基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和動物實(shí)驗(yàn)探究荊防顆粒對高尿酸血癥的治療作用及機(jī)制

尉雅潔，劉明飛，孫成宏 ，王 偉，肖 賀 ，程國良*，陳 穎*

1.青島大學(xué)附屬醫(yī)院 內(nèi)分泌與代謝性疾病科，山東 青島 266003

2.中國海洋大學(xué)醫(yī)學(xué)院 海洋藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266003

3.魯南制藥集團(tuán)股份有限公司 中藥制藥共性技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 臨沂 276005

4.魯南制藥集團(tuán)股份有限公司 臨沂市天然藥物免疫藥理毒理（企業(yè)）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 臨沂 273400

高尿酸血癥（hyperuricemia，HUA）是由于尿酸生成過多或尿酸排泄減少引起的代謝性疾病，其患病率逐漸上升，目前已成為繼高血糖、高血脂、高血壓后的又一重要的代謝病[1]。HUA 不僅僅是痛風(fēng)的重要危險因素，也會增加肥胖、高血壓、糖尿病等代謝綜合征發(fā)生率，甚至導(dǎo)致慢性腎損傷、痛風(fēng)石等，給人們的生活帶來了極大的危害[2]。研究表明，尿酸鹽作為一種氧化劑，可以增加線粒體的超氧化物生成，過多的活性氧生成對線粒體DNA 產(chǎn)生一定損害從而觸發(fā)凋亡過程，誘發(fā)腎小管上皮功能障礙[3]，可見，慢性尿酸損傷足以引發(fā)腎臟細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致腎小管損傷、腎小管間質(zhì)纖維化、腎小球硬化等慢性腎臟病。此外，體內(nèi)尿酸的升高將產(chǎn)生大量尿酸鈉結(jié)晶（mono sodium urate，MSU），MSU刺激激活一系列炎性因子轉(zhuǎn)錄表達(dá)，這些有害物質(zhì)最終導(dǎo)致腎臟損傷，加重凋亡和炎癥反應(yīng)[4]。目前臨床上用于治療HUA 的藥物常常具有一定的毒副作用且靶向較為單一。中藥以其多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)的獨(dú)特優(yōu)勢，使得研究中藥治療HUA 具有重大意義。

荊防顆粒源于有“四時瘟疫之通劑”的荊防敗毒散，據(jù)明代張時徹的《攝生眾妙方》記載，荊防敗毒散處方組成為荊芥、防風(fēng)、羌活、獨(dú)活、柴胡、前胡、川芎、枳殼、茯苓、甘草、桔梗[5-6]。李建民教授對于慢性腎臟病合并高尿酸血癥的最常用的39 味高頻藥物進(jìn)行聚類分析中指出，黃芪、茯苓、荊芥、防風(fēng)等藥物作為基礎(chǔ)用藥具有良好功效[7]。范琢玉等[8]發(fā)現(xiàn)，甘草素對有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（organic anion transporter 4，OAT4）和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白9（glucose transporter 9，GLUT9）等有明顯抑制作用，從而促進(jìn)尿酸排泄，降低血尿酸水平。而目前，荊防顆粒在臨床上常用于防治流行性疾病，具有解熱鎮(zhèn)痛、抗炎、提高免疫、改善肺損傷等功效[9-12]，但其在抗HUA 及腎臟保護(hù)方面的研究還未見報道。因此本研究將通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)篩選荊防顆粒主要成分治療HUA 的作用靶點(diǎn)，通過氧嗪酸鉀誘導(dǎo)的HUA 小鼠模型驗(yàn)證其靶點(diǎn)及潛在機(jī)制，以期找到多靶點(diǎn)候選藥物治療HUA 及高尿酸性腎病，為荊防顆粒的進(jìn)一步推廣及臨床應(yīng)用提供理論支持。

1 材料

1.1 動物

SPF 級ICR 雄性小鼠30 只，體質(zhì)量（25±2）g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，動物許可證號SCXK（京）2019-0008。動物飼養(yǎng)室溫度為20～25 ℃，相對濕度為50%～60%，人工照明在明暗之間交替使用（12 h 光照/12 h 黑暗），自由進(jìn)食飲水。動物實(shí)驗(yàn)經(jīng)魯南制藥集團(tuán)股份有限公司實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號HN-IACUC-2022-049）。

