滇龍膽居群遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析

沈 濤 ，虞 泓*，王元忠

1.玉溪師范學(xué)院化學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院，云南 玉溪 653100

2.云南大學(xué)生態(tài)學(xué)與環(huán)境學(xué)院云百草實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650091

3.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所，云南 昆明 650200

分子標(biāo)記可直接檢測(cè)DNA 分子上的遺傳變異，是探索藥用植物遺傳多樣性與居群遺傳結(jié)構(gòu)的重要工具[2]。近年單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）因其在基因組中位點(diǎn)多、分布廣，具有較好的多態(tài)性和較高的遺傳穩(wěn)定性，被國內(nèi)外研究者所關(guān)注[11-13]；全基因組測(cè)序有助于獲取高質(zhì)量SNP 數(shù)據(jù)，但與農(nóng)作物相比多數(shù)藥用植物研究面臨基因組測(cè)序基礎(chǔ)薄弱、分析缺乏模式物種及有效參考基因、后續(xù)SNP 標(biāo)記開發(fā)難度大等問題[14-16]。近年GBS（genotyping-by-sequencing）簡(jiǎn)化基因組（reduced-representation genome sequencing，RRGS）技術(shù)的發(fā)展成為解決上述問題的重要途徑[17-18]。Otto 等[19]通過GBS 技術(shù)確定了藥用植物母菊Matricaria chamomillaL.的遺傳結(jié)構(gòu)，并通過全基因組關(guān)聯(lián)作圖鑒定了與植株花期、藥效成分積累相關(guān)的SNP 位點(diǎn)。Qiao 等[7]基于GBS技術(shù)與SNP 標(biāo)記，分析了四川、青海等地川西獐牙菜Swertia mussotiiFranch.的遺傳結(jié)構(gòu)，同時(shí)結(jié)合分布區(qū)環(huán)境數(shù)據(jù)，探討了物種遺傳多樣性形成的可能機(jī)制。此外，張笑[20]則利用GBS 技術(shù)結(jié)合物種生態(tài)位模擬，開展絞股藍(lán)Gynostemma pentaphyllum(Thunb.)Makino 居群遺傳學(xué)與進(jìn)化歷史研究。以上報(bào)道表明GBS 與SNP 技術(shù)相結(jié)合的分析策略，可為傳統(tǒng)藥用植物資源多樣性評(píng)價(jià)提供新的方法和研究思路。

滇龍膽Gentiana rigescensFranch.ex Hemsl.為傳統(tǒng)保肝中藥龍膽的主要植物來源，云南及周邊地區(qū)是其藥材主產(chǎn)地[21-22]。作為云南邊疆少數(shù)民族山區(qū)脫貧攻堅(jiān)和鄉(xiāng)村振興的特色藥用植物，開展滇龍膽種質(zhì)資源多樣性評(píng)價(jià)對(duì)其藥用資源的永續(xù)利用及科學(xué)保護(hù)具有重要意義。當(dāng)前滇龍膽資源學(xué)研究主要集中于化學(xué)評(píng)價(jià)[23-25]，種質(zhì)資源遺傳多樣性與調(diào)查評(píng)估鮮有報(bào)道[26-27]。國內(nèi)學(xué)者利用核糖體DNA（rDNA）ITS 序列和多個(gè)葉綠體DNA（cpDNA）序列片段，初步探討了云南滇龍膽野生居群的遺傳變異與分化，發(fā)現(xiàn)滇龍膽對(duì)環(huán)境適應(yīng)性較強(qiáng)，不同居群間遺傳關(guān)系較復(fù)雜[26-27]。滇龍膽分布區(qū)跨越橫斷山區(qū)與云貴高原，區(qū)域內(nèi)從南至北伴隨海拔逐漸升高，生境氣候條件也呈現(xiàn)出較大差異[28]；不同環(huán)境條件滇龍膽居群的遺傳多樣性及其變化有待探明。

