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    滇龍膽居群遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析

    2023-02-08 03:21:04王元忠
    中草藥 2023年3期

    沈 濤 ,虞 泓*,王元忠

    1.玉溪師范學(xué)院化學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院,云南 玉溪 653100

    2.云南大學(xué)生態(tài)學(xué)與環(huán)境學(xué)院云百草實(shí)驗(yàn)室,云南 昆明 650091

    3.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所,云南 昆明 650200

    分子標(biāo)記可直接檢測DNA 分子上的遺傳變異,是探索藥用植物遺傳多樣性與居群遺傳結(jié)構(gòu)的重要工具[2]。近年單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)因其在基因組中位點(diǎn)多、分布廣,具有較好的多態(tài)性和較高的遺傳穩(wěn)定性,被國內(nèi)外研究者所關(guān)注[11-13];全基因組測序有助于獲取高質(zhì)量SNP 數(shù)據(jù),但與農(nóng)作物相比多數(shù)藥用植物研究面臨基因組測序基礎(chǔ)薄弱、分析缺乏模式物種及有效參考基因、后續(xù)SNP 標(biāo)記開發(fā)難度大等問題[14-16]。近年GBS(genotyping-by-sequencing)簡化基因組(reduced-representation genome sequencing,RRGS)技術(shù)的發(fā)展成為解決上述問題的重要途徑[17-18]。Otto 等[19]通過GBS 技術(shù)確定了藥用植物母菊Matricaria chamomillaL.的遺傳結(jié)構(gòu),并通過全基因組關(guān)聯(lián)作圖鑒定了與植株花期、藥效成分積累相關(guān)的SNP 位點(diǎn)。Qiao 等[7]基于GBS技術(shù)與SNP 標(biāo)記,分析了四川、青海等地川西獐牙菜Swertia mussotiiFranch.的遺傳結(jié)構(gòu),同時結(jié)合分布區(qū)環(huán)境數(shù)據(jù),探討了物種遺傳多樣性形成的可能機(jī)制。此外,張笑[20]則利用GBS 技術(shù)結(jié)合物種生態(tài)位模擬,開展絞股藍(lán)Gynostemma pentaphyllum(Thunb.)Makino 居群遺傳學(xué)與進(jìn)化歷史研究。以上報道表明GBS 與SNP 技術(shù)相結(jié)合的分析策略,可為傳統(tǒng)藥用植物資源多樣性評價提供新的方法和研究思路。

    滇龍膽Gentiana rigescensFranch.ex Hemsl.為傳統(tǒng)保肝中藥龍膽的主要植物來源,云南及周邊地區(qū)是其藥材主產(chǎn)地[21-22]。作為云南邊疆少數(shù)民族山區(qū)脫貧攻堅和鄉(xiāng)村振興的特色藥用植物,開展滇龍膽種質(zhì)資源多樣性評價對其藥用資源的永續(xù)利用及科學(xué)保護(hù)具有重要意義。當(dāng)前滇龍膽資源學(xué)研究主要集中于化學(xué)評價[23-25],種質(zhì)資源遺傳多樣性與調(diào)查評估鮮有報道[26-27]。國內(nèi)學(xué)者利用核糖體DNA(rDNA)ITS 序列和多個葉綠體DNA(cpDNA)序列片段,初步探討了云南滇龍膽野生居群的遺傳變異與分化,發(fā)現(xiàn)滇龍膽對環(huán)境適應(yīng)性較強(qiáng),不同居群間遺傳關(guān)系較復(fù)雜[26-27]。滇龍膽分布區(qū)跨越橫斷山區(qū)與云貴高原,區(qū)域內(nèi)從南至北伴隨海拔逐漸升高,生境氣候條件也呈現(xiàn)出較大差異[28];不同環(huán)境條件滇龍膽居群的遺傳多樣性及其變化有待探明。

