根皮素聚乙二醇-聚乳酸納米膠束的制備、表征及口服藥動學(xué)研究

董丹丹，焦紅軍*，郝海軍

1.鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院 藥學(xué)部，河南 鄭州 450000

2.上海市中藥研究所，上海 201401

根皮素屬于二氫查耳酮化合物，主要存在于草莓、蘋果、海棠葉、梨等果蔬或植物中。根皮素具有抗糖尿病、抗骨質(zhì)疏松、抗氧化、保護神經(jīng)系統(tǒng)、抗動脈粥樣硬化、抗菌等藥理活性[1-3]，在化妝品領(lǐng)域也有較多應(yīng)用[4]。根皮素溶解度為26.51 μg/mL[5]、穩(wěn)定性差[6]、生物利用度僅為8.68%[5-6]。因此，提高根皮素生物利用度是根皮素研發(fā)的難點和重點。馬記平等[5]對根皮素的磷脂復(fù)合物進行了研究，但磷脂復(fù)合物黏度較大，給藥便捷性差；楊金枝等[7]將根皮素制備成納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體，但輔料種類多、制備工藝復(fù)雜。

納米膠束是由兩親性聚合物載體在水相中形成的一種“核-殼”型膠體載藥系統(tǒng)，粒徑一般小于100 nm，具有載藥量高、抗稀釋能力強等優(yōu)勢[8-11]。聚乙二醇-聚乳酸［methoxy poly(ethylene glycol)-poly(lactic acid)，mPEG-PLA］聚合物材料在我國已實現(xiàn)量產(chǎn)，價格低廉，其結(jié)構(gòu)由PEG 親水端和PLA親脂端組成的兩親性聚合物材料，具有良好的黏液滲透性能，可促進藥物透過黏液層進入血液循環(huán)[12]，且體內(nèi)可生物降解，相容性高[13]，其臨界膠束濃度僅為7.71 mg/L[14]，可抵抗體外稀釋及體內(nèi)水相環(huán)境對膠束結(jié)構(gòu)的破壞，口服后可提高藥物在胃腸道中的穩(wěn)定性[15]、促進滲透、增加生物利用度及提高藥效等[9-10,12]。本研究以mPEG-PLA 材料為載體制備根皮素mPEG-PLA 納米膠束（phloretin mPEG-PLA nanomicelles，Phl@mPEG-PLA/NM），單因素考察結(jié)合Box-Behnken 設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化其處方工藝，并進行表征。以根皮素混懸液為對比，評價Phl@mPEG-PLA/NM 口服藥動學(xué)行為，為根皮素新型制劑開發(fā)提供參考數(shù)據(jù)及研究資料。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1200 型高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；FA1104 型電子天平，上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；HJ-4D 數(shù)顯恒溫測速磁力加熱攪拌器，江蘇省金壇市友聯(lián)儀器研究所；Zetasizer Nono ZS-90型粒度測定儀，英國馬爾文公司；JY92-IIN 超聲波細胞粉碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司；JEM-2100 透射電子顯微鏡（TEM），日本電子株式會社；RT61212 型溶出儀，深圳市銳拓儀器設(shè)備有限公司；HTM-BX 型超低溫冰箱，佛山市匯泰美機械設(shè)備有限公司；TG16 臺式高速離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司；FD-1D-80 型真空冷凍干燥機，江蘇天翎儀器有限公司；UGC-12MF 型氮吹儀，北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司。

1.2 材料

根皮素對照品，批號202008101，質(zhì)量分數(shù)98.3%，成都普菲德生物技術(shù)有限公司；根皮素原料藥，批號PT20200218，質(zhì)量分數(shù)97.0%，上海卓鼎生物技術(shù)有限公司；聚乙二醇-聚乳酸（mPEG5000-PLA2000），批號20210325，廣州碳水科技有限公司；地塞米松，批號529684，質(zhì)量分數(shù)99.2%，成都瑞芬思生物科技有限公司；十二烷基苯磺酸鈉（SDS），批號20191120，山東澳凱化工有限公司；甘露醇，批號20210525，壽光華力糖醇有限公司。