本研究以生長(zhǎng)于橫斷山區(qū)和云貴高原的野生滇龍膽為材料，基于GBS 簡(jiǎn)化基因組測(cè)序和SNP 分子標(biāo)記，研究滇龍膽居群遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)；探討異質(zhì)環(huán)境對(duì)該物種遺傳分化的影響作用。研究結(jié)果為滇龍膽種質(zhì)資源多樣性評(píng)價(jià)，野生資源保護(hù)及遺傳資源的發(fā)掘利用提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料

2019—2020 年對(duì)云南、貴州和四川的19 滇龍膽居群147 株健康野生植株進(jìn)行采樣；所有樣品經(jīng)云南大學(xué)虞泓教授鑒定為滇龍膽G.rigescensFranch.ex Hemsl.。采樣居群10 個(gè)分布于橫斷山區(qū)，9 個(gè)分布于云貴高原；采樣信息詳見表1。居群內(nèi)采樣個(gè)體間距離不小于10 m；個(gè)體數(shù)較少的居群采樣4～5 株，其余居群采樣數(shù)＞9 株；每株個(gè)體采摘帶葉柄新鮮無病害葉10～15 片，去除葉面灰塵后迅速放入獨(dú)立的分子材料袋內(nèi)，包埋于潔凈的變色硅膠中干燥保存。憑證標(biāo)本保存于云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所標(biāo)本館，居群信息詳見表1。

表1 滇龍膽居群采樣信息Table 1 Sampling information of G.rigescens populations

1.2 儀器

Agilent 2100 Bioanalyzer 型生物分析儀（美國安捷倫公司）、NanoPhotometer N60 型微量分光光度計(jì)（德國因普恩公司）、Invitrogen Qubit Flex 型Qubit熒光光度計(jì)（美國賽默飛公司）、VeritiPro 型PCR儀（美國賽默飛公司）。

2 方法

2.1 樣品DNA 提取

采用CTAB 法，從低溫保存的干燥葉片中提取滇龍膽測(cè)序所需基因組DNA[11,29]。測(cè)序前，提取的DNA 均使用1.00%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，結(jié)合微量分光光度計(jì)和Qubit熒光光度計(jì)檢測(cè)DNA的濃度（OD）和純度[30]。

百年風(fēng)雨，滄桑巨變，故宮從輝煌到離亂再到新生的路途，又何嘗不是中華民族百年起伏的投影與寫照？鳳凰涅槃，浴火重生，中華民族偉大復(fù)興的征途，將由我們寫就，讓我們昂首闊步，勇敢前行。

2.2 文庫構(gòu)建與測(cè)序

滇龍膽基因組信息較缺乏，因此研究采用無參考基因的GBS 技術(shù)進(jìn)行測(cè)序。文庫構(gòu)建與測(cè)序主要參考Sonah 等[31]的方法。建庫流程主要包括DNA酶切、接頭鏈接、片段篩選、PCR 文庫富集及純化等流程[32]。測(cè)序工作由Illumina NovaSeq 6000 測(cè)序平臺(tái)完成，測(cè)序策略為雙端測(cè)序（paired-end，PE），每端150 bp；以上GBS 測(cè)序工作在廣州基迪奧生物科技有限公司內(nèi)完成。

2.3 數(shù)據(jù)過濾與SNP 挖掘

SNP 分析前為保證數(shù)據(jù)質(zhì)量需對(duì)測(cè)序后原始數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)過濾并減少噪音；數(shù)據(jù)過濾過程中，含有接頭（adapter）、無法識(shí)別堿基（N 堿基）或含有較大比例低質(zhì)量堿基的片段（reads）均需要處理和剔除[20]。以上分析由數(shù)據(jù)質(zhì)控軟件fastp（Version：0.18.0）完成。利用BWA（Version：0.7.12）軟件進(jìn)行對(duì)比；使用變異檢測(cè)軟件GATK（Version：3.4.46）進(jìn)行群體SNP 檢測(cè)，并對(duì)原始數(shù)據(jù)的質(zhì)量進(jìn)行過濾；在此基礎(chǔ)上用ANNOVAR（Version：2.0）分析基因組數(shù)據(jù)中的遺傳變異，并對(duì)檢測(cè)出的變異進(jìn)行功能注釋；使用VCFtools（Version：0.1.13）依據(jù)文獻(xiàn)設(shè)定參數(shù)對(duì)數(shù)據(jù)再次進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)量過濾[7]；最終獲得高質(zhì)量的SNP 數(shù)據(jù)集，用于滇龍膽的居群遺傳學(xué)分析。

