基于16S rRNA高通量測序的江鱈腸道微生物群落結(jié)構(gòu)研究

柳鵬 李玲雪 閆春梅 杜曉燕 鄭偉 劉慧吉 高春山

(吉林省水產(chǎn)科學(xué)研究院，吉林長春 130033)

江鱈(Lotalota)又名山鱈、山鯰魚，隸屬于鱈形目、鱈科、江鱈屬，是鱈科魚類中唯一的淡水種類。因自然產(chǎn)量低，種質(zhì)資源脆弱，目前江鱈的瀕危等級為易危，是世界搶救性開發(fā)品種之一[1-2]。江鱈肉質(zhì)鮮美細(xì)膩，無肌間刺，并以肝臟肥美、精巢味鮮而著稱，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[3]。目前，關(guān)于江鱈胚胎發(fā)育[4]、形態(tài)特征[5]、營養(yǎng)成分[6]和人工養(yǎng)殖[2]等方面的研究較多，但尚未見有關(guān)其腸道菌群結(jié)構(gòu)方面的研究報(bào)道。

魚類腸道微生物作為魚體內(nèi)微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，對宿主的營養(yǎng)、發(fā)育、免疫以及生理健康等方面都起著至關(guān)重要的作用。腸道菌群結(jié)構(gòu)在不同的魚類中表現(xiàn)出特異性，且與外界環(huán)境條件密切相關(guān)，魚類的生長發(fā)育階段、營養(yǎng)狀況、性別等都會對其腸道微生物多樣性產(chǎn)生影響[7]。因此，了解魚類腸道菌群的演替和定植過程，對魚類腸道微生態(tài)系統(tǒng)平衡調(diào)控具有重要意義。在魚類腸道菌群結(jié)構(gòu)的研究方法中，高通量測序技術(shù)可以對微生物群落進(jìn)行精確定量，具有通量高、錯(cuò)誤率和成本低等優(yōu)點(diǎn)[8-9]，已被廣泛應(yīng)用于水體、土壤、動物等不同環(huán)境下微生物群落結(jié)構(gòu)的研究[10-11]。

本研究采用MiSeq 16S rRNA高通量測序法，初步分析了江鱈腸道菌群結(jié)構(gòu)，旨在揭示野生江鱈腸道菌群的結(jié)構(gòu)特征，以期為深入研究江鱈腸道菌群形成機(jī)制及調(diào)控技術(shù)提供參考，也為吉林省江鱈種質(zhì)資源的保護(hù)和合理開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣品提取

試驗(yàn)用野生江鱈于2019年11月采集于吉林省牡丹江流域敦化地區(qū)(同一水域)。挑選活力較好、體表完整無傷的3齡、4齡、5齡雌、雄江鱈各3尾。用75%的酒精棉擦拭試驗(yàn)魚體表，在無菌條件下取出整條腸道；再用75%的酒精棉擦拭腸道外壁，用滅菌手術(shù)剪剪開腸道；用解剖刀刮取腸道內(nèi)容物作為樣品，保存于-80 ℃冰箱中。樣品信息和分組情況見表1。

表1 江鱈腸道內(nèi)容物樣品信息和分組情況

1.2 DNA提取及MiSeq 16S rRNA高通量測序

按照PowerSoil DNA Isolation Kit試劑盒說明書提取樣品DNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳和分光光度法檢測提取DNA的質(zhì)量和濃度。質(zhì)檢合格的樣品于-20 ℃條件下保存?zhèn)溆?。用引?38F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806R(5’-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3’)擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因的V3～V4區(qū)。對PCR產(chǎn)物，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶大小，并用Agencourt AMPure XP核酸純化試劑盒純化。用PCR產(chǎn)物構(gòu)建微生物多樣性測序文庫，交由北京奧維森基因科技有限公司使用Illumina MiSeq PE300高通量測序平臺進(jìn)行雙端(paired-end)測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