    本研究以生長于橫斷山區(qū)和云貴高原的野生滇龍膽為材料,基于GBS 簡化基因組測序和SNP 分子標(biāo)記,研究滇龍膽居群遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu);探討異質(zhì)環(huán)境對該物種遺傳分化的影響作用。研究結(jié)果為滇龍膽種質(zhì)資源多樣性評價,野生資源保護(hù)及遺傳資源的發(fā)掘利用提供理論依據(jù)。

    1 材料與儀器

    1.1 材料

    2019—2020 年對云南、貴州和四川的19 滇龍膽居群147 株健康野生植株進(jìn)行采樣;所有樣品經(jīng)云南大學(xué)虞泓教授鑒定為滇龍膽G.rigescensFranch.ex Hemsl.。采樣居群10 個分布于橫斷山區(qū),9 個分布于云貴高原;采樣信息詳見表1。居群內(nèi)采樣個體間距離不小于10 m;個體數(shù)較少的居群采樣4~5 株,其余居群采樣數(shù)>9 株;每株個體采摘帶葉柄新鮮無病害葉10~15 片,去除葉面灰塵后迅速放入獨(dú)立的分子材料袋內(nèi),包埋于潔凈的變色硅膠中干燥保存。憑證標(biāo)本保存于云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所標(biāo)本館,居群信息詳見表1。

    表1 滇龍膽居群采樣信息Table 1 Sampling information of G.rigescens populations

    1.2 儀器

    Agilent 2100 Bioanalyzer 型生物分析儀(美國安捷倫公司)、NanoPhotometer N60 型微量分光光度計(德國因普恩公司)、Invitrogen Qubit Flex 型Qubit熒光光度計(美國賽默飛公司)、VeritiPro 型PCR儀(美國賽默飛公司)。

    2 方法

    2.1 樣品DNA 提取

    采用CTAB 法,從低溫保存的干燥葉片中提取滇龍膽測序所需基因組DNA[11,29]。測序前,提取的DNA 均使用1.00%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,結(jié)合微量分光光度計和Qubit熒光光度計檢測DNA的濃度(OD)和純度[30]。

    百年風(fēng)雨,滄桑巨變,故宮從輝煌到離亂再到新生的路途,又何嘗不是中華民族百年起伏的投影與寫照?鳳凰涅槃,浴火重生,中華民族偉大復(fù)興的征途,將由我們寫就,讓我們昂首闊步,勇敢前行。

    2.2 文庫構(gòu)建與測序

    滇龍膽基因組信息較缺乏,因此研究采用無參考基因的GBS 技術(shù)進(jìn)行測序。文庫構(gòu)建與測序主要參考Sonah 等[31]的方法。建庫流程主要包括DNA酶切、接頭鏈接、片段篩選、PCR 文庫富集及純化等流程[32]。測序工作由Illumina NovaSeq 6000 測序平臺完成,測序策略為雙端測序(paired-end,PE),每端150 bp;以上GBS 測序工作在廣州基迪奧生物科技有限公司內(nèi)完成。

    2.3 數(shù)據(jù)過濾與SNP 挖掘

    SNP 分析前為保證數(shù)據(jù)質(zhì)量需對測序后原始數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)過濾并減少噪音;數(shù)據(jù)過濾過程中,含有接頭(adapter)、無法識別堿基(N 堿基)或含有較大比例低質(zhì)量堿基的片段(reads)均需要處理和剔除[20]。以上分析由數(shù)據(jù)質(zhì)控軟件fastp(Version:0.18.0)完成。利用BWA(Version:0.7.12)軟件進(jìn)行對比;使用變異檢測軟件GATK(Version:3.4.46)進(jìn)行群體SNP 檢測,并對原始數(shù)據(jù)的質(zhì)量進(jìn)行過濾;在此基礎(chǔ)上用ANNOVAR(Version:2.0)分析基因組數(shù)據(jù)中的遺傳變異,并對檢測出的變異進(jìn)行功能注釋;使用VCFtools(Version:0.1.13)依據(jù)文獻(xiàn)設(shè)定參數(shù)對數(shù)據(jù)再次進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)量過濾[7];最終獲得高質(zhì)量的SNP 數(shù)據(jù)集,用于滇龍膽的居群遺傳學(xué)分析。