1.3 動物

SD 大鼠購自河南省動物實驗中心，許可證編號SCXK-2016-0001，清潔級，體質(zhì)量為（220±20）g。遵循鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院有關(guān)實驗動物管理和使用的規(guī)定，均符合3R 原則。

2 方法與結(jié)果

2.1 Phl@mPEG-PLA/NM 的制備[16]

薄膜分散-探頭超聲法制備Phl@mPEG-PLA/NM。固定根皮素投藥量10 mg 不變，取處方量的mPEG-PLA 置于圓底燒瓶中，加入適量乙醇超聲溶解。于45 ℃水浴溫度下緩慢旋轉(zhuǎn)蒸法除去乙醇形成一層均勻的薄膜，置于45 ℃真空干燥箱中過夜，以除盡有機溶劑。加入適量蒸餾水水化一定時間，超聲（功率為200 W），采用孔徑為0.22 μm 的微孔濾膜濾過，即得Phl@mPEG-PLA/NM。加入5%凍干保護劑（乳糖-甘露醇1∶1，質(zhì)量比）-30 ℃預(yù)凍2 d 后，置于-25 ℃凍干機中2 d，取出即得凍干粉。

2.2 根皮素含量測定

2.2.1 色譜條件 Symmetry-C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-0.1%磷酸水溶液（50∶50）；柱溫為30 ℃；進樣體積為10 μL；測波長為280 nm；體積流量為1.0 mL/min。

2.2.2 線性關(guān)系考察 采用甲醇配制0.5 mg/mL 的根皮素儲備液。取適量，采用甲醇-0.1%磷酸水溶液（50∶50）稀釋至10.00、5.00、1.00、0.25、0.10、0.05 μg/mL，進樣分析。以根皮素峰面積（Y）對其質(zhì)量濃度（X）做線性回歸，得回歸方程Y=42 618X+36 459，r=0.999 8，結(jié)果表明根皮素在0.05～10 μg/mL 線性關(guān)系良好。

2.2.3 供試品溶液的配制 取Phl@mPEG-PLA/NM 混懸液1 mL 至10 mL 量瓶中，加入適量甲醇超聲6 min，放置至室溫后定容，搖勻。取5 mL 至100 mL 量瓶中，甲醇-0.1%磷酸水溶液（50∶50）定容，即得供試品溶液。

2.2.4 專屬性考察 取mPEG-PLA 等輔料按照“2.1”項方法制備空白樣品，按照“2.2.3”項方法制備空白樣品溶液，另取根皮素對照品溶液、Phl@mPEG-PLA/NM 供試品溶液進樣分析，色譜圖見圖1，結(jié)果表明輔料未對根皮素色譜峰產(chǎn)生干擾，理論塔板數(shù)以根皮素計不低于7500。

圖1 空白輔料 (A)、根皮素對照品 (B) 和Phl@mPEGPLA/NM 樣品溶液 (C) 的HPLC 圖Fig.1 HPLC spectrum of blank excipients (A),phloretin reference substance (B) and Phl@mPEG-PLA/NM sample solution (C)

2.2.5 精密度試驗 取0.05、1.00、10.00 μg/mL 的根皮素對照品溶液，連續(xù)測定6 次，計算得根皮素峰面積的RSD 分別為0.63%、0.19%、0.24%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗 取Phl@mPEG-PLA/NM 供試品溶液，分別于制備后0、3、6、9、12、24 h 進樣測定，計算得根皮素峰面積的RSD 為0.92%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗 取Phl@mPEG-PLA/NM，按“2.2.3”項方法平行制備6 份供試品溶液，進樣測定，計算得根皮素質(zhì)量分數(shù)的RSD 為1.30%，結(jié)果表明該實驗重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗 分別取 0.5 mLPhl@mPEG-PLA/NM 混懸液，共9 份，置于10 mL 量瓶中，分為3 組（低、中、高質(zhì)量濃度組），分別加入質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL 的根皮素對照品溶液0.5、1.0、1.5 mL，制備供試品溶液。按“2.2.1”項色譜條件進樣測定，計算根皮素加樣回收率，結(jié)果顯示，根皮素的平均加樣回收率為101.06%，RSD 為1.50%，結(jié)果表明本實驗準(zhǔn)確度較高。