1.2 藥品與試劑

荊防顆粒（國藥準(zhǔn)字 Z37020357，批號0012008044）由山東新時代藥業(yè)有限公司提供；別嘌呤醇（國藥準(zhǔn)字H44021492，批號20220121）由廣州白云山醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司白云山制藥總廠提供；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）購自美國Sigma-Aldrich 公司；氧嗪酸鉀購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；剪切型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cleaved cystein-asparate protease-3，cleaved Caspase-3）抗體（批號9661S）購自美國CST 公司；HRP 標(biāo)記山羊抗兔二抗（批號ab97080）、HRP 標(biāo)記兔抗鼠二抗（批號ab6728）、B 淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗體（批號ab182858）購自英國Abcam 公司；α-tubulin 抗體（批號AF2827）、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗體（批號AF7270）購自Beyotime。

1.3 儀器

冷凍離心機(jī)（美國Sigma 公司)；Tissue-Tec?VIPTM5Jr 型全封閉組織脫水機(jī)、Tissue-Tec?TECTM5 型組織包埋機(jī)（日本櫻花檢驗(yàn)儀器株式會社）；RM2235 型輪轉(zhuǎn)式病理切片機(jī)、HI1210 型組織攤片機(jī)、ST5020 型自動染色機(jī)（德國Leica 公司）；BX53 型生物顯微鏡（日本Olympus 公司）；BS-800型全自動生化分析儀（深圳市邁瑞生物醫(yī)學(xué)電子有限公司）；DYY-7C 型電泳儀、DYCZ-40D 型轉(zhuǎn)移槽（北京六一生物科技有限公司）；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（上海勤翔科學(xué)儀器有限公司）；LTQ-Oribitrap 高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀、Vanquish 超高效液相色譜（美國Thermo Fisher Scientific 公司）。

2 方法

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

2.1.1 荊防顆粒的活性成分及其作用靶點(diǎn)篩選 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）和 SwissTarget Prediction 數(shù)據(jù)庫（http://www.swisstargetprediction.ch/）對梁紅寶等[4]在荊防顆粒成分分析中所得到的109 個化合物進(jìn)行靶點(diǎn)收集，同時通過中國知網(wǎng)（CNKI）數(shù)據(jù)庫文獻(xiàn)檢索對上述化合物的靶點(diǎn)進(jìn)行補(bǔ)充。將藥物靶點(diǎn)通過 UniProt 數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）轉(zhuǎn)換為Gene Symbol，篩除重復(fù)值后得到荊防顆粒相關(guān)靶點(diǎn)。

2.1.2 HUA潛在靶點(diǎn)的獲取 分別在GeneCards數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）、OMIM 數(shù)據(jù)庫（https://omim.org/）、TTD 數(shù)據(jù)庫（http://db.idrblab.net/ttd/）搜索“hyperuricemia”“HUA”，檢索疾病靶點(diǎn)。

2.1.3 篩選共同靶點(diǎn) 將藥物與疾病獲得的相關(guān)靶點(diǎn)輸入 Venn 數(shù)據(jù)庫（http://www.ehbio.com/test/venn/#/）在線平臺，進(jìn)入Interactive Venn diagram，得到共同靶點(diǎn)，繪制Venn 圖。利用Cytoscape 3.9.1軟件構(gòu)建中藥-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

2.1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將獲得的藥物與疾病的共同靶點(diǎn)上傳至STRING 數(shù)據(jù)庫（https://cn.stringdb.org/），物種選擇設(shè)置為“Homo sapiens”，將獲得數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1 軟件，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，分析并預(yù)測PPI 的潛在關(guān)系，結(jié)果保存為TSV 格式。

2.1.5 基因本體（gene ontology，GO）功能和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析 將獲得的藥物與疾病的共同靶點(diǎn)導(dǎo)入至 Metascape 數(shù)據(jù)庫（http://metascape.org），物種選擇設(shè)置為“Homo sapiens”，進(jìn)行GO 功能和KEGG 通路富集分析，通過生物信息學(xué)云平臺（http://www.bioinformatics.com.cn/）繪制氣泡圖。

2.2 動物實(shí)驗(yàn)