    2.4 遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)分析

    選取近年文獻(xiàn)報道較多的指標(biāo)[7,9],利用perl 腳本與樣品SNP 信息計算居群的觀測雜合度(observed heterozygosity,Ho)、期望雜合度(expected heterozygosity,He)、多態(tài)信息含量(polymorphic information,PIC)、Shannon 多樣性指數(shù)(shannon’s diversity index,I)、Nei’s 多樣性指數(shù)(Nei’s gene diversity,Nei’s)、核苷酸多樣性(nucleotide diversity,π)、遺傳分化系數(shù)(genetic differentiation index,F(xiàn)ST)和基因流(gene flow,Nm)。

    采用 Stack(Version 1.43)軟件與鄰接法(neighbor-joining methods,NJ)構(gòu)建進(jìn)化樹;GCTA(genome-wide complex trait analysis)軟件用于主成分分析(principal component analysis,PCA);利用ADMIXTURE 軟件(Version 1.3.0)結(jié)合SNPs 數(shù)據(jù)集和最大似然法(maximum-likelihood methods,ML)對滇龍膽居群的遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行推算;預(yù)先設(shè)定K值為1~10,選取最低交叉驗(yàn)證錯誤率對應(yīng)的K作為最優(yōu)分群方法,用于推測居群個體可能的分組。

    2.5 環(huán)境因子分析與Mantel 檢驗(yàn)

    利用ArcGIS 提取19 個居群對應(yīng)的水分、熱量、UV-B 輻射等環(huán)境因子(表2)數(shù)值分析橫斷山區(qū)與云貴高原滇龍膽分布區(qū)的環(huán)境差異。環(huán)境變量中生物氣候變量(Bio01~Bio19)和活動積溫(10AAT)分別由WorldClim(https://worldclim.org)與中國科學(xué)院資源環(huán)境與數(shù)據(jù)中心(https://www.resdc.cn/)提供,UV-B輻射相關(guān)數(shù)據(jù)源自glUV 網(wǎng)站(https://www.ufz.de/gluv/)。Mann-Whitney U 檢驗(yàn)用于不同分布區(qū)環(huán)境因子的差異比較;基于差異顯著的環(huán)境因子計算不同居群間的環(huán)境距離(Environmental distance,ED),利用居群經(jīng)緯度信息計算居群間地理距離(Geographical distance,GD)[33-34];本研究中ED 和GD 均為歐式距離。Mantel 檢驗(yàn)用于分析居群間FST與地理距離、環(huán)境距離間的相關(guān)性[34]。Mann-Whitney U檢驗(yàn)由IBM SPSS Station 25.0 計算;Mantel 檢驗(yàn)在XLSTAT(Version 2019.2.2)中完成;其余統(tǒng)計分析由SIMCA(Version 14.1)完成。

    表2 研究涉及環(huán)境因子Table 2 Environment factors used in the study

    3 結(jié)果與分析

    3.1 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果

    滇龍膽GBS 簡化基因組測序結(jié)果統(tǒng)計顯示,數(shù)據(jù)經(jīng)過濾后,數(shù)據(jù)集測序質(zhì)量值Q20(堿基錯誤率<1.00%)平均值為97.81%,測序質(zhì)量值Q30(堿基錯誤率<0.10%)平均值為93.55%,平均CG 含量為41.07%,N 堿基含量為0.00%,表明測序結(jié)果出錯率低,數(shù)據(jù)總體質(zhì)量較高。測序樣品高質(zhì)量序列(HQ clean reads)條數(shù)均值為10 923 810,中位數(shù)為9 527 980,每份樣品平均測序序列數(shù)據(jù)量約1.55 Gb。