下機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)過過濾、拼接后，用Vsearch 2.7.1軟件的uparse算法對優(yōu)質(zhì)序列進(jìn)行操作分類單元(operational taxonomic units，OTU)聚類，相似性閾值為97%。將聚類結(jié)果使用RDP classifier算法與Silva128數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，得到每個(gè)OTU對應(yīng)的物種分類信息。再利用QIIME 1.8.0軟件進(jìn)行alpha多樣性指數(shù)分析，包括測序深度指數(shù)(goods-coverage index)、菌種豐富度指數(shù)(Chao1 index)、譜系多樣性指數(shù)(PD-whole-tree index)、香農(nóng)指數(shù)(Shannon index)、辛普森多樣性指數(shù)(Simpson index)等?；谖锓N注釋及相對豐度結(jié)果，使用R 3.6.0軟件進(jìn)行物種組成柱狀圖分析。使用R語言工具進(jìn)行主成分分析(PCA)、文氏圖(Venn diagram)統(tǒng)計(jì)分析并作圖。

2 結(jié)果

2.1 稀釋性曲線(rarefaction curve)

以隨機(jī)抽取到的序列(reads)數(shù)為橫坐標(biāo)，以它們所能代表的OTU數(shù)目為縱坐標(biāo)，構(gòu)建稀釋性曲線[12]，結(jié)果見圖1。當(dāng)抽樣reads數(shù)少于20 000時(shí)，隨著測序條數(shù)的增加，各樣品的曲線均呈現(xiàn)急劇上升趨勢，說明隨著測序量的增加，江鱈腸道內(nèi)容物中有大量菌群被發(fā)現(xiàn)。當(dāng)抽樣reads數(shù)超過20 000后，隨著測序條數(shù)的繼續(xù)增加，各曲線上升態(tài)勢趨于平緩，表明測序結(jié)果基本覆蓋了江鱈腸道內(nèi)容物的菌群。當(dāng)抽樣reads數(shù)超過25 000時(shí)，曲線還略有上升趨勢，可能是因?yàn)槟承┰蚰c道中殘留了少許的菌群或少數(shù)細(xì)菌死亡后未被檢測出[13]。

圖1 樣品稀釋性曲線

2.2 測序結(jié)果及alpha多樣性分析

由表2可見，試驗(yàn)共測出的OTU數(shù)目為4 561，其中JX3含有OTU數(shù)目最多，為2 736個(gè)，JX51含有OTU數(shù)目最少，為90個(gè)。18個(gè)樣品的覆蓋率均達(dá)到了97%以上，說明每個(gè)樣品腸道內(nèi)容物中的微生物基本都被檢測出。

對各樣品測序結(jié)果進(jìn)行alpha多樣性指數(shù)分析發(fā)現(xiàn)：JX32的Chao1值最大，物種豐度最大；JX51的Chao1值最小，物種豐度最小；JX32的PD-whole-tree、Shannon、Simpson值最大，物種多樣性最高；JX51的PD-whole-tree、Shannon、Simpson值最小，物種多樣性最差(見表2)。方差分析(ANOVA)檢驗(yàn)顯示，3個(gè)年齡組江鱈腸道菌群的豐度及多樣性差異不顯著(P>0.05)，同一年齡的雌、雄江鱈之間，腸道菌群的豐度及多樣性差異不顯著(P>0.05)。

表2 測序結(jié)果及alpha多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)

2.3 OTU分布和豐度

由圖2可見，18個(gè)樣品共有的OTU數(shù)目為4，其中JX32中特有OTU數(shù)目(2 732)最多，JX51特有OTU數(shù)目(86)最少。豐度占比較高的OUT注釋到屬為Mycoplasma(支原體屬)，其在樣品中的豐度占比見表3。

注：花瓣圖以每個(gè)花瓣代表一個(gè)樣品，中間的core數(shù)字代表的是所有樣品共有的OTU數(shù)目，花瓣上的數(shù)字代表該樣品特有的OTU數(shù)目。圖2 OTU分布花瓣圖

