daqing 163319, Heilongjiang, China

Ethylene response factors (ERFs) are a family of plant specific transcription factors that play important roles in abiotic stress. Bioinformatic analysis revealed that GsERF6, aERF transcription factor that positively regulated salt-alkaline tolerance, shared high sequence identity with homologous ERF proteins with one highly conserved AP2 domain in rice. To explore the effect ofoverexpression on the salt-alkaline tolerance in rice, we transformedinto rice and obtained two homozygous transgenic lines via PCR and RT-PCR. Phenotypical and physiological assays indicated that, compared with the wild type rice under 200 mmol L–1NaHCO3treatment, the survival rate, relative water content, the activities of SOD, POD, and CAT, the soluble sugar and proline contents, were significantly increased, while ROS accumulation was significantly decreased inoverexpression lines. The qRT-PCR showed that transcript levels ofandwere significantly up-regulated intransgenic line after 40 mmol L–1NaHCO3treatment for 6 hours. In summary,overexpression in rice contributed to ROS scavenging, osmotic regulation, and activation of stress responsive genes, thus improving the salt-alkaline tolerance of transgenic rice.

rice; salt-alkaline tolerance; ethylene response factors;;

10.3724/SP.J.1006.2023.22008

本研究由國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(32101672, 31971826, U20A2025)和中央支持地方高校改革發(fā)展資金人才培養(yǎng)支持計(jì)劃項(xiàng)目(202201005)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (32101672, 31971826, U20A2025) and the Special Funds from the Central Finance to Support the Development of Local Universities (202201005).

孫曉麗, E-mail: sunxiaoli2016@byau.edu.cn

**同等貢獻(xiàn)(Contributed equally to this work)

才曉溪, E-mail: 18746616279@163.com; 胡冰霜, E-mail: alisa961102@gmail.com

2022-01-28;

2022-06-07;

2022-06-21.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20220620.1740.004.html

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