2.2.1 動物分組及造模給藥 將30 只SPF 級ICR雄性小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為對照組、模型組及荊防低、高劑量（1、2 g/kg）組和別嘌呤醇（25 mg/kg）組，每組6 只。除對照組外，其余各組每天ip 250 mg/kg 尿酸氧化酶抑制劑氧嗪酸鉀溶液（10 mL/kg，溶于0.5% CMC-Na 溶液），連續(xù)8 周，以構(gòu)建HUA模型，對照組給予等體積的CMC-Na 溶液。各給藥組ig 相應(yīng)藥物（10 mL/kg），對照組和模型組ig 等體積純化水，每天上午進(jìn)行造模，下午給藥治療。

2.2.2 血生化檢測 末次給藥2 h 后，各組小鼠ip 1%戊巴比妥溶液麻醉后取血，3000×g離心10 min，取血清，用于測定血清血尿酸、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）和血肌酐（creatinine，Cr）水平。

2.2.3 蘇木素-伊紅（HE）染色觀察腎組織病理 取各組小鼠腎臟組織，于4%多聚甲醛中固定，常規(guī)脫水、浸蠟、石蠟包埋并切片（5 μm），進(jìn)行HE 染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠腎組織病理變化。根據(jù)腎小管炎癥細(xì)胞浸潤、管腔壞死和腎小管擴(kuò)張等來評估組織病理學(xué)變化。評分標(biāo)準(zhǔn)：0 分，腎小球分布均勻，無炎性細(xì)胞浸潤，腎小管無擴(kuò)張；1 分，腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)較清晰，個別腎小管囊性擴(kuò)張；2分，部分腎小管、腎間質(zhì)擴(kuò)張水腫，少量炎性細(xì)胞浸潤；3 分，腎小管擴(kuò)張、腎間質(zhì)有炎性細(xì)胞浸潤、充血水腫；4 分，腎小球腫脹，炎性浸潤明顯，毛細(xì)血管腔不清晰，腎組織受損較嚴(yán)重，出現(xiàn)腎小管擴(kuò)張。

2.2.4 Western blotting 檢測腎組織Bax、Bcl-2 和cleaved Caspase-3蛋白表達(dá) 取各組小鼠右腎組織，充分研磨，在冰冷的RIPA 裂解緩沖液中裂解30 min后，9000×g離心10 min 后取上清，用BCA 檢測試劑盒測定蛋白濃度。蛋白樣品經(jīng)12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，加入5%脫脂牛奶，室溫封閉2 h，加入相應(yīng)一抗（1∶1000），4 ℃孵育過夜；用純化水洗滌后，加入二抗（1∶5000），室溫孵育2 h，純化水洗滌后，加入ECL 發(fā)光試劑顯影，利用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)對條帶可視化，并用Image J 軟件分析條帶灰度值。

2.2.5 腎臟代謝組學(xué) 取各組小鼠腎臟組織，按照腎組織∶疊氮化鈉=1 g∶50 μL 比例加入100 mg/mL 疊氮化鈉，取200 mg 樣品加4 mL 超純水，進(jìn)行均質(zhì)化，渦旋混勻后，再加入1 mL 80%甲醇水，渦旋震蕩10 min 后，冰浴靜置5 min，12 000 r/min 離心10 min，吸取上清液，按照1∶2 比例加入超純水稀釋，渦旋震蕩30 s，進(jìn)行LC-MS 分析。

色譜條件：Waters HSS T3 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），流動相為0.01%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～2 min，95% A；2～4 min，95%～45% A；4～23 min，45%～40% A；23～27 min，40%～0 A；27～28 min，100% B；28～32 min，0～95% A；32～34 min，95% A。體積流量0.20 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量2 μL。

質(zhì)譜條件：LTQ Orbitrap 串聯(lián)質(zhì)譜儀，采用正、負(fù)離子檢出模式，m/z100～1500，采集時間為0～30 min。加熱電噴霧離子源（HESI），正、負(fù)離子檢出模式，掃描范圍m/z50～1800；離子源溫度350 ℃；電離源電壓4 kV；毛細(xì)管電壓35 V；管透鏡電壓110 V；鞘氣和輔助氣均為高純氮?dú)猓磺蕷怏w積流量40 arb，輔助氣體積流量20 arb；數(shù)據(jù)采集采用傅里葉變換高分辨全掃方式（分辨率30 000）、數(shù)據(jù)依賴性DDA-MS2、母離子列表PIL-MS2 等多種采集策略，碰撞誘導(dǎo)裂解（CID）條件。