2.4 遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)分析

選取近年文獻(xiàn)報(bào)道較多的指標(biāo)[7,9]，利用perl 腳本與樣品SNP 信息計(jì)算居群的觀測(cè)雜合度（observed heterozygosity，Ho）、期望雜合度（expected heterozygosity，He）、多態(tài)信息含量（polymorphic information，PIC）、Shannon 多樣性指數(shù)（shannon’s diversity index，I）、Nei’s 多樣性指數(shù)（Nei’s gene diversity，Nei’s）、核苷酸多樣性（nucleotide diversity，π）、遺傳分化系數(shù)（genetic differentiation index，F(xiàn)ST）和基因流（gene flow，Nm）。

采用 Stack（Version 1.43）軟件與鄰接法（neighbor-joining methods，NJ）構(gòu)建進(jìn)化樹；GCTA（genome-wide complex trait analysis）軟件用于主成分分析（principal component analysis，PCA）；利用ADMIXTURE 軟件（Version 1.3.0）結(jié)合SNPs 數(shù)據(jù)集和最大似然法（maximum-likelihood methods，ML）對(duì)滇龍膽居群的遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行推算；預(yù)先設(shè)定K值為1～10，選取最低交叉驗(yàn)證錯(cuò)誤率對(duì)應(yīng)的K作為最優(yōu)分群方法，用于推測(cè)居群個(gè)體可能的分組。

2.5 環(huán)境因子分析與Mantel 檢驗(yàn)

利用ArcGIS 提取19 個(gè)居群對(duì)應(yīng)的水分、熱量、UV-B 輻射等環(huán)境因子（表2）數(shù)值分析橫斷山區(qū)與云貴高原滇龍膽分布區(qū)的環(huán)境差異。環(huán)境變量中生物氣候變量（Bio01～Bio19）和活動(dòng)積溫（10AAT）分別由WorldClim（https://worldclim.org）與中國科學(xué)院資源環(huán)境與數(shù)據(jù)中心（https://www.resdc.cn/）提供，UV-B輻射相關(guān)數(shù)據(jù)源自glUV 網(wǎng)站（https://www.ufz.de/gluv/）。Mann-Whitney U 檢驗(yàn)用于不同分布區(qū)環(huán)境因子的差異比較；基于差異顯著的環(huán)境因子計(jì)算不同居群間的環(huán)境距離（Environmental distance，ED），利用居群經(jīng)緯度信息計(jì)算居群間地理距離（Geographical distance，GD）[33-34]；本研究中ED 和GD 均為歐式距離。Mantel 檢驗(yàn)用于分析居群間FST與地理距離、環(huán)境距離間的相關(guān)性[34]。Mann-Whitney U檢驗(yàn)由IBM SPSS Station 25.0 計(jì)算；Mantel 檢驗(yàn)在XLSTAT（Version 2019.2.2）中完成；其余統(tǒng)計(jì)分析由SIMCA（Version 14.1）完成。

表2 研究涉及環(huán)境因子Table 2 Environment factors used in the study

3 結(jié)果與分析

3.1 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

滇龍膽GBS 簡(jiǎn)化基因組測(cè)序結(jié)果統(tǒng)計(jì)顯示，數(shù)據(jù)經(jīng)過濾后，數(shù)據(jù)集測(cè)序質(zhì)量值Q20（堿基錯(cuò)誤率＜1.00%）平均值為97.81%，測(cè)序質(zhì)量值Q30（堿基錯(cuò)誤率＜0.10%）平均值為93.55%，平均CG 含量為41.07%，N 堿基含量為0.00%，表明測(cè)序結(jié)果出錯(cuò)率低，數(shù)據(jù)總體質(zhì)量較高。測(cè)序樣品高質(zhì)量序列（HQ clean reads）條數(shù)均值為10 923 810，中位數(shù)為9 527 980，每份樣品平均測(cè)序序列數(shù)據(jù)量約1.55 Gb。