    3.2 滇龍膽居群遺傳結(jié)構(gòu)

    基于篩選后的SNPs 數(shù)據(jù)集,運(yùn)用鄰接法構(gòu)建19 個居群147 株滇龍膽的系統(tǒng)樹。系統(tǒng)樹分析結(jié)果顯示(圖1),不同地理來源的樣品可大致分為2 個分支。第1 分支主要是生長在云貴高原的滇龍膽,包括滇中的中山(CX)、雙柏(SB)、紅塔(HT)居群,滇西昌寧(CN)、耿馬(GM)、云縣(YX)居群以及貴州西北部的納雍(NY)居群部分個體;此外四川樂山(LS)居群的滇龍膽也被聚到第1 個分支中。第2 分支主要為云貴高原以北地區(qū)分布的滇龍膽;包括滇西北福貢(FG)、維西(WX)、鶴慶(HQ)、新華(XH)、玉龍(YL)、永勝(YS)居群,川西南的攀枝花(PZH)、寧南(NN)和西昌(XC)居群;除上述地區(qū)的滇龍膽,滇中華寧(HN)聚居及滇東南文山(WS)居群的樣品也被聚到第2分支中。系統(tǒng)樹顯示,同一居群的樣品基本聚在一起,相近地理區(qū)域的樣品多聚為一類,分布于云貴高原和滇西北橫斷山區(qū)的植株聚為不同分支,表明上述地區(qū)的滇龍膽在遺傳上呈現(xiàn)出較明顯的地域分異。

    圖1 滇龍膽19 個居群147 株個體基于SNPs 數(shù)據(jù)集聚分析Fig.1 Cluster analysis of 147 individuals in 19 populations of G.rigescens based on the SNPs data set

    PCA 三維得分圖顯示(圖2),所有樣品依據(jù)得分大致聚為4 組。第I 組樣品主要由云南鶴慶(HQ)、玉龍(YL)2 個居群的滇龍膽構(gòu)成;第II 組樣品主要由云南新華(XH)、永勝(YS)、福貢(FG)、維西(WX)及四川西昌(XC)、寧南(NN)居群的植株構(gòu)成;第 III 組樣品主要為四川攀枝花(PZH)、云南玉溪(HN)和文山(WS)居群的植株;第IV 組樣品為云南南昌寧(CN)、臨滄(YX、GM)、楚雄(CX、SB)、玉溪(HT)及四川樂山(LS)、貴州納雍(NY)的居群的滇龍膽構(gòu)成。

    圖2 滇龍膽19 個居群147 株個體SNPs 數(shù)據(jù)集主成分分析Fig.2 PCA of 147 individuals in 19 populations of G.rigescens based on SNPs data set

    19 個滇龍膽居群的遺傳結(jié)構(gòu)分組研究發(fā)現(xiàn),隨K值增加模型交叉驗(yàn)證誤差逐步降低;當(dāng)K為4 時誤差值達(dá)到谷值,因此K=4 是最優(yōu)分群方法(圖3)。

    圖3 滇龍膽19 個居群147 株個體SNPs 數(shù)據(jù)集遺傳結(jié)構(gòu)最佳K 值篩選Fig.3 Optimum K value selection for genetic structure of 147 individuals in 19 populations of G.rigescens based on SNPs data set

    基于最優(yōu)分組結(jié)果發(fā)現(xiàn),19 個居群的基因型從地理上呈現(xiàn)出明顯的地域特征(圖4)。4 個亞群中,紅色基因型個體主要存在于鶴慶(HQ)和玉龍(YL)2個居群中;橙色基因型個體主要生長在滇西北和川西南地區(qū)(攀枝花居群除外)。保山昌寧、楚雄雙柏、玉溪紅塔及四川樂山居群中藍(lán)色基因型占主導(dǎo)地位;四川攀枝花、云南華寧和云南文山3 個居群植株均以綠色基因型為主。云南耿馬、云縣及貴州納雍居群具有明顯的種質(zhì)混雜,其組成可能來源于多個理論祖先亞群。