2.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Graphpad Prism 8.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果以表示，進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)及正態(tài)分布檢驗(yàn)。兩組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。

3 結(jié)果

3.1 “荊防顆粒-化合物-靶點(diǎn)-HUA”網(wǎng)絡(luò)及PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

根據(jù)梁紅寶等[5]通過GC-MS 和UPLC-QExactive MS 技術(shù)對荊防顆粒的化學(xué)成分進(jìn)行鑒定獲得的109 個主要化合物分析，通過TCMSP 與SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫最終得到相關(guān)靶點(diǎn)500個；在GeneCards、OMIM、TTD 數(shù)據(jù)庫中去重后共獲得HUA 相關(guān)靶點(diǎn)801 個，將荊防顆粒與HUA共同靶點(diǎn)繪制Venn 圖（圖1-A），共獲得87 個交集靶點(diǎn)。構(gòu)建“荊防顆粒-化合物-靶點(diǎn)-HUA”網(wǎng)絡(luò)（圖1-B），荊防顆粒治療HUA 存在多個化合物作用于同一個靶點(diǎn)，也存在1 個化合物與多個靶點(diǎn)發(fā)生作用的現(xiàn)象。將共同靶點(diǎn)傳至STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)（圖1-C），核心靶點(diǎn)包括甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、腫瘤蛋白p53（tumor protein p53，TP53）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、Caspase-3、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）等，提示荊防顆?？赡芡ㄟ^影響糖代謝與凋亡干預(yù)HUA。

圖1 荊防顆粒與HUA 靶點(diǎn)交集Venn 圖 (A)、“荊防顆粒-化合物-靶點(diǎn)-HUA”網(wǎng)絡(luò) (B) 和PPI 網(wǎng)絡(luò) (C)Fig.1 Venn diagram of intersection of Jingfang Granules and HUA targets (A),“Jingfang Granules-compound-target-HUA”network (B) and PPI network (C)

3.2 GO 功能和KEGG 通路富集分析

在進(jìn)一步探究荊防顆粒治療HUA 的過程中，通過GO 功能富集分析，篩選出相關(guān)性最高的前10條反應(yīng)過程（圖2），生物進(jìn)程（biological process，BP）主要涉及細(xì)胞對氮化合物的反應(yīng)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合過程等；分子功能（molecular function，MF）主要參與膜筏、池體；細(xì)胞組成（cellular component，CC）主要涉及防御反應(yīng)的調(diào)節(jié)、細(xì)胞死亡的正向調(diào)控、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）級聯(lián)調(diào)節(jié)等。表明荊防顆?？赡芡ㄟ^參與多種生物調(diào)控過程治療HUA。KEGG 通路富集分析（圖3）主要涉及脂質(zhì)與動脈粥樣硬化、凋亡信號通路、壞死性凋亡、缺氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）信號通路等。

圖2 荊防顆粒治療HUA 靶點(diǎn)的GO 功能富集分析 (前10)Fig.2 GO function enrichment analysis of Jingfang Granules in treating HUA target (top 10)

圖3 荊防顆粒治療HUA靶點(diǎn)的KEGG通路富集分析 (前20)Fig.3 KEGG pathway enrichment analysis of Jingfang Granules in treating HUA target (top 20)

3.3 荊防顆粒對HUA 小鼠腎臟功能的影響

通過建立氧嗪酸鉀誘導(dǎo)的HUA 小鼠模型，驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析的結(jié)果。如圖4-A～C 所示，與對照組比較，模型組小鼠血清中尿酸、BUN 和Cr水平均顯著升高（P＜0.05、0.001）；與模型組比較，各給藥組血清中尿酸水平均顯著降低（P＜0.01、0.001），荊防顆粒高劑量組BUN 和Cr 水平均顯著降低（P＜0.01、0.001）。

如圖4-D 所示，對照組小鼠腎小管細(xì)胞形態(tài)正常，邊界清晰；模型組小鼠腎小管嚴(yán)重擴(kuò)張，伴隨炎癥細(xì)胞浸潤；荊防顆粒低劑量組腎皮質(zhì)炎癥細(xì)胞一定程度減輕，趨于正常；荊防顆粒高劑量組腎小管形態(tài)明顯改善、炎癥明顯減輕；別嘌呤醇組小鼠腎小管管腔擴(kuò)張明顯，腎小球萎縮變形，炎癥細(xì)胞浸潤，與模型組差異不大，說明別嘌呤醇對腎組織的保護(hù)作用不明顯。