3.2 滇龍膽居群遺傳結(jié)構(gòu)

基于篩選后的SNPs 數(shù)據(jù)集，運(yùn)用鄰接法構(gòu)建19 個(gè)居群147 株滇龍膽的系統(tǒng)樹。系統(tǒng)樹分析結(jié)果顯示（圖1），不同地理來源的樣品可大致分為2 個(gè)分支。第1 分支主要是生長(zhǎng)在云貴高原的滇龍膽，包括滇中的中山（CX）、雙柏（SB）、紅塔（HT）居群，滇西昌寧（CN）、耿馬（GM）、云縣（YX）居群以及貴州西北部的納雍（NY）居群部分個(gè)體；此外四川樂山（LS）居群的滇龍膽也被聚到第1 個(gè)分支中。第2 分支主要為云貴高原以北地區(qū)分布的滇龍膽；包括滇西北福貢（FG）、維西（WX）、鶴慶（HQ）、新華（XH）、玉龍（YL）、永勝（YS）居群，川西南的攀枝花（PZH）、寧南（NN）和西昌（XC）居群；除上述地區(qū)的滇龍膽，滇中華寧（HN）聚居及滇東南文山（WS）居群的樣品也被聚到第2分支中。系統(tǒng)樹顯示，同一居群的樣品基本聚在一起，相近地理區(qū)域的樣品多聚為一類，分布于云貴高原和滇西北橫斷山區(qū)的植株聚為不同分支，表明上述地區(qū)的滇龍膽在遺傳上呈現(xiàn)出較明顯的地域分異。

圖1 滇龍膽19 個(gè)居群147 株個(gè)體基于SNPs 數(shù)據(jù)集聚分析Fig.1 Cluster analysis of 147 individuals in 19 populations of G.rigescens based on the SNPs data set

PCA 三維得分圖顯示（圖2），所有樣品依據(jù)得分大致聚為4 組。第I 組樣品主要由云南鶴慶（HQ）、玉龍（YL）2 個(gè)居群的滇龍膽構(gòu)成；第II 組樣品主要由云南新華（XH）、永勝（YS）、福貢（FG）、維西（WX）及四川西昌（XC）、寧南（NN）居群的植株構(gòu)成；第 III 組樣品主要為四川攀枝花（PZH）、云南玉溪（HN）和文山（WS）居群的植株；第IV 組樣品為云南南昌寧（CN）、臨滄（YX、GM）、楚雄（CX、SB）、玉溪（HT）及四川樂山（LS）、貴州納雍（NY）的居群的滇龍膽構(gòu)成。

圖2 滇龍膽19 個(gè)居群147 株個(gè)體SNPs 數(shù)據(jù)集主成分分析Fig.2 PCA of 147 individuals in 19 populations of G.rigescens based on SNPs data set

19 個(gè)滇龍膽居群的遺傳結(jié)構(gòu)分組研究發(fā)現(xiàn)，隨K值增加模型交叉驗(yàn)證誤差逐步降低；當(dāng)K為4 時(shí)誤差值達(dá)到谷值，因此K=4 是最優(yōu)分群方法（圖3）。

圖3 滇龍膽19 個(gè)居群147 株個(gè)體SNPs 數(shù)據(jù)集遺傳結(jié)構(gòu)最佳K 值篩選Fig.3 Optimum K value selection for genetic structure of 147 individuals in 19 populations of G.rigescens based on SNPs data set

基于最優(yōu)分組結(jié)果發(fā)現(xiàn)，19 個(gè)居群的基因型從地理上呈現(xiàn)出明顯的地域特征（圖4）。4 個(gè)亞群中，紅色基因型個(gè)體主要存在于鶴慶（HQ）和玉龍（YL）2個(gè)居群中；橙色基因型個(gè)體主要生長(zhǎng)在滇西北和川西南地區(qū)（攀枝花居群除外）。保山昌寧、楚雄雙柏、玉溪紅塔及四川樂山居群中藍(lán)色基因型占主導(dǎo)地位；四川攀枝花、云南華寧和云南文山3 個(gè)居群植株均以綠色基因型為主。云南耿馬、云縣及貴州納雍居群具有明顯的種質(zhì)混雜，其組成可能來源于多個(gè)理論祖先亞群。