    圖4 滇龍膽19 個居群的遺傳結(jié)構(gòu)分組 (K=4)Fig.4 Genetic structure analysis of 19 Gentiana rigescens population (K=4)

    綜合以上分析結(jié)果認(rèn)為以滇西昌寧(CN)—黔西納雍(NY)一線為界,滇龍膽居群遺傳結(jié)構(gòu)在云貴高原和橫斷山區(qū)間呈現(xiàn)出明顯的南北差異。依據(jù)研究樣品地理來源和簡化基因組分析結(jié)果,19 個居群的滇龍膽有4 種基因型,并可劃分為北部(共計10 個居群)和南部(共計9 個居群)2 個組。北部組主要分布在橫斷山區(qū)(滇西北和川西南),組內(nèi)基因型I 和基因型II 占比較高;南部組主要分布于云貴高原,組內(nèi)基因型III 和基因型IV 占比較高。

    3.3 居群遺傳多樣性

    3.3.1 橫斷山區(qū)居群遺傳多樣性 對分布于橫斷山區(qū)的10 個滇龍膽居群遺傳多樣性參數(shù)進(jìn)行計算,結(jié)果顯示(表3),10 個居群6 個遺傳參數(shù)均值分別為Ho=0.051(數(shù)值0.040~0.070),He=0.098(數(shù)值0.085~0.111),PIC=0.077(數(shù)值0.067~0.088),I=0.144(數(shù)值0.125~0.163),Nei’s=0.114(數(shù)值0.100~0.133),π=1.175×10-3(數(shù)值0.823×10-3~1.625×10-3)。

    表3 橫斷山及周邊地區(qū)滇龍膽10 個居群的遺傳多樣性參數(shù)Table 3 Genetic diversity parameters of 10 population of G.rigescens in Hengduan Mountains and its surrounding areas

    3.3.2 云南貴高原居群遺傳多樣性 分布于云貴高原的滇龍膽居群遺傳多樣性參數(shù)統(tǒng)計結(jié)果顯示(表4),9 個居群遺傳參數(shù)均值分別為:Ho=0.052(數(shù)值0.042~0.072),He=0.110(數(shù)值0.088~0.141),PIC=0.088(數(shù)值0.071~0.113),I=0.164(數(shù)值0.132~0.211),Nei’s=0.127(數(shù)值0.098~0.161),π=1.677×10-3(數(shù)值1.209×10-3~2.261×10-3)。

    表4 云貴高原滇龍膽9 個居群的遺傳多樣性參數(shù)Table 4 Genetic diversity parameters of nine population of G.rigescens in Yunnan-Guizhou Plateau

    19 個居群遺傳多樣性參數(shù)總體計算顯示,Ho=0.037,He=0.268,PIC=0.223,I=0.426,Nei’s=0.279,π=1.399×10-3。綜合比較橫斷山區(qū)居群和云貴高原居群He、No、I、Nei’s、PIC 和π6 個遺傳多樣性參數(shù)的數(shù)值變化,并對2 組數(shù)據(jù)進(jìn)行Mann-Whitney U 檢驗(yàn)(圖5)。均值和中位數(shù)比較發(fā)現(xiàn),橫斷山區(qū)滇龍膽居群的遺傳多樣性較云貴高原居群低,其中π值組間差異顯著(Mann-Whitney U 檢驗(yàn)P<0.05)。

    圖5 橫斷山區(qū)與云貴高原滇龍膽居群遺傳多樣性比較Fig.5 Genetic diversity comparison between the Hengduan Mountains population and the Yunnan-Guizhou Plateau population of G.rigescens

