基于SNAIL 信號(hào)通路及腸道菌群研究密點(diǎn)麻蜥抑制胃癌肝轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制

白 星，程翻娥，楊長(zhǎng)沅，李 錚，李衛(wèi)強(qiáng),

1.寧夏醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，寧夏 銀川 750004

2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510006

3.寧夏少數(shù)民族醫(yī)藥現(xiàn)代化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川 750004

胃癌是世界第4 大惡性腫瘤[1]，由于其發(fā)病隱匿、早期不易診斷且胃癌細(xì)胞具有循環(huán)擴(kuò)散性，大多數(shù)患者在確診時(shí)已發(fā)展為晚期胃癌或伴有轉(zhuǎn)移。其中，肝臟是胃癌細(xì)胞血行轉(zhuǎn)移最常見的器官，其臨床治療仍是亟待解決的難題[2-3]。人類腸道菌群中既包含致癌菌群又包含抑癌菌群，共同維護(hù)腸道黏膜穩(wěn)態(tài)環(huán)境，癌癥的發(fā)生及轉(zhuǎn)移與腸道菌群失調(diào)密切相關(guān)[4]。研究表明，胃癌肝轉(zhuǎn)移患者腸道菌群存在紊亂現(xiàn)象[5]。因此，從浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移相關(guān)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）及腸道菌群調(diào)控等多靶點(diǎn)開展干預(yù)胃癌肝轉(zhuǎn)移的作用及機(jī)制闡釋為中醫(yī)藥抗癌研究提供科學(xué)依據(jù)具有重要意義。

EMT 是上皮細(xì)胞獲得間充質(zhì)細(xì)胞表型的過程[6]。這一生物過程常被癌細(xì)胞利用則致使癌細(xì)胞具有抗凋亡、獲得侵襲等癌細(xì)胞特性。EMT 是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要標(biāo)志，SNAIL 是EMT 的標(biāo)志物，能夠抑制Ecadherin 的表達(dá)，促進(jìn)EMT 進(jìn)程[7]。SNAIL 的異常激活與腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移及其預(yù)后密切相關(guān)[8]。

密點(diǎn)麻蜥Eremias multiocellataGünther 始載于《中國(guó)藥用動(dòng)物志》[9]，《本草綱目》載蜥蜴有活血化瘀、消癭散結(jié)之功。本課題組前期開展了密點(diǎn)麻蜥及其為主組成的復(fù)方中藥干預(yù)胃癌的相關(guān)研究，證實(shí)密點(diǎn)麻蜥含藥血清能夠抑制胃癌SGC-7091 細(xì)胞的增殖，抑制Sirt1 表達(dá)，降低p53 蛋白表達(dá)，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的調(diào)亡[10]；其復(fù)方能夠改善癌前病變大鼠病理形態(tài)，降低p53 和PUMA 表達(dá)，逆轉(zhuǎn)癌變趨勢(shì)[11]，且闡明蜥蜴復(fù)方中藥能夠通過上調(diào)Ecadherin、下調(diào)整合素β1和基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinases 9，MMP9）表達(dá)，阻斷EMT，抑制胃癌浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移[12]。本課題基于以上前期研究，進(jìn)一步探索密點(diǎn)麻蜥基于SNAIL 信號(hào)通路影響EMT及腸道菌群調(diào)節(jié)，從多途徑、多靶點(diǎn)對(duì)胃癌肝轉(zhuǎn)移的抑制作用及機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性BALB/c 裸鼠36 只，4 周齡，體質(zhì)量（20±2）g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（京）2021-0006。動(dòng)物飼養(yǎng)于寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF 級(jí)動(dòng)物房，恒溫（22±1）℃，光照晝夜交替各12 h，自由進(jìn)食飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)2021-091）。

1.2 細(xì)胞株

人胃腺癌HGC-27 細(xì)胞株購(gòu)自上海中喬新舟生物科技有限公司。

1.3 藥材

密點(diǎn)麻蜥（批號(hào)20180501）購(gòu)自寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院門診，經(jīng)寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院劉艷華教授鑒定為密點(diǎn)麻蜥E.multiocellataGünther。