圖4 滇龍膽19 個(gè)居群的遺傳結(jié)構(gòu)分組 (K=4)Fig.4 Genetic structure analysis of 19 Gentiana rigescens population (K=4)

綜合以上分析結(jié)果認(rèn)為以滇西昌寧（CN）—黔西納雍（NY）一線為界，滇龍膽居群遺傳結(jié)構(gòu)在云貴高原和橫斷山區(qū)間呈現(xiàn)出明顯的南北差異。依據(jù)研究樣品地理來源和簡(jiǎn)化基因組分析結(jié)果，19 個(gè)居群的滇龍膽有4 種基因型，并可劃分為北部（共計(jì)10 個(gè)居群）和南部（共計(jì)9 個(gè)居群）2 個(gè)組。北部組主要分布在橫斷山區(qū)（滇西北和川西南），組內(nèi)基因型I 和基因型II 占比較高；南部組主要分布于云貴高原，組內(nèi)基因型III 和基因型IV 占比較高。

3.3 居群遺傳多樣性

3.3.1 橫斷山區(qū)居群遺傳多樣性 對(duì)分布于橫斷山區(qū)的10 個(gè)滇龍膽居群遺傳多樣性參數(shù)進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果顯示（表3），10 個(gè)居群6 個(gè)遺傳參數(shù)均值分別為Ho=0.051（數(shù)值0.040～0.070），He=0.098（數(shù)值0.085～0.111），PIC=0.077（數(shù)值0.067～0.088），I=0.144（數(shù)值0.125～0.163），Nei’s=0.114（數(shù)值0.100～0.133），π=1.175×10-3（數(shù)值0.823×10-3～1.625×10-3）。

表3 橫斷山及周邊地區(qū)滇龍膽10 個(gè)居群的遺傳多樣性參數(shù)Table 3 Genetic diversity parameters of 10 population of G.rigescens in Hengduan Mountains and its surrounding areas

3.3.2 云南貴高原居群遺傳多樣性 分布于云貴高原的滇龍膽居群遺傳多樣性參數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示（表4），9 個(gè)居群遺傳參數(shù)均值分別為：Ho=0.052（數(shù)值0.042～0.072），He=0.110（數(shù)值0.088～0.141），PIC=0.088（數(shù)值0.071～0.113），I=0.164（數(shù)值0.132～0.211），Nei’s=0.127（數(shù)值0.098～0.161），π=1.677×10-3（數(shù)值1.209×10-3～2.261×10-3）。

表4 云貴高原滇龍膽9 個(gè)居群的遺傳多樣性參數(shù)Table 4 Genetic diversity parameters of nine population of G.rigescens in Yunnan-Guizhou Plateau

19 個(gè)居群遺傳多樣性參數(shù)總體計(jì)算顯示，Ho=0.037，He=0.268，PIC=0.223，I=0.426，Nei’s=0.279，π=1.399×10-3。綜合比較橫斷山區(qū)居群和云貴高原居群He、No、I、Nei’s、PIC 和π6 個(gè)遺傳多樣性參數(shù)的數(shù)值變化，并對(duì)2 組數(shù)據(jù)進(jìn)行Mann-Whitney U 檢驗(yàn)（圖5）。均值和中位數(shù)比較發(fā)現(xiàn)，橫斷山區(qū)滇龍膽居群的遺傳多樣性較云貴高原居群低，其中π值組間差異顯著（Mann-Whitney U 檢驗(yàn)P＜0.05）。

圖5 橫斷山區(qū)與云貴高原滇龍膽居群遺傳多樣性比較Fig.5 Genetic diversity comparison between the Hengduan Mountains population and the Yunnan-Guizhou Plateau population of G.rigescens