圖4 荊防顆粒對HUA 小鼠血清中尿酸 (A)、BUN (B)、Cr (C) 水平及腎組織病理的影響 (D) (,n=6;HE,×400)Fig.4 Effect of Jingfang Granules on levels of serum uric acid (A),BUN (B) and Cr (C) and renal histopathology of HUA mice(D) (,n=6;HE,× 400)

3.4 荊防顆粒對HUA 小鼠腎組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖5 所示，與對照組比較，模型組小鼠腎組織Bax 和cleaved Caspase-3 蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.01），Bcl-2 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組Bcl-2 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05、0.01、0.001），荊防顆粒高劑量組和別嘌呤醇組Bax 和cleaved Caspase-3 蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.01）。

圖5 荊防顆粒對HUA 小鼠腎組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 (,n=3)Fig.5 Effect of Jingfang Granules on apoptosis-related protein expressions in renal tissue of HUA mice (,n=3)

3.5 荊防顆粒對HUA 小鼠腎臟代謝通路的影響

PPI 網(wǎng)絡(luò)分析中，除參與凋亡及炎癥的靶點(diǎn)外，核心靶點(diǎn)GAPDH 參與糖酵解代謝通路，說明代謝可能在荊防顆粒治療HUA 的過程中起到重要作用?；谒幮W(xué)及Western blotting 結(jié)果，取對照組、模型組、荊防顆粒高劑量組小鼠腎臟代謝組學(xué)驗(yàn)證，在正離子和負(fù)離子 2 種模式下，主成分分析（principal component analysis，PCA）模型顯示了對照組、模型組和荊防顆粒高劑量組之間均表現(xiàn)出分離趨勢；正交偏最小二乘-判別分析（orthogonal partial least-squares discrimination analysis，OPLS-DA）結(jié)果顯示，對照組、模型組和荊防顆粒高劑量組之間的代謝產(chǎn)物顯著分離（圖6-A、B）。3 組之間的差異代謝物以熱圖表示（圖6-C），可見檸檬酸、磷酸二羥基丙酮等代謝產(chǎn)物含量減少，給予荊防顆粒后含量增加。根據(jù)差異代謝物采用KEGG 分析，結(jié)果顯示，代謝相關(guān)途徑在荊防顆粒治療HUA 中發(fā)揮了重要作用，包括丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的代謝，糖酵解/糖異生途徑，檸檬酸循環(huán)（圖6-D），與PPI 網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果一致。

圖6 各組小鼠腎臟組織代謝組學(xué)分析Fig.6 Renal tissue metabolism analysis of mice in each group

4 討論

HUA 是由于嘌呤代謝障礙所引起的慢性代謝病，其流行總體呈逐年升高趨勢，由于其在臨床上常與肥胖、2 型糖尿病、高血脂等代謝綜合征并發(fā)，給人們的生活帶來了較大影響。血尿酸水平持續(xù)升高導(dǎo)致尿酸鈉晶體沉積于最易受累的靶器官——腎臟，引發(fā)高尿酸性腎病[13]。目前臨床上用于治療HUA 的藥物靶點(diǎn)相對單一，肝腎毒副作用較大，而中醫(yī)藥以其多靶點(diǎn)、多途徑的獨(dú)特優(yōu)勢受到更多關(guān)注。荊防顆粒具有改善能量代謝循環(huán)、抗炎、抗氧化等作用[6,8]。研究表明，荊防顆粒可以通過調(diào)控蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）/MDm2/p53 通路、抑制細(xì)胞凋亡等途徑來減輕馬兜鈴酸造成的急性腎損傷[14]。