1.4 藥品與試劑

5-氟脲嘧啶（5-fluorouracil，5-FU，批號(hào)2005181）購(gòu)自天津金耀藥業(yè)有限公司；蘇木素-伊紅（HE）染色液（批號(hào)202010）購(gòu)自北京博奧拓達(dá)科技有限公司；兔抗鼠β-actin 多克隆抗體（批號(hào)12w2944）、SNAIL 多克隆抗體（批號(hào)78m6660）、E-cadherin 多克隆抗體（批號(hào)32p9942）、N-cadherin多克隆抗體（批號(hào)12j8872）多克隆抗體購(gòu)自Affinity Biosciences；HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 抗體（批號(hào)ATTNO0301）購(gòu)自亞科因生物技術(shù)有限公司；E.Z.N.A.?DNA 提取試劑盒（批號(hào)M9636020000J13V）購(gòu)自美國(guó) Bio-Tek 公司；AxyPrepDNA 凝膠回收試劑盒（批號(hào)11214KA1）購(gòu)自Axygen Biosciences；Quantus? Fluorometer 檢測(cè)試劑盒（批號(hào)0000302722）購(gòu)自美國(guó)Promega 公司。

1.5 儀器

CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）；CKX53 型倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）；RM2255 型全自動(dòng)輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)（德國(guó)Leica 公司）；MiniProteanTetra 蛋白電泳系統(tǒng)（美國(guó)伯樂公司）；Amersham Imager 680RGB 型超靈敏多功能成像儀（美國(guó)GE 公司）；NovaSeqpE250 型平臺(tái)（美國(guó)Illumina 公司）。

2 方法

2.1 胃癌肝轉(zhuǎn)移模型制備、分組與給藥

36 只雄性BALB/c 裸鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為對(duì)照組（9 只）和造模組（27 只）。參考相關(guān)文獻(xiàn)，采用脾臟注射法[13]建立胃癌肝轉(zhuǎn)移模型。造模動(dòng)物蘇醒后，隔天對(duì)傷口進(jìn)行碘伏消毒處理。飼養(yǎng)4 周并對(duì)其精神狀態(tài)、活動(dòng)度、體質(zhì)量飲食、皮膚顏色、腫瘤生長(zhǎng)等情況進(jìn)行隔日觀察記錄。造模4周時(shí)，隨機(jī)取對(duì)照組1 只與造模組3 只剖腹探查驗(yàn)證造模成功。對(duì)照組裸鼠肝組織色澤鮮明、表面光滑；造模組裸鼠肝組織出現(xiàn)肉眼可見白色結(jié)節(jié)，肝臟受損，部分肝組織被轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)代替，表明胃癌肝轉(zhuǎn)移模型構(gòu)建成功。

造模成功的裸鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為模型組、5-FU（0.025 g/kg）組和密點(diǎn)麻蜥（2.6 g/kg，臨床等效劑量）組，每組8 只，并由第3 方對(duì)實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行隨機(jī)編碼，編號(hào)為不透明的密封信封以避免選擇性偏倚。

取密點(diǎn)麻蜥5.2 g，加入純水定容至600 mL，浸泡30 min，放入數(shù)顯恒溫加熱電熱套中100 ℃煮沸后，將溫度調(diào)至80 ℃，煎煮至300 mL 時(shí)濾過，繼續(xù)80 ℃加熱至200 mL，制備成終質(zhì)量濃度為0.026 g/mL 的水煎劑。密點(diǎn)麻蜥組ig 水煎劑，2 次/d；5-FU組ip 5-FU 原液稀釋10 倍后的溶液，1 次/d，對(duì)照組和模型組ig 生理鹽水，連續(xù)4 周。

2.2 樣本采集

用無(wú)菌EP 管收集各組裸鼠末次給藥2 h 后的新鮮糞便，迅速轉(zhuǎn)移至-80 ℃保存。各組小鼠ip 2%戊巴比妥鈉麻醉，取一小塊肝組織以生理鹽水沖洗后，于4%多聚甲醛中固定24 h，剩余肝組織于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 肝組織病理觀察

