基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討柴胡-黃芩治療慢性腎功能衰竭的作用機(jī)制*

萬麗莎，李建英

1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250014；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬青島市中醫(yī)醫(yī)院，山東 青島 266033

慢性腎功能衰竭(chronic renal failure，CRF)的主要臨床表現(xiàn)是水、電解質(zhì)紊亂以及代謝產(chǎn)物和毒物潴留、酸堿平衡失調(diào)和全身各系統(tǒng)癥狀[1]，在中醫(yī)學(xué)中可歸為“腎勞” “癃閉”“關(guān)格”“溺毒”等范疇。全國第五批名老中醫(yī)藥專家學(xué)術(shù)經(jīng)驗(yàn)繼承指導(dǎo)老師、齊魯傷寒流派第三代傳人于俊生教授認(rèn)為慢性腎衰關(guān)乎少陽病變，CRF以和解少陽之法治療時(shí)應(yīng)首選小柴胡湯[2]，小柴胡湯以柴胡為君藥，黃芩為臣藥，柴胡疏散退熱、疏肝解郁、升舉陽氣，黃芩清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎[3]，二者配伍能和解少陽，運(yùn)轉(zhuǎn)少陽樞機(jī)，使之開合有度，邪有出路，是于俊生教授治療CRF臨床常用對藥[4]。前期研究證明，以柴胡、黃芩為主藥的小柴胡湯加減方柴半六合湯可緩解CRF患者的胃腸道癥狀，延緩CRF的進(jìn)一步發(fā)展[5]。以柴胡、黃芩為主藥的治療CRF的經(jīng)驗(yàn)方補(bǔ)腎排毒合劑可保護(hù)腎功能[6]，提高血白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白水平[7]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為研究中藥復(fù)方作用機(jī)制提供了新技術(shù)手段，可用于發(fā)現(xiàn)藥物靶標(biāo)，推進(jìn)中藥新藥研發(fā)，有益于中醫(yī)藥理論的發(fā)展和傳承[8]。本文使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法探討“和解少陽法”代表藥對“柴胡-黃芩”對CRF的作用機(jī)制，以期為后續(xù)的研究提供一定的參考。

1 資料與方法

1.1 柴胡、黃芩活性成分及相關(guān)靶點(diǎn)的篩選基于中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)[9]檢索柴胡、黃芩的化學(xué)成分，根據(jù)口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%且類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18進(jìn)行初步篩選，獲得柴胡、黃芩的活性成分和其對應(yīng)的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)，將未找到蛋白質(zhì)靶點(diǎn)的成分剔除，將蛋白質(zhì)靶點(diǎn)錄入U(xiǎn)niprot數(shù)據(jù)庫[10]，獲得其標(biāo)準(zhǔn)基因名。

1.2 CRF相關(guān)靶點(diǎn)篩選以“chronic renal failure”為關(guān)鍵詞，挖掘在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(online mendelian inheritance in man，OMIM)和GeneCards數(shù)據(jù)庫[11]中CRF的相關(guān)靶點(diǎn)。在GeneCards數(shù)據(jù)庫中，Relevance score值越大表示該靶點(diǎn)與疾病的聯(lián)系越密切，如果靶點(diǎn)過多則選擇Relevance score值大于中位數(shù)的靶點(diǎn)作為疾病的潛在靶點(diǎn)。將兩個(gè)數(shù)據(jù)庫中得到的靶點(diǎn)合并并刪除重復(fù)值后得到CRF的相關(guān)靶點(diǎn)。

1.3 蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選應(yīng)用Draw Venn Diagram在線工具將柴胡、黃芩活性成分相關(guān)靶點(diǎn)與CRF相關(guān)靶點(diǎn)取交集并繪制韋恩圖，得到的交集靶點(diǎn)即為柴胡-黃芩治療CRF的潛在靶點(diǎn)，在EXCEL表格中利用VLOOKUP函數(shù)映射出作用于潛在靶點(diǎn)的活性成分，將未映射到潛在靶點(diǎn)的成分剔除，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件，構(gòu)建“活性成分-潛在靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。將潛在靶點(diǎn)輸入STRING11.0數(shù)據(jù)庫[12]進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)模型構(gòu)建，物種設(shè)定為“Homo sapiens”，設(shè)置minimum required interaction score>0.9，隱藏游離節(jié)點(diǎn)，得到PPI網(wǎng)絡(luò)，將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0進(jìn)行可視化，并使用Cytohubba插件采用最大集團(tuán)中心性(maximal clique centrality，MCC)、最大鄰域分量(maximum neighborhood component，MNC)、度(degrees)算法挖掘核心靶點(diǎn)，參數(shù)為默認(rèn)設(shè)置，利用 Draw Venn Diagram在線工具取三個(gè)結(jié)果的交集，交集靶點(diǎn)為柴胡-黃芩作用于CRF的核心靶點(diǎn)。