3.4 遺傳分化與基因流

3.4.1 橫斷山區(qū)居群 橫斷山及周邊地區(qū)10 個(gè)滇龍膽居群FST的均值為0.471，F(xiàn)ST數(shù)值變化范圍0.163～0.580，鶴慶（HQ）居群與玉龍（YL）居群間FST值最小，攀枝花（PZH）居群與玉龍（YL）居群間FST值最大（表5）。除鶴慶、玉龍2 個(gè)居群，橫斷山區(qū)滇龍膽群間總體呈現(xiàn)出中等或較高水平的遺傳分化。

表5 橫斷山及周邊地區(qū)滇龍膽10 個(gè)居群的FST 數(shù)值Table 5 FST value between 10 population of G.rigescens in Hengduan Mountains and its surrounding areas

Nm計(jì)算顯示（表6），橫斷山區(qū)10 個(gè)居群間Nm數(shù)值介于0.181～1.279；僅鶴慶（HQ）居群與玉龍（YL）居群間Nm值大于1.000，其余44 對(duì)居群的Nm值均小于1.000。Nm數(shù)據(jù)分析顯示，除滇西北少數(shù)居群外，橫斷山區(qū)大部分居群間的基因交流均受到不同程度的阻隔。

表6 橫斷山及周邊地區(qū)滇龍膽10 個(gè)居群的Nm 數(shù)值Table 6 Nm value between 10 population of G.rigescens in Hengduan Mountains and its surrounding areas

3.4.2 云南貴高原居群 云貴高原9 個(gè)滇龍膽居群FST均值為0.422，F(xiàn)ST數(shù)值0.227～0.576，中山（CX）居群與雙柏（SB）居群間FST值最小，南華（NH）居群與昌寧（CN）居群間FST值最大。貴州納雍的居群（NN）與云貴高原其它地區(qū)的居群呈現(xiàn)出不同程度的遺傳分化，居群間FST值在0.373～0.495（表7）。

表7 云貴高原滇龍膽9 個(gè)居群的FST 數(shù)值Table 7 FST value between nine population of G.rigescens in Yunnan-Guizhou Plateau

Nm分析顯示（表8），云貴高原9 個(gè)居群間Nm值變化范圍：0.184～0.853；3 對(duì)居群Nm值小于0.200，13 對(duì)居群Nm值小于0.300，6 對(duì)居群群Nm值小于0.400，10 對(duì)居群Nm值小0.600，僅有4 對(duì)居群Nm值在0.603～0.853。貴州境內(nèi)滇龍膽居群與云南境內(nèi)滇龍膽居群間Nm值多小于0.400；滇中華寧居群與滇東南文山群間Nm值較高為0.754；綜合比較發(fā)現(xiàn)，滇龍膽居群間基因流在滇中與滇西地區(qū)較強(qiáng)。

表8 云貴高原滇龍膽9 個(gè)居群的Nm 數(shù)值Table 8 Nm value between nine population of G.rigescens in Yunnan-Guizhou Plateau

3.4.3 遺傳變異分析 滇龍膽19 個(gè)居群的遺傳變異分析顯示（表9），遺傳變異主要來源于居群內(nèi)，占總變異的86.99%；剩余13.01%的變異來源于居群間。

表9 滇龍膽19 個(gè)居群的分子變異分析Table 9 AMOVA results of 19 population of G.rigescens

3.5 地理距離、環(huán)境距離對(duì)居群遺傳分化的影響

3.5.1 橫斷山區(qū)與云貴高原環(huán)境差異分析Mann-Whitney U 檢驗(yàn)結(jié)合分布區(qū)23 個(gè)環(huán)境因子數(shù)據(jù)（表2）的統(tǒng)計(jì)分析顯示，橫斷山區(qū)與云貴高原滇龍膽生境在熱量指標(biāo)和UV-B 輻射兩方面存在顯著差異（表10），溫度季節(jié)性變化（Bio 04）、最冷月最低溫度（Bio 06）、溫度年較差（Bio 07）、活動(dòng)積溫（10AAT）、UV-B 輻射季節(jié)性變化（UV-B A2）、UV-B 輻射最強(qiáng)月份平均值（UV-B A3）以及UV-B 輻射最強(qiáng)季度月均值總和（UV-B A5）在居群間差異顯著（P＜0.05）。