    3.4 遺傳分化與基因流

    3.4.1 橫斷山區(qū)居群 橫斷山及周邊地區(qū)10 個滇龍膽居群FST的均值為0.471,F(xiàn)ST數(shù)值變化范圍0.163~0.580,鶴慶(HQ)居群與玉龍(YL)居群間FST值最小,攀枝花(PZH)居群與玉龍(YL)居群間FST值最大(表5)。除鶴慶、玉龍2 個居群,橫斷山區(qū)滇龍膽群間總體呈現(xiàn)出中等或較高水平的遺傳分化。

    表5 橫斷山及周邊地區(qū)滇龍膽10 個居群的FST 數(shù)值Table 5 FST value between 10 population of G.rigescens in Hengduan Mountains and its surrounding areas

    Nm計算顯示(表6),橫斷山區(qū)10 個居群間Nm數(shù)值介于0.181~1.279;僅鶴慶(HQ)居群與玉龍(YL)居群間Nm值大于1.000,其余44 對居群的Nm值均小于1.000。Nm數(shù)據(jù)分析顯示,除滇西北少數(shù)居群外,橫斷山區(qū)大部分居群間的基因交流均受到不同程度的阻隔。

    表6 橫斷山及周邊地區(qū)滇龍膽10 個居群的Nm 數(shù)值Table 6 Nm value between 10 population of G.rigescens in Hengduan Mountains and its surrounding areas

    3.4.2 云南貴高原居群 云貴高原9 個滇龍膽居群FST均值為0.422,F(xiàn)ST數(shù)值0.227~0.576,中山(CX)居群與雙柏(SB)居群間FST值最小,南華(NH)居群與昌寧(CN)居群間FST值最大。貴州納雍的居群(NN)與云貴高原其它地區(qū)的居群呈現(xiàn)出不同程度的遺傳分化,居群間FST值在0.373~0.495(表7)。

    表7 云貴高原滇龍膽9 個居群的FST 數(shù)值Table 7 FST value between nine population of G.rigescens in Yunnan-Guizhou Plateau

    Nm分析顯示(表8),云貴高原9 個居群間Nm值變化范圍:0.184~0.853;3 對居群Nm值小于0.200,13 對居群Nm值小于0.300,6 對居群群Nm值小于0.400,10 對居群Nm值小0.600,僅有4 對居群Nm值在0.603~0.853。貴州境內(nèi)滇龍膽居群與云南境內(nèi)滇龍膽居群間Nm值多小于0.400;滇中華寧居群與滇東南文山群間Nm值較高為0.754;綜合比較發(fā)現(xiàn),滇龍膽居群間基因流在滇中與滇西地區(qū)較強(qiáng)。

    表8 云貴高原滇龍膽9 個居群的Nm 數(shù)值Table 8 Nm value between nine population of G.rigescens in Yunnan-Guizhou Plateau

    3.4.3 遺傳變異分析 滇龍膽19 個居群的遺傳變異分析顯示(表9),遺傳變異主要來源于居群內(nèi),占總變異的86.99%;剩余13.01%的變異來源于居群間。

    表9 滇龍膽19 個居群的分子變異分析Table 9 AMOVA results of 19 population of G.rigescens

    3.5 地理距離、環(huán)境距離對居群遺傳分化的影響

    3.5.1 橫斷山區(qū)與云貴高原環(huán)境差異分析Mann-Whitney U 檢驗(yàn)結(jié)合分布區(qū)23 個環(huán)境因子數(shù)據(jù)(表2)的統(tǒng)計分析顯示,橫斷山區(qū)與云貴高原滇龍膽生境在熱量指標(biāo)和UV-B 輻射兩方面存在顯著差異(表10),溫度季節(jié)性變化(Bio 04)、最冷月最低溫度(Bio 06)、溫度年較差(Bio 07)、活動積溫(10AAT)、UV-B 輻射季節(jié)性變化(UV-B A2)、UV-B 輻射最強(qiáng)月份平均值(UV-B A3)以及UV-B 輻射最強(qiáng)季度月均值總和(UV-B A5)在居群間差異顯著(P<0.05)。