1.4 潛在靶點(diǎn)的基因本體(gene ontology，GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)信號通路富集分析將柴胡-黃芩治療CRF的潛在靶點(diǎn)錄入Metascape平臺[13]，設(shè)置P<0.01，進(jìn)行GO功能的生物學(xué)過程(biological process，BP)富集分析及KEGG信號通路富集分析，并采用Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建“潛在靶點(diǎn)-信號通路”網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 柴胡-黃芩活性成分及相關(guān)靶點(diǎn)基于TCMSP初步提取柴胡化學(xué)成分349種、黃芩化學(xué)成分143種，以O(shè)B≥30%且DL≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選后獲得柴胡活性成分17種、黃芩活性成分36種，其中8種化合物未找到相關(guān)靶點(diǎn)，將其剔除后得到柴胡活性成分13種、黃芩活性成分32種，見表1。基于TCMSP獲得柴胡活性成分作用靶點(diǎn)181種，黃芩活性成分作用靶點(diǎn)120種，將兩味中藥活性成分的作用靶點(diǎn)合并，刪除重復(fù)值后共獲得216個(gè)藥物相關(guān)靶點(diǎn)。

表1 柴胡-黃芩活性成分相關(guān)信息表

2.2 CRF相關(guān)靶點(diǎn)從GeneCards數(shù)據(jù)庫中獲得慢性腎功能衰竭靶點(diǎn)8 596個(gè)，Relevance score最大值為112.941 818 2，最小值為0.188 800 812，中位數(shù)為3.540 131 807，篩選出Relevance score大于中位數(shù)的靶點(diǎn)4 298個(gè)，靶點(diǎn)仍較多，對篩選后的靶點(diǎn)進(jìn)行二次篩選，Relevance score最小值為3.540 928 125，中位數(shù)為7.813 783 407，篩選出Relevance score大于中位數(shù)的靶點(diǎn)2 149個(gè)。從OMIM數(shù)據(jù)庫中獲得慢性腎功能衰竭靶點(diǎn)578個(gè)，將兩個(gè)數(shù)據(jù)庫獲得的靶點(diǎn)合并后刪除重復(fù)值，最后獲得慢性腎功能衰竭相關(guān)靶點(diǎn)2 607個(gè)。

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)與核心靶點(diǎn)將216個(gè)活性成分相關(guān)靶點(diǎn)與2 607個(gè)CRF相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入Draw Venn Diagram進(jìn)行映射，得到137個(gè)交集靶點(diǎn)，即為柴胡-黃芩治療CRF的潛在作用靶點(diǎn)，并繪制韋恩圖。11，13-二十碳二烯酸甲酯未映射到潛在靶點(diǎn)，將其剔除，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件，構(gòu)建“活性成分-潛在靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，其中粉色矩形代表潛在靶點(diǎn)，圓形代表活性成分，圖形大小、顏色按照degree值大小形成，degree值越大，節(jié)點(diǎn)越大、顏色越深，說明該成分與潛在靶點(diǎn)越重要，分析可知槲皮素、山柰酚、漢黃芩素在柴胡-黃芩治療CRF中發(fā)揮重要作用。將潛在靶點(diǎn)輸入STRING11.0數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，并將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0進(jìn)行可視化，圖中節(jié)點(diǎn)代表潛在靶點(diǎn)，邊代表靶點(diǎn)間的互作關(guān)系，degree值越大，節(jié)點(diǎn)越大、顏色越深。使用Cytohubba插件中的MCC、MNC、Degrees算法挖掘核心靶點(diǎn)，將三種算法得出的核心靶點(diǎn)取交集并繪制韋恩圖，得出JUN、RELA、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤蛋白p53(tumor protein p53，TP53)、絲裂原活化蛋白激酶1(mitogen activated protein kinase 1，MAPK1)和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)6個(gè)靶點(diǎn)為柴胡-黃芩作用于CRF的核心靶點(diǎn)。見圖1—圖7。

注：DRUG：柴胡-黃芩相關(guān)靶點(diǎn)；CRF：慢性腎功能衰竭相關(guān)靶點(diǎn)

圖3 潛在靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 MCC算法分析結(jié)果

圖5 MNC算法分析結(jié)果

圖6 Degrees算法分析結(jié)果

圖7 三種算法核心靶點(diǎn)韋恩圖

2.4 GO功能富集分析和KEGG信號通路富集分析GO功能富集分析共得到5437個(gè)BP條目，主要包括對無機(jī)物的應(yīng)答(response to inorganic substance)、對損傷的應(yīng)答(response to wounding)、對脂多糖的應(yīng)答(response to lipopolysaccharide)等，設(shè)置P<0.01，根據(jù)P值排序后，選取排名前20位的條目繪制條形圖。KEGG信號通路富集分析篩選得到434條信號通路，主要涉及腫瘤相關(guān)通路(pathways in cancer)、IL-17信號通路(IL-17 signaling pathway)、TNF信號通路(TNF signaling pathway)、細(xì)胞凋亡(apoptosis)和PI3K-Akt 信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)等，設(shè)置P<0.01，根據(jù)P值排序后，選取排名前20位的條目繪制氣泡圖。采用 Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建“潛在靶點(diǎn)-信號通路”網(wǎng)絡(luò)圖，圖中黃色矩形代表靶點(diǎn)，粉色三角形代表通路，連線代表靶點(diǎn)與通路之間的關(guān)系，通過該網(wǎng)絡(luò)圖可知柴胡-黃芩可通過多條通路的協(xié)調(diào)作用發(fā)揮治療CRF的作用。見圖8—圖10。