表10 橫斷山區(qū)與云貴高原差異顯著的環(huán)境變量Table 10 Environmental variables with significant differences between Hengduan Mountains and Yunnan-Guizhou Plateau

對(duì)上述差異顯著的7 個(gè)環(huán)境變量進(jìn)行PCA，結(jié)合雙標(biāo)圖顯示（圖6），7 個(gè)環(huán)境變量均遠(yuǎn)離圓心，表明上述環(huán)境變量可作為區(qū)分不同居群生境的特征變量；7 個(gè)變量進(jìn)一步劃分為3 組，Bio 04 與Bio 07為第1 組（均在第1 象限），Bio 06 與10AAT 為第2 組（均在第2 象限），所有UV-B 輻射變量為第3組（均在第3 象限）。綜合上述，Bio 04、Bio 07、Bio 06 等7 個(gè)變量能較好反映19 個(gè)居群的生境差異與環(huán)境特征，適用于計(jì)算居群間環(huán)境距離。

圖6 基于7 個(gè)環(huán)境變量的PCA 雙標(biāo)圖Fig.6 Biplot based on PCA of seven environment variables

3.5.2 Mantel 檢驗(yàn) Mantel 檢驗(yàn)顯示（表11），地理距離（GD）與居群FST相關(guān)性不顯著（P＞0.05）；環(huán)境距離與FST顯著相關(guān)（P＜0.05）。為進(jìn)一步分析影響居群遺傳分化的主要環(huán)境因子，分別用表10 中的4 個(gè)熱量指標(biāo)和3 個(gè)UV-B 輻射指標(biāo)計(jì)算環(huán)境距離，并與居群FST進(jìn)行Mantel 檢驗(yàn)。結(jié)果顯示（表11），居群間UV-B 輻射指標(biāo)與FST呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），熱量指標(biāo)與FST相關(guān)性不顯著（P＞0.05）。以上結(jié)果表明，橫斷山區(qū)和云貴高原滇龍膽居群間的遺傳分化可能與生境UV-B 輻射變化有關(guān)。

表11 遺傳距離與地理距離、環(huán)境距離的Mantel 檢驗(yàn) (基于斯皮爾曼相關(guān)系數(shù))Table 11 Mantel tests for the correlation between genetic distance and geographic distance,environmental distance(Spearman’ s coefficient)

4 討論

4.1 滇龍膽遺傳結(jié)構(gòu)與遺傳多樣性

基于GBS 簡(jiǎn)化基因組測(cè)序，對(duì)分布于云南、四川、貴州的19 個(gè)居群147 株個(gè)體居群遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性進(jìn)行分析。發(fā)現(xiàn)滇龍膽野生居群基因型豐富，其中四川樂山（LS）、貴州納雍（NY）、云南楚雄（CX）、臨滄（YX、GM）等地居群存在種質(zhì)混雜。19 個(gè)居群依據(jù)遺傳結(jié)構(gòu)從地理上大致可劃分為北部、南部2 個(gè)組。北部組居群主要分布于滇西北橫斷山區(qū)及川西南山區(qū)，南部組居群主要分布于云貴高原。

北部組與南部組各居群FST平均值分別為0.471、0.422；物種FST值與線葉龍膽G.lawrenceivar.farreri(I.B.Balfour) T.N.Ho 較接近，高于多花龍膽G.striolataT.N.Ho、阿墩子龍膽G.atuntsiensisW.W.Smith，低于鉆葉龍膽G.haynaldiiKanitz[35-36]。遺傳變異分析顯示滇龍膽個(gè)體間遺傳多樣性較高，種內(nèi)變異有13.01%源自居群間，其余86.99%均來自居群內(nèi)。該結(jié)果與龍膽科藥用植物線葉龍膽和川西獐牙菜較相似[7,37]。居群間Nm數(shù)值變化分析顯示，橫斷山區(qū)各居群Nm值在0.181～1.279，云貴高原各居群Nm值在0.184～0.853。結(jié)合趙宗蘋等[27]的研究結(jié)果認(rèn)為，滇龍膽居群間存在一定的遺傳分化和基因流，但不同分布區(qū)居群間遺傳分化程度及基因流強(qiáng)度存在差異。