取固定好的肝組織，沖水后脫水、透明，石蠟包埋，切成4 μm 厚的石蠟切片，脫蠟水化后蒸餾水沖洗5 min，蘇木素染色4 min，水洗多余染液，鹽酸酒精分化，水洗15 min，伊紅染色3 min 后蒸餾水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，滴加中性樹膠封片。晾干后用切片掃描儀觀察。

2.4 肝組織SNAIL、E-cadherin 和N-cadherin 蛋白表達(dá)檢測(cè)

取各組裸鼠肝組織100 mg，加入含蛋白酶抑制劑的裂解液1 mL，用冷凍研磨儀低溫研磨至充分裂解，4 ℃、12 000 r/min 離心10 min，吸取上清。BCA 法測(cè)定蛋白濃度。蛋白樣品經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，加入無(wú)蛋白快速封閉液封閉15 min，TBST 洗滌5 次，每次5 min，加入一抗（1∶1000），4 ℃孵育過夜；TBST 洗滌5 次，每次5 min，加入二抗（1∶10 000），室溫孵育2 h，TBST 洗滌5 次，加入ECL 發(fā)光試劑顯影，采用Image J 軟件分析條帶灰度值。

2.5 裸鼠糞便DNA 提取及IIluminaNovaSeq 測(cè)序

將每組裸鼠的糞便混合后，用E.Z.N.A.?DNA提取試劑盒抽提腸道微生物總DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) DNA 質(zhì)量，用引物 338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）對(duì)V3～V4 可變區(qū)基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，95 ℃預(yù)變性3 min，27個(gè)循環(huán)（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30s，72 ℃延伸30 s），72 ℃穩(wěn)定延伸10 min，4 ℃進(jìn)行保存。PCR 反應(yīng)體系：5×TransStart Fastpfu 緩沖液4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，上游引物0.8 μL，下游引物0.8 μL，TransStart Fastpfu DNA 聚合酶0.4 μL，模板DNA 10 ng，雙蒸水補(bǔ)足至20 μL。每個(gè)樣本6 個(gè)重復(fù)。

使用2%瓊脂糖凝膠回收同一樣本PCR 產(chǎn)物，利用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收產(chǎn)物純化，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用 Quantus?Fluorometer 檢測(cè)試劑盒對(duì)回收產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)定量。送由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。分別用Ace、Sobs、Shannon 和Simpson 指數(shù)測(cè)定α-多樣性。用Bray-Curtis 計(jì)算β-多樣性，主坐標(biāo)分析可視化，R 軟件繪制結(jié)果來(lái)比較不同樣本菌群豐富度和多樣性。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)定量資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的用表示；非正態(tài)分布的采用中位數(shù)（四分位數(shù)）［M（Q1，Q3）］表示。兩組間比較方差齊且符合正態(tài)分布采用StudentT檢驗(yàn)，方差不齊且不符合正態(tài)分布用Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)。多組間比較采用單因素方差分析單因素方差分析（One-way ANOVA）或Kruskal-Wallis 秩和檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 密點(diǎn)麻蜥對(duì)胃癌肝轉(zhuǎn)移裸鼠肝組織病理變化的影響

如圖1 所示，對(duì)照組肝組織細(xì)胞排列整齊，肝小葉結(jié)構(gòu)完整；模型組癌細(xì)胞在肝組織內(nèi)聚集成灶性，肝小葉破壞，癌細(xì)胞核大、固縮、深染，異性明顯，肝細(xì)胞水腫可見炎細(xì)胞浸潤(rùn)，部分可見肝組織壞死；5-FU 組和密點(diǎn)麻蜥組肝組織病灶變小，肝細(xì)胞較模型組排列整齊，炎性細(xì)胞減少，肝細(xì)胞表現(xiàn)出新生性，病變均有改善。

3.2 密點(diǎn)麻蜥對(duì)胃癌肝轉(zhuǎn)移裸鼠肝組織SNAIL、Ecadherin 和N-cadherin 蛋白表達(dá)的影響

如圖2 和表1 所示，與對(duì)照組比較，模型組裸鼠肝組織SNAIL 和N-cadherin 蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.001），E-cadherin 蛋白水平顯著降低（P＜0.001）；與模型組比較，密點(diǎn)麻蜥組SNAIL 和N-cadherin 蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.001），E-cadherin 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.001）。