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)綜合中藥靶點(diǎn)和疾病模型相關(guān)靶點(diǎn)揭示中藥治療相關(guān)疾病及其機(jī)制是目前常用的一種方法[15]。趙方方等[16]通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究了薏苡附子敗醬散治療HUA 的作用機(jī)制，雷歡等[17]通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接方法探討香葉木素治療HUA 腎病的分子機(jī)制。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究荊防顆粒治療HUA 的有效成分、潛在靶點(diǎn)和作用機(jī)制，篩選到荊防顆粒治療HUA 的潛在靶點(diǎn)87 個，并通過PPI 網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵靶點(diǎn)包括GAPDH、TP53、TNF、Caspase-3、IL-6 等，其中，GAPDH 是參與糖酵解的一種關(guān)鍵酶，參與重要的代謝途徑，代謝異?？赡苁钦T導(dǎo)HUA 的潛在機(jī)制，TP53、Caspase-3等靶點(diǎn)都表明了荊防顆粒治療HUA 的抗凋亡特性。GO 功能和KEGG 通路富集分析表明，大多數(shù)靶點(diǎn)富集在凋亡信號通路、壞死性凋亡、HIF-1 信號通路等。研究表明，尿酸通過氧化應(yīng)激導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷[18-19]，一方面，這導(dǎo)致了腎小管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，另一方面，這導(dǎo)致了腎臟處于微缺氧狀態(tài)，HIF-1 是一種重要的缺氧誘導(dǎo)因子，缺氧可導(dǎo)致脂肪組織中的黃嘌呤氧化酶活性增加，大大增加尿酸分泌，進(jìn)一步惡化血尿酸水平[20]。

氧嗪酸鉀作為一種尿酸氧化酶抑制劑，其誘導(dǎo)的HUA 模型較為穩(wěn)定且易于構(gòu)建[21]。在本研究中，荊防顆粒能有效降低HUA 小鼠模型中的尿酸、BUN、Cr 水平，且能明顯改善腎臟病理表現(xiàn)。對網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果凋亡信號通路進(jìn)行驗(yàn)證，Western blotting 結(jié)果顯示，荊防顆?？梢越档虰ax、cleaved Caspase-3 的表達(dá)，增加Bcl-2 的表達(dá)，提示荊防顆粒通過減輕細(xì)胞凋亡，改善腎臟損害，降低血清尿酸水平。這與曹天佑等[14]研究中荊防顆粒可顯著抑制由炎癥導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡相一致。Bax 和Bcl-2表達(dá)水平的增加分別發(fā)揮了促凋亡和抗凋亡作用，促凋亡蛋白與抗凋亡蛋白共同決定了細(xì)胞凋亡水平[22-24]。cleaved Caspase-3 是Caspase-3 切割活化之后的活性形式，是參與細(xì)胞凋亡過程中真正執(zhí)行者[24]。

對網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果進(jìn)行代謝組學(xué)驗(yàn)證，根據(jù)HUA 小鼠腎臟代謝熱圖結(jié)果顯示，檸檬酸、磷酸二羥基丙酮等代謝產(chǎn)物含量減少，給予荊防顆粒后含量增加。研究表明，檸檬酸合成酶是糖代謝過程重要的限速酶[25]，它決定了線粒體呼吸和細(xì)胞生長中三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥和凋亡[26]，檸檬酸是三羧酸循環(huán)中的關(guān)鍵代謝物，其異常與腎臟疾病密切相關(guān)[27]。磷酸二羥丙酮是糖代謝過程中重要的中間產(chǎn)物，是聯(lián)系糖脂代謝的關(guān)鍵產(chǎn)物[28]。本研究結(jié)果提示由氧嗪酸鉀導(dǎo)致的HUA 可能抑制了糖代謝過程，說明HUA 小鼠體內(nèi)存在能量代謝的異常。KEGG結(jié)果顯示富集通路包括丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的代謝，糖酵解/糖異生途徑，檸檬酸循環(huán)，與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果一致，提示通過調(diào)控代謝可能是荊防顆粒對HUA 保護(hù)作用的關(guān)鍵機(jī)制之一

綜上所述，本研究基于荊防顆粒的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，佐以HUA 小鼠模型及腎臟代謝組學(xué)驗(yàn)證，探討荊防顆粒降低血清尿酸，改善尿酸性腎病的潛在機(jī)制。荊防顆粒治療HUA 與緩解細(xì)胞凋亡途徑有關(guān)，通過調(diào)節(jié)代謝改善HUA 引起的腎臟損害，證實(shí)了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測的結(jié)果。這些結(jié)果對進(jìn)一步研究荊防顆粒為HUA 模型小鼠提供了理論依據(jù)，也為中醫(yī)藥治療HUA 提供了線索和思路。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突