基于I、Nei’s、π等參數(shù)的分析結(jié)果，與龍膽屬其他物種對(duì)比發(fā)現(xiàn)，滇龍膽遺傳多樣性較分布于青藏高原和橫斷山區(qū)的線葉龍膽、六葉龍膽G.hexaphyllaMaxim.ex Kusnez.、三葉龍膽G.ternifoliaFranch.低[37-38]，與麻花艽G.stramineaMaxim.和粗莖秦艽G.crassicaulisDuthie ex Burk.較接近[11,39]。將19 個(gè)居群依據(jù)其地理分布進(jìn)行劃分發(fā)現(xiàn)，橫斷山居群與云貴高原居群的遺傳多樣性具有差異；分布于橫斷山區(qū)的滇龍膽遺傳多樣性總體低于分布于云貴高原的滇龍膽。

4.2 生境差異對(duì)居群遺傳分化的影響

物種多樣性及特異種質(zhì)的形成通常與地理隔離或特殊生境適應(yīng)有關(guān)[40-41]。利用Mantel 檢驗(yàn)分析了滇龍膽居群間遺傳距離與地理距離、環(huán)境距離的相關(guān)性；結(jié)果顯示居群FST數(shù)值的變化與地理距離相關(guān)性不顯著（P＞0.05），而與環(huán)境距離緊密相關(guān)（P＜0.05）。該結(jié)果暗示環(huán)境隔離（isolation by environment，IBE）可能在驅(qū)動(dòng)滇龍膽群遺傳分化方面發(fā)揮了重要作用。

較復(fù)雜的地形可能對(duì)居群間種子流和花粉流造成影響，使物種的遺傳分化與地理距離不相關(guān)[42]。滇龍膽為蟲媒花，繁育系統(tǒng)為兼性異交型[43]；種子有蜂窩狀網(wǎng)紋，僅適合短距離風(fēng)媒傳播[28]。橫斷山區(qū)內(nèi)部及橫斷山與云貴高原間的居群可能因高大山脈或河流、峽谷阻隔，影響植株授粉及種子傳播；導(dǎo)致居群間遺傳分化與地理距離不相關(guān)。此外，槭樹Acer ginnalaMaxim.、青楊Populus cathayanaRehd.、無患子Sapindus mukorossiGaertn.等物種研究表明對(duì)于分布較廣，分布區(qū)地貌復(fù)雜、生境條件差異大的物種，居群水平的遺傳分化更多與分布區(qū)環(huán)境差異形成的選擇壓有關(guān)[42,44-45]。滇龍膽分布區(qū)北部屬云貴高原與青藏高原的過渡區(qū)，海拔總體較高；分布區(qū)南部多為向西下降的盆地，海拔相對(duì)較低[46]。分布區(qū)地勢(shì)變化總體呈現(xiàn)高緯度與高海拔相結(jié)合，低緯度與低海拔相一致的特點(diǎn)，進(jìn)一步加劇了南北分布區(qū)的UV-B 輻射強(qiáng)度差異[46-47]。分布于青藏高原的麻花艽研究顯示，改變生境UV-B 輻射強(qiáng)度可對(duì)植株葉片厚度、呼吸強(qiáng)度、光合作用等造成影響[48-50]；同時(shí)麻花艽在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中也形成對(duì)UV-B 輻射強(qiáng)度變化的適應(yīng)機(jī)制[48]。通過Mantel檢驗(yàn)結(jié)合簡(jiǎn)化基因組數(shù)據(jù)初步分析推測(cè)UV-B 輻射變化可能是驅(qū)動(dòng)滇龍膽南部、北部居群遺傳分化的重要環(huán)境因素。目前UV-B 輻射對(duì)滇龍膽生理、生態(tài)的影響尚未見報(bào)道。對(duì)于生長(zhǎng)于高海拔山區(qū)的龍膽屬植物，生境UV-B 輻射漸變?nèi)绾悟?qū)動(dòng)滇龍膽種內(nèi)遺傳分化，上述遺傳變異對(duì)環(huán)境的適應(yīng)意義及對(duì)藥材質(zhì)量的影響仍有待后續(xù)深入研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突