表1 密點(diǎn)麻蜥對(duì)胃癌肝轉(zhuǎn)移裸鼠肝組織中SNAIL、E-cadherin 和N-cadherin 蛋白表達(dá)的影響 (,n=8)Table 1 Effect of E.multiocellata on SNAIL,E-cadherin and N-cadherin protein expressions in liver tissue of nude mice with gastric cancer of liver metastasis (,n=8)

表1 密點(diǎn)麻蜥對(duì)胃癌肝轉(zhuǎn)移裸鼠肝組織中SNAIL、E-cadherin 和N-cadherin 蛋白表達(dá)的影響 (,n=8)Table 1 Effect of E.multiocellata on SNAIL,E-cadherin and N-cadherin protein expressions in liver tissue of nude mice with gastric cancer of liver metastasis (,n=8)

與對(duì)照組比較：***P＜0.001；與模型組比較：#P＜0.05 ###P＜0.001***P ＜ 0.001 vs control group;#P ＜ 0.05 ###P ＜ 0.001 vs model group

圖2 密點(diǎn)麻蜥對(duì)胃癌肝轉(zhuǎn)移裸鼠肝組織中SNAIL、Ecadherin 和N-cadherin 蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effect of E.multiocellata on SNAIL,E-cadherin and N-cadherin protein expressions in liver tissue of nude mice with gastric cancer of liver metastasis

3.3 密點(diǎn)麻蜥對(duì)胃癌肝轉(zhuǎn)移裸鼠腸道菌群的影響

3.3.1 稀釋曲線 Rank-Abundance 曲線用來(lái)反映物種的均勻度和豐富度，橫坐標(biāo)寬度代表物種豐度，縱坐標(biāo)平滑度表示物種均勻度，曲線平滑下降且水平延伸表示物種豐度高且均勻，陡然下降則表示優(yōu)勢(shì)菌群所占比例較高均勻度較低。如圖3-A 所示，對(duì)照組和密點(diǎn)麻蜥組優(yōu)勢(shì)菌群所占比較高，密點(diǎn)麻蜥組和5-FU 組物種豐富度較高。

稀釋曲線用于評(píng)價(jià)測(cè)序深度能否反映總體所包含的每個(gè)樣本微生物多樣性，也可以比較相同的測(cè)序深度下不同樣本操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）數(shù)。如圖3-B 所示，橫坐標(biāo)代表測(cè)序量，縱坐標(biāo)表示多樣性指數(shù)。使用Shannon算法的稀釋曲線測(cè)序量在400 時(shí)，Shannon 曲線走向平緩，曲線較長(zhǎng)且集中在平緩，說明在本實(shí)驗(yàn)中繼續(xù)增加測(cè)序量產(chǎn)生新的物種較少，測(cè)序數(shù)據(jù)量能夠反映樣本生物信息。

圖3 物種等級(jí)豐度圖 (A) 和Shannon 稀釋曲線圖 (B)Fig.3 Species Rank-abundance curve (A) and Shannon dilution curve (B)

3.3.2 α 多樣性指數(shù)組間差異 sob 指數(shù)代表物種實(shí)際觀測(cè)豐度，Shannon 指數(shù)反映菌落的多樣性，Chao 指數(shù)反映物種的豐富度，pd 指數(shù)反映菌群進(jìn)化譜系多樣性。如圖4 所示，與對(duì)照組比較，模型組sob 指數(shù)和pd 指數(shù)均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，5-FU 組和密點(diǎn)麻蜥組sob 指數(shù)和pd 指數(shù)均顯著降低（P＜0.05、0.01），密點(diǎn)麻蜥組Shannon指數(shù)顯著降低（P＜0.05）。結(jié)合多樣性指數(shù)和均勻豐富度，胃癌肝轉(zhuǎn)移裸鼠腸道菌群與對(duì)照組比較表現(xiàn)菌群失調(diào)趨向，經(jīng)密點(diǎn)麻蜥治療后更接近對(duì)照組。

圖4 各組腸道菌群的α 多樣性分析 (,n=6)Fig.4 α Diversity analysis of gut microbiota in each group (,n=6)