圖8 GO功能富集分析-BP

圖9 KEGG信號通路富集分析

圖10 “潛在靶點(diǎn)-信號通路”網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

在我國，慢性腎臟病患病率達(dá)10.8%[14]，且患病率逐年升高[15]，CRF是各種慢性腎臟病發(fā)展至后期的一種臨床綜合征，目前CRF的西醫(yī)診治方案為治療原發(fā)病、控制CRF進(jìn)展的危險(xiǎn)因素和防治并發(fā)癥[16]，若發(fā)展至終末期則需選擇腎臟替代治療，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量，對家庭和社會也產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[17]。在此背景下，如何更好的防治CRF成為亟需解決的問題，而中醫(yī)藥不僅可以緩解CRF患者的近期癥狀，還能提高患者的生活質(zhì)量，為CRF的診療提供了更多的思路[18]。

CRF本虛在脾腎，標(biāo)實(shí)為痰濕瘀毒，脾腎之水液代謝，以三焦為通道，若少陽三焦樞機(jī)不利，則氣滯血瘀，痰濕不化，清濁不分，濁毒不排，故臨床治療應(yīng)重視和解少陽[19-20]。柴胡-黃芩為和解之法的經(jīng)典藥對，二者共奏通調(diào)少陽樞機(jī)之功，在臨床上應(yīng)用于多種系統(tǒng)疾病中[21]，既往研究顯示其有抗炎、抗氧化、抗凋亡等藥理作用[22]。

本研究得出柴胡-黃芩治療CRF的潛在作用靶點(diǎn)137個(gè)，發(fā)揮重要作用的活性成分有槲皮素、山柰酚和漢黃芩素等，篩選出6個(gè)核心靶點(diǎn)，包括JUN、RELA、IL-6、TP53、MAPK1和TNF。已有研究表明，TNF和IL-6與腎小球損害和硬化密切相關(guān)[23]。李玲等[24]研究顯示，TNF通過促進(jìn)腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞增殖促使腎間質(zhì)纖維化。IL-6是重要的炎癥參與因子，以自分泌及旁分泌兩種方式促進(jìn)腎小球系膜細(xì)胞增殖，進(jìn)而造成腎小球損害[25]。Zhang等[26]研究顯示，CRF患者腎臟中 IL-6 表達(dá)水平顯著增加，可直接誘導(dǎo)腎臟中纖維化基因表達(dá)和前內(nèi)皮素原1mRNA表達(dá)。RELA是 NF-κB 家族的亞單位之一，可通過多種翻譯后修飾包括磷酸化、乙?；?、甲基化和泛素化等調(diào)節(jié) NF-κB 的活性和功能[27]，而NF-κB 信號通路在腎間質(zhì)纖維化中起重要的作用[28]。由此推測，柴胡-黃芩主要通過緩解腎臟炎癥和腎纖維化達(dá)到改善腎功能的目的。

GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)，BP主要涉及對無機(jī)物的應(yīng)答、對損傷的應(yīng)答、對脂多糖的應(yīng)答等生物學(xué)過程。KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，與炎癥相關(guān)的通路 IL-17 信號通路、TNF信號通路、PI3K-Akt 信號通路等參與了柴胡-黃芩對CRF的治療作用。已有研究表明，TNF可促進(jìn)血管緊張素Ⅱ的生成，從而導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積，最終促進(jìn)腎纖維化[29]。P13K-Akt 信號通路可通過介導(dǎo)足細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、生長和代謝等，另外PI3K 可和下游分子 Akt 結(jié)合，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生，加快腎纖維化進(jìn)程[30]。

綜上所述，柴胡-黃芩中一種成分可以調(diào)控不同的作用靶點(diǎn)，同一靶點(diǎn)可以干預(yù)不同的信號通路，體現(xiàn)了柴胡-黃芩多成分、多靶點(diǎn)、多通路聯(lián)合作用的特點(diǎn)，且柴胡-黃芩主要通過調(diào)控炎癥相關(guān)靶點(diǎn)和通路發(fā)揮抗炎、抗纖維化作用從而改善腎功能。其中一些靶點(diǎn)和通路已在前期研究中得到驗(yàn)證，為臨床運(yùn)用“柴胡-黃芩”藥對治療CRF提供了科學(xué)依據(jù)。不足的是本研究未將柴胡-黃芩煎煮后的化學(xué)成分和其活性成分在體內(nèi)的代謝物納入研究，之后將在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)和臨床研究以闡明柴胡-黃芩治療慢性腎功能衰竭的具體機(jī)制。