    表10 橫斷山區(qū)與云貴高原差異顯著的環(huán)境變量Table 10 Environmental variables with significant differences between Hengduan Mountains and Yunnan-Guizhou Plateau

    對上述差異顯著的7 個環(huán)境變量進(jìn)行PCA,結(jié)合雙標(biāo)圖顯示(圖6),7 個環(huán)境變量均遠(yuǎn)離圓心,表明上述環(huán)境變量可作為區(qū)分不同居群生境的特征變量;7 個變量進(jìn)一步劃分為3 組,Bio 04 與Bio 07為第1 組(均在第1 象限),Bio 06 與10AAT 為第2 組(均在第2 象限),所有UV-B 輻射變量為第3組(均在第3 象限)。綜合上述,Bio 04、Bio 07、Bio 06 等7 個變量能較好反映19 個居群的生境差異與環(huán)境特征,適用于計算居群間環(huán)境距離。

    圖6 基于7 個環(huán)境變量的PCA 雙標(biāo)圖Fig.6 Biplot based on PCA of seven environment variables

    3.5.2 Mantel 檢驗(yàn) Mantel 檢驗(yàn)顯示(表11),地理距離(GD)與居群FST相關(guān)性不顯著(P>0.05);環(huán)境距離與FST顯著相關(guān)(P<0.05)。為進(jìn)一步分析影響居群遺傳分化的主要環(huán)境因子,分別用表10 中的4 個熱量指標(biāo)和3 個UV-B 輻射指標(biāo)計算環(huán)境距離,并與居群FST進(jìn)行Mantel 檢驗(yàn)。結(jié)果顯示(表11),居群間UV-B 輻射指標(biāo)與FST呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),熱量指標(biāo)與FST相關(guān)性不顯著(P>0.05)。以上結(jié)果表明,橫斷山區(qū)和云貴高原滇龍膽居群間的遺傳分化可能與生境UV-B 輻射變化有關(guān)。

    表11 遺傳距離與地理距離、環(huán)境距離的Mantel 檢驗(yàn) (基于斯皮爾曼相關(guān)系數(shù))Table 11 Mantel tests for the correlation between genetic distance and geographic distance,environmental distance(Spearman’ s coefficient)

    4 討論

    4.1 滇龍膽遺傳結(jié)構(gòu)與遺傳多樣性

    基于GBS 簡化基因組測序,對分布于云南、四川、貴州的19 個居群147 株個體居群遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性進(jìn)行分析。發(fā)現(xiàn)滇龍膽野生居群基因型豐富,其中四川樂山(LS)、貴州納雍(NY)、云南楚雄(CX)、臨滄(YX、GM)等地居群存在種質(zhì)混雜。19 個居群依據(jù)遺傳結(jié)構(gòu)從地理上大致可劃分為北部、南部2 個組。北部組居群主要分布于滇西北橫斷山區(qū)及川西南山區(qū),南部組居群主要分布于云貴高原。

    北部組與南部組各居群FST平均值分別為0.471、0.422;物種FST值與線葉龍膽G.lawrenceivar.farreri(I.B.Balfour) T.N.Ho 較接近,高于多花龍膽G.striolataT.N.Ho、阿墩子龍膽G.atuntsiensisW.W.Smith,低于鉆葉龍膽G.haynaldiiKanitz[35-36]。遺傳變異分析顯示滇龍膽個體間遺傳多樣性較高,種內(nèi)變異有13.01%源自居群間,其余86.99%均來自居群內(nèi)。該結(jié)果與龍膽科藥用植物線葉龍膽和川西獐牙菜較相似[7,37]。居群間Nm數(shù)值變化分析顯示,橫斷山區(qū)各居群Nm值在0.181~1.279,云貴高原各居群Nm值在0.184~0.853。結(jié)合趙宗蘋等[27]的研究結(jié)果認(rèn)為,滇龍膽居群間存在一定的遺傳分化和基因流,但不同分布區(qū)居群間遺傳分化程度及基因流強(qiáng)度存在差異。