3.3.3 β 多樣性分析 偏最小二乘法-判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）將多組數(shù)據(jù)間差異反映在坐標(biāo)中，坐標(biāo)中樣品的距離越接近，表明其樣品結(jié)構(gòu)相似性越高，反之差異性越顯著。如圖5 所示，模型組與對(duì)照組腸道菌群構(gòu)成表現(xiàn)出差異；5-FU 組與密點(diǎn)麻蜥組結(jié)構(gòu)接近，與模型組有一定的距離，更接近對(duì)照組，表明密點(diǎn)麻蜥可以調(diào)節(jié)胃癌肝轉(zhuǎn)移裸鼠腸道菌群的結(jié)構(gòu)。

圖5 各組腸道菌群β 多樣性的PLS-DAFig.5 PLS-DA of β diversity of gut microbiota in each group

3.3.4 腸道菌落物種組成分析 如圖6-A 和表2 所示，在門水平上各組胃癌肝轉(zhuǎn)移裸鼠腸道菌群相對(duì)豐度＞1%的菌群有厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidota）、變形菌門（Proteobacteria）、疣微菌 門（Verrucomicrobiota）、放線菌門（Actinobacteriota）。與對(duì)照組比較，模型組厚壁菌門豐度降低，擬桿菌門豐度升高；與模型組比較，密點(diǎn)麻蜥組厚壁菌門豐度升高。厚壁菌門/擬桿菌門（F/B）可反映胃腸整體健康狀況，與對(duì)照組比較，模型組F/B 值下降；經(jīng)5-FU 和密點(diǎn)麻蜥干預(yù)后F/B值均升高。如圖6-B 所示，在屬水平各組占比差異較大的菌屬為擬桿菌屬Bacteroides，各組在擬桿菌屬的豐度比例為對(duì)照組20.57%、模型組28.39%、5-FU 組5.71%、密點(diǎn)麻蜥組9.49%。

圖6 門 (A) 和屬 (B) 水平腸道菌群物種組成分析Fig.6 Species composition analysis of intestinal flora at phyla (A) and genus (B) levels

表2 密點(diǎn)麻蜥對(duì)胃癌肝轉(zhuǎn)移裸鼠腸道菌群擬桿菌門和厚壁菌門的影響 (,n=6)Table 2 Effect of E.multiocellata on Firmicutes and Bacteroidota in gut microbiota of nude mice with liver metastasis of gastric cancer (,n=6)

表2 密點(diǎn)麻蜥對(duì)胃癌肝轉(zhuǎn)移裸鼠腸道菌群擬桿菌門和厚壁菌門的影響 (,n=6)Table 2 Effect of E.multiocellata on Firmicutes and Bacteroidota in gut microbiota of nude mice with liver metastasis of gastric cancer (,n=6)

3.3.5 屬水平物種差異分析 如圖7 所示，屬水平各組間差異顯著的菌群主要有norank_f__Muribaculaceae、擬桿菌屬、乳酸桿菌屬Lactobacillus、梭狀芽孢桿菌屬Clostridia_UCG-014、副擬桿菌屬Parabacteroides、幽門螺旋桿菌Helicobacter。其中norank_f__Muribaculaceae 在模型組較對(duì)照組豐度增加，經(jīng)5-FU 和密點(diǎn)麻蜥治療后為表現(xiàn)出下降趨勢(shì)；擬桿菌屬在各組間豐度差異顯著，與對(duì)照組相比模型組中顯著富集（P＜0.05），經(jīng)密點(diǎn)麻蜥治療后豐度顯著下降（P＜0.01）；與對(duì)照組相比模型組中乳酸桿菌屬豐度降低，經(jīng)藥物治療后未見顯著調(diào)節(jié)作用；與對(duì)照組相比，Clostridia_UCG-014 在模型組中占比下降，經(jīng)密點(diǎn)麻蜥干預(yù)后顯著提高，各組間差異顯著（P＜0.001）。副擬桿菌屬在模型組中較對(duì)照組顯著提高（P＜0.05），經(jīng)藥物治療后豐度下降接近對(duì)照組（P＜0.001）。幽門螺旋桿菌在模型組中的豐度明顯增加（P＜0.01），經(jīng)藥物干預(yù)后恢復(fù)生理水平（P＜0.01）。密點(diǎn)麻蜥主要對(duì)胃癌肝轉(zhuǎn)移裸鼠腸道中擬桿菌屬、梭狀芽孢桿菌屬、副擬桿菌屬、幽門螺旋桿菌進(jìn)行調(diào)節(jié)。