表3 共有OTU在各樣品的豐度占比及排名

2.4 樣品優(yōu)勢菌群分析

由圖3可見，在門水平上，江鱈腸道內(nèi)容物優(yōu)勢菌群為變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、軟壁菌門(Tenericutes)、梭桿菌門(Fusobacteria)，其中變形菌門在94.44%的樣品中為優(yōu)勢菌群，厚壁菌門在88.88%的樣品中為優(yōu)勢菌群，軟壁菌門在83.33%的樣品中為優(yōu)勢菌門，梭桿菌門在72.20%的樣品中為優(yōu)勢菌群。有少數(shù)菌類只在個(gè)別樣品中為優(yōu)勢菌群。

由圖4可見，在屬水平上，江鱈腸道優(yōu)勢菌群為Mycoplasma(支原體屬)，其在83.33%的樣品中為優(yōu)勢菌群。Desulfovibrio(脫硫弧菌屬)在樣品JX31、JX33、JX41中為豐度占比第一的優(yōu)勢菌群。Macellibacteroides(屠場桿狀菌屬)在樣品JC32中為豐度占比第一的優(yōu)勢菌群。

2.5 PCA分析

由圖5可見，在第一象限，樣品JC41、JC42的腸道微生物群落形成一個(gè)組群，說明這兩個(gè)樣品的腸道微生物群落結(jié)構(gòu)差異較小；在第三象限，樣品JC43、JX42腸道微生物群落形成一個(gè)組群；在第四象限，樣品JX33、JC31、JX41腸道微生物群落形成1個(gè)組群。在各個(gè)象限，江鱈雌、雄組樣品沒有聚集，3齡、4齡、5齡組個(gè)別聚集在一起，沒有分組聚集。

圖5 PCA分析圖

2.6 組間文氏圖

由圖6可見，J3組OTU數(shù)為3 610，J4組OTU數(shù)為2 725，J5組OTU數(shù)為3 431。3組共有OTU數(shù)目為1 923，占J3組的53.27%，占J4組的70.56%，占J5組的56.05%。

圖6 OUT數(shù)目對比文氏圖

3 討論

3.1 樣品多樣性和豐度分析

本研究結(jié)果顯示，不同年齡組野生江鱈腸道內(nèi)容物的OTU總數(shù)為4 561。徐晟云等[14]研究發(fā)現(xiàn)，不同環(huán)境鱧(Channamaculate)腸道內(nèi)容物菌群結(jié)構(gòu)中的樣品OTU總數(shù)為585。李存玉[15]分析了池塘養(yǎng)殖牙鲆(Paralichthysolivaceus)腸道菌群結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)牙鲆腸道樣品OTU總數(shù)為367。黃麗麗等[16]對新疆冷水魚腸道微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其OTU總數(shù)為242。與上述魚類相比，本研究中野生江鱈的OTU總數(shù)較多，表明野生江鱈腸道中的微生物物種豐度和多樣性更高。本研究發(fā)現(xiàn)，不同江鱈樣品的OTU數(shù)不同，多樣性也不同，PCA分析也未發(fā)現(xiàn)樣品分組聚集。研究表明，魚類腸道微生物的數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)與其生存的水環(huán)境以及攝食條件等相關(guān)[15]。與池塘養(yǎng)殖水體環(huán)境相比，自然界中江鱈的生存環(huán)境范圍大，攝食范圍廣，天然餌料種類復(fù)雜，這可能是野生江鱈腸道中的微生物豐度和多樣性更高、不同年齡組PCA分析樣品間無聚集的原因。