    基于I、Nei’s、π等參數(shù)的分析結(jié)果,與龍膽屬其他物種對比發(fā)現(xiàn),滇龍膽遺傳多樣性較分布于青藏高原和橫斷山區(qū)的線葉龍膽、六葉龍膽G.hexaphyllaMaxim.ex Kusnez.、三葉龍膽G.ternifoliaFranch.低[37-38],與麻花艽G.stramineaMaxim.和粗莖秦艽G.crassicaulisDuthie ex Burk.較接近[11,39]。將19 個居群依據(jù)其地理分布進(jìn)行劃分發(fā)現(xiàn),橫斷山居群與云貴高原居群的遺傳多樣性具有差異;分布于橫斷山區(qū)的滇龍膽遺傳多樣性總體低于分布于云貴高原的滇龍膽。

    4.2 生境差異對居群遺傳分化的影響

    物種多樣性及特異種質(zhì)的形成通常與地理隔離或特殊生境適應(yīng)有關(guān)[40-41]。利用Mantel 檢驗(yàn)分析了滇龍膽居群間遺傳距離與地理距離、環(huán)境距離的相關(guān)性;結(jié)果顯示居群FST數(shù)值的變化與地理距離相關(guān)性不顯著(P>0.05),而與環(huán)境距離緊密相關(guān)(P<0.05)。該結(jié)果暗示環(huán)境隔離(isolation by environment,IBE)可能在驅(qū)動滇龍膽群遺傳分化方面發(fā)揮了重要作用。

    較復(fù)雜的地形可能對居群間種子流和花粉流造成影響,使物種的遺傳分化與地理距離不相關(guān)[42]。滇龍膽為蟲媒花,繁育系統(tǒng)為兼性異交型[43];種子有蜂窩狀網(wǎng)紋,僅適合短距離風(fēng)媒傳播[28]。橫斷山區(qū)內(nèi)部及橫斷山與云貴高原間的居群可能因高大山脈或河流、峽谷阻隔,影響植株授粉及種子傳播;導(dǎo)致居群間遺傳分化與地理距離不相關(guān)。此外,槭樹Acer ginnalaMaxim.、青楊Populus cathayanaRehd.、無患子Sapindus mukorossiGaertn.等物種研究表明對于分布較廣,分布區(qū)地貌復(fù)雜、生境條件差異大的物種,居群水平的遺傳分化更多與分布區(qū)環(huán)境差異形成的選擇壓有關(guān)[42,44-45]。滇龍膽分布區(qū)北部屬云貴高原與青藏高原的過渡區(qū),海拔總體較高;分布區(qū)南部多為向西下降的盆地,海拔相對較低[46]。分布區(qū)地勢變化總體呈現(xiàn)高緯度與高海拔相結(jié)合,低緯度與低海拔相一致的特點(diǎn),進(jìn)一步加劇了南北分布區(qū)的UV-B 輻射強(qiáng)度差異[46-47]。分布于青藏高原的麻花艽研究顯示,改變生境UV-B 輻射強(qiáng)度可對植株葉片厚度、呼吸強(qiáng)度、光合作用等造成影響[48-50];同時麻花艽在長期進(jìn)化過程中也形成對UV-B 輻射強(qiáng)度變化的適應(yīng)機(jī)制[48]。通過Mantel檢驗(yàn)結(jié)合簡化基因組數(shù)據(jù)初步分析推測UV-B 輻射變化可能是驅(qū)動滇龍膽南部、北部居群遺傳分化的重要環(huán)境因素。目前UV-B 輻射對滇龍膽生理、生態(tài)的影響尚未見報道。對于生長于高海拔山區(qū)的龍膽屬植物,生境UV-B 輻射漸變?nèi)绾悟?qū)動滇龍膽種內(nèi)遺傳分化,上述遺傳變異對環(huán)境的適應(yīng)意義及對藥材質(zhì)量的影響仍有待后續(xù)深入研究。

    利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

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