圖7 屬水平物種差異分析Fig.7 Analysis of species differences at genus level

4 討論

目前胃癌的治療手段主要是手術(shù)切除、圍術(shù)期放化療及分子靶向治療。但腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移常常影響手術(shù)的可行性，且一部分病人對(duì)于化療藥物表現(xiàn)為不耐受以及耐藥等一系列問題仍亟待解決。研究發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥通過多途徑多靶點(diǎn)對(duì)腫瘤具有較好的治療作用[14]。因此探究中藥抗癌機(jī)制為臨床提供科學(xué)依據(jù)、促進(jìn)藥物研發(fā)具有重要意義。

在腫瘤形成中SNAIL 可抑制E-cadherin 的轉(zhuǎn)錄從而誘導(dǎo)EMT 發(fā)生，促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、抗調(diào)亡及轉(zhuǎn)移[15]。另外SNAIL 誘導(dǎo)的EMT 可以通過抑制宿主的免疫監(jiān)視能力促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，模型組SNAIL 和N-cadherin蛋白表達(dá)上調(diào)，E-cadherin 表達(dá)下調(diào)，蛋白表達(dá)上調(diào)；與模型組比較，密點(diǎn)麻蜥上調(diào)E-cadherin 表達(dá)，下調(diào)SNAIL、N-cadherin 的表達(dá)，表明密點(diǎn)麻蜥可能通過抑制轉(zhuǎn)錄因子SNAIL 的表達(dá)，增加Ecadherin 表達(dá)調(diào)控EMT 的進(jìn)程，對(duì)胃癌肝轉(zhuǎn)移裸鼠模型具有較好的抑制作用。

近年研究表明，腸道菌群成分與癌癥發(fā)生有關(guān)。其中腸道菌群產(chǎn)生的短鏈脂肪酸（short-chain fattyacids，SCFAs）在細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中至關(guān)重要，它們有助于調(diào)節(jié)組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC），從而影響細(xì)胞附著、免疫細(xì)胞遷移、細(xì)胞因子產(chǎn)生、趨化性和程序性細(xì)胞死亡[17]。SCFAs 能夠作用于乳腺癌細(xì)胞表面的G 蛋白偶聯(lián)受體，調(diào)節(jié)腫瘤抑制基因，使癌細(xì)胞E-cadherin 表達(dá)升高、應(yīng)力纖維含量降低，阻斷EMT 進(jìn)展[18]。因此，通過改變腸道菌群結(jié)構(gòu)來(lái)控制SCFAs 水平亦可抑制腫瘤。

機(jī)體SCFAs 中的丁酸主要由厚壁菌門產(chǎn)生[19]。本研究中胃癌肝轉(zhuǎn)移裸鼠腸道菌群中厚壁菌門在對(duì)照組豐度占比40.9%，模型組中厚壁菌門的豐度為26.4%。經(jīng)密點(diǎn)麻蜥干預(yù)后厚壁菌門的豐度提高到30.2%。與對(duì)照組比較，擬桿菌門在模型組中豐度顯著提高，經(jīng)5-FU 治療后豐度下降，密點(diǎn)麻蜥干預(yù)后未見改變。F/B 值可反映胃腸整體健康狀況，是診斷菌群紊亂的標(biāo)志，與對(duì)照組比較，模型組F/B 值下降，表明胃癌肝轉(zhuǎn)移發(fā)生后裸鼠腸道菌群發(fā)生紊亂，經(jīng)5-FU 和密點(diǎn)麻蜥干預(yù)后F/B 值均提高，因此證實(shí)密點(diǎn)麻蜥可調(diào)節(jié)菌群失調(diào)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)胃癌肝轉(zhuǎn)移裸鼠腸道中厚壁菌門豐度下降，且以密點(diǎn)麻蜥為主藥的復(fù)方表現(xiàn)出提高胃癌肝轉(zhuǎn)移裸鼠腸道厚壁菌門豐度的作用，因此表明密點(diǎn)麻蜥可通過增加厚壁菌門的豐度，補(bǔ)充機(jī)體SCFAs 的缺失來(lái)抑制胃癌[20]。