3.2 樣品共有菌群分析

對樣品共有菌群的分析發(fā)現(xiàn)，Mycoplasma(支原體屬)為18個(gè)樣品共有的微生物種群，且在83.33%的樣品中為優(yōu)勢菌群。支原體廣泛存在于人和動物體內(nèi)，其中有許多是人類和各類動物的病原菌。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，支原體是魚類腸道正常菌群的一部分。劉銘等[17]應(yīng)用高通量測序技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，東海帶魚(Trichiurusspp.)腸道菌群中支原體屬為優(yōu)勢菌；Holben等[18]運(yùn)用16S rDNA測序技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，支原體在挪威養(yǎng)殖大馬哈魚(Oncorhynchusketa)、蘇格蘭養(yǎng)殖的大馬哈魚、野生大馬哈魚腸道菌群中的相對豐度分別為25%、81%、96%；Bano等[19]運(yùn)用變性梯度凝膠電泳(DGGE)方法對來自美國加州5處鹽沼的長頜姬蝦虎魚(Gillichthysmirabilis)的腸道菌群進(jìn)行了研究，也發(fā)現(xiàn)支原體與該魚為共生關(guān)系，且在該魚腸道菌群中占優(yōu)勢地位。本研究發(fā)現(xiàn)，每一個(gè)樣品的腸道菌群中都有支原體屬，且為優(yōu)勢菌群，這表明支原體屬菌可能在健康野生江鱈腸道菌群中大量存在，并在其健康和生理上發(fā)揮著未知的作用。在少數(shù)情況下，腸道中固有的微生物會通過直接損壞并穿過腸道上皮層或誘導(dǎo)組織損傷炎癥反應(yīng)造成水產(chǎn)動物疾病[20]，因此不能排除支原體屬菌在某些特定情況下導(dǎo)致江鱈患病的可能。雖然支原體通常被認(rèn)為具有宿主特異性，但已有研究表明，某些菌株也可在宿主間交叉感染[21]，如血營養(yǎng)支原體導(dǎo)致了人畜共患病[22]，人類在開展豚鼠試驗(yàn)時(shí)感染支原體[23]，免疫力低下的病人感染了其寵物狗體內(nèi)存在的犬支原體[24]等，因此，有必要對野生江鱈腸道菌群中的支原體進(jìn)行研究。支原體有可能會在人和其他物種之間轉(zhuǎn)移，尤其是有免疫缺陷或遭受生理變化(如壓力)的人或動物可能更容易感染外來支原體，從而面臨潛在的致病后果[25]。

3.3 樣品優(yōu)勢菌群及其作用

魚類腸道菌群的組成分析表明，在魚類腸道中變形菌門和厚壁菌門是最普遍和共存的細(xì)菌類群，而擬桿菌門在不同的魚類腸道中以較低豐度存在，例如斑馬魚(Brachydanioreriovar.)[26]、草魚(Ctenopharyngodonidellus)[27]、鯉(Cyprinuscarpio)[28]、褐點(diǎn)石斑魚(Epinephelusfuscoguttatus)[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，變形菌門和厚壁菌門是江鱈腸道內(nèi)容物的優(yōu)勢菌群，但在不同樣品中的豐度占比不同。此外，野生江鱈腸道中的優(yōu)勢菌群還有軟壁菌門和梭桿菌門。油九菊等[30]在探究東海帶魚腸道菌群結(jié)構(gòu)時(shí)也發(fā)現(xiàn)，東海帶魚腸道中存在梭桿菌門。

在屬水平上分析野生江鱈腸道內(nèi)容物優(yōu)勢菌群，發(fā)現(xiàn)除各組共有的支原體屬外，Desulfovibrio(脫硫弧菌屬)在樣品JX31、JX33、JX41中為豐度占比第一的優(yōu)勢菌群。Macellibacteroides(屠場桿狀菌屬)在樣品JC32中為豐度占比第一的優(yōu)勢菌群。脫硫弧菌的代謝產(chǎn)物是慢性胃腸道疾病的潛在致病因素[31]，且該菌在腸道疾病人群與健康人群之間存在明顯差異[32]。楊新宇等[33]在分析氨氣對小鼠腸道菌群的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，脫硫弧菌是氨氣脅迫腸道損傷的標(biāo)志性菌群。劉寒等[34]在分析日糧中高糖高脂對團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)肝臟及腸道微生物菌群組成的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，屠場桿狀菌屬可能與脂肪代謝相關(guān)。據(jù)此推測，屠場桿狀菌屬在野生江鱈腸道內(nèi)可能有類似的作用。魚類腸道菌群與其生活的水環(huán)境息息相關(guān)，水體環(huán)境的好壞直接影響到水生動物腸道菌群的優(yōu)勢種群，一些外來細(xì)菌也可能會改變魚類的腸道菌群結(jié)構(gòu)。本次研究中發(fā)現(xiàn)的不常見菌群可能與野生江鱈生活的環(huán)境有關(guān)，這有待采集水體樣本開展進(jìn)一步研究。