屬水平上，密點(diǎn)麻蜥主要對(duì)胃癌肝轉(zhuǎn)移裸鼠腸道中擬桿菌屬、梭狀芽孢桿菌屬、副細(xì)菌屬、幽門螺旋桿菌屬進(jìn)行調(diào)節(jié)。其中擬桿菌屬和副細(xì)菌屬的生理功能相似，均可代謝碳水化合物和產(chǎn)生SCFAs，對(duì)宿主健康和免疫調(diào)節(jié)有益[21]。副細(xì)菌屬還表現(xiàn)鎖定腫瘤壞死因子的釋放發(fā)揮對(duì)腫瘤的抑制作用[22]。梭狀芽孢桿菌能夠誘導(dǎo)宿主腸道T 細(xì)胞反應(yīng)表型從而發(fā)揮對(duì)人體免疫調(diào)節(jié)的作用[23]。幽門螺旋桿菌屬是胃癌發(fā)生的主要原因，根除幽門螺旋桿菌可降低SNAIL 的表達(dá)，增加E-cadherin 從而抑制EMT 的發(fā)生[24]。同時(shí)幽門螺桿菌影響成纖維細(xì)胞向具有腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞特征的細(xì)胞方向分化，可能在上皮RGM-1 細(xì)胞中啟動(dòng)EMT 過程，表明幽門螺旋桿菌屬具有誘導(dǎo)胃癌發(fā)生且影響轉(zhuǎn)移[25]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組中幽門螺旋桿菌屬豐度增加，經(jīng)密點(diǎn)麻蜥干預(yù)后幽門螺旋桿菌屬豐度降低，表明密點(diǎn)麻蜥可降低幽門螺旋桿菌屬而抑制胃癌。

以上研究表明，密點(diǎn)麻蜥能夠通過降低轉(zhuǎn)錄因子SNAIL 蛋白表達(dá)，增加E-cadherin 蛋白表達(dá)，降低N-cadherin 蛋白表達(dá)而改變EMT 進(jìn)程，發(fā)揮對(duì)胃癌肝轉(zhuǎn)移的抑制作用。同時(shí)可能通過調(diào)節(jié)腸道菌群穩(wěn)態(tài)平衡，增加產(chǎn)生SCFAs 菌群厚壁菌門豐度，降低致癌菌屬幽門螺桿菌豐度，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫和SCFAs 相關(guān)菌屬（擬桿菌屬、梭狀芽孢桿菌屬、副細(xì)菌屬）的豐度，發(fā)揮對(duì)胃癌的抑制作用。

本研究基于SNAIL 信號(hào)通路影響EMT 及調(diào)節(jié)腸道菌群，闡釋了密點(diǎn)麻蜥從多途徑多靶點(diǎn)對(duì)胃癌肝轉(zhuǎn)移的抑制作用及機(jī)制，為密點(diǎn)麻蜥治療胃癌肝轉(zhuǎn)移提供一定的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，下一步將從通路-SCFAs-SCFAs 相關(guān)菌群，宏基因?qū)用孢M(jìn)一步揭示密點(diǎn)麻蜥多途徑、多靶點(diǎn)治療胃癌的作用機(jī)制。此外，密點(diǎn)麻蜥作為蜥蜴科的動(dòng)物藥，目前藥物提取和成分鑒定一直是一個(gè)難題。本課題組前期與南京中醫(yī)藥大學(xué)段金廒教授合作對(duì)復(fù)方蜥蜴散在動(dòng)物體內(nèi)的代謝產(chǎn)物進(jìn)行初步鑒定，由于相關(guān)藥物研究較少尚未查詢到可以做質(zhì)譜的對(duì)照品，具體蜥蜴成分仍未明確。目前課題組仍在進(jìn)行密點(diǎn)麻蜥單味提取及成分鑒定工作。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突