2.3 包封率、載藥量及沉降率的測定[16-18]

取0.5 mL 的Phl@mPEG-PLA/NM 混懸液，按“2.2”項下方法測定載藥膠束中總根皮素量（m總藥量）；另取Phl@mPEG-PLA/NM 0.5 mL 置于超濾離心管（截留相對分子質(zhì)量為3000）中，12 000 r/min 離心（離心半徑8.6 cm）8 min，HPLC 測定超濾管外液中根皮素游離藥物量（m游離）；取載藥膠束直接冷凍干燥，稱定質(zhì)量（m總）。計算包封率和載藥量。

包封率=(m總藥量-m游離)/m總藥量

載藥量=(m總藥量-m游離)/m總

沉降率用來衡量膠束的穩(wěn)定性[18]，是膠束重要指標(biāo)之一。取新制備的納米膠束（M新）置于溫度為4 ℃冰箱中2 d，取適量于8000 r/min 離心（離心半徑8.6 cm）10 min 分離析出藥物，取離心液采用0.22 μm 的微孔濾膜濾過，并測定根皮素量（M2d），計算藥物沉降率。

沉降率=(M新-M2d)/M新

2.4 納米膠束粒徑、多分散指數(shù)（polydispersity index，PDI）和ζ 電位測定

取Phl@mPEG-PLA/NM 適量，加入純化水稀釋40 倍，震蕩混勻，置于激光粒儀中測定其粒徑、PDI值和ζ 電位值。

2.5 Phl@mPEG-PLA/NM 制備工藝單因素研究

2.5.1 mPEG-PLA 用量考察 固定根皮素用量為10 mg，水化溫度為40 ℃，水相體積為9 mL，水化時間為2 h，超聲時間為10 min 等條件不變，分別考察mPEG-PLA 用量對Phl@mPEG-PLA/NM 包封率、載藥量和沉降率的影響。結(jié)果見表1，隨著mPEG-PLA 用量的增加，包封率逐漸增加，用量達到100 mg 后包封率趨穩(wěn)，說明載體載藥基本達飽和狀態(tài)，繼續(xù)增加用量時導(dǎo)致載藥量下降。膠束的沉降率呈明顯的下降趨勢，提示增加載體用量有助于提高納米膠束的穩(wěn)定性[15]?？梢娸d體用量對納米膠束影響較大，后續(xù)需對mPEG-PLA 用量繼續(xù)進行優(yōu)化。

表1 mPEG-PLA 用量對Phl@mPEG-PLA/NM 包封率、載藥量和沉降率的影響 (,n=3)Table 1 Effects of mPEG-PLA amounts on Phl@mPEGPLA/NM encapsulation efficiency,drug loading and sedimentation rate (,n=3)

表1 mPEG-PLA 用量對Phl@mPEG-PLA/NM 包封率、載藥量和沉降率的影響 (,n=3)Table 1 Effects of mPEG-PLA amounts on Phl@mPEGPLA/NM encapsulation efficiency,drug loading and sedimentation rate (,n=3)

2.5.2 水化體積的考察 固定根皮素用量為10 mg，mPEG-PLA 用量為100 mg，水化溫度為40 ℃，水化時間為2 h，超聲時間為10 min 等條件不變，考察水化體積對Phl@mPEG-PLA/NM 包封率、載藥量和沉降率的影響。結(jié)果見表2，隨著水化體積的增加，包封率和載藥量先變大后下降?？赡苁撬w積較小時，mPEG-PLA 材料的舒展程度不足，且藥物濃度過高，容易達過飽和狀態(tài)，最終影響了載藥。水化體積過大時，部分藥物可進入水相，另一方面，mPEG-PLA 濃度下降，影響了載體的包載能力[12]。沉降率先減小后增大，說明水化體積也對膠束的穩(wěn)定性產(chǎn)生一定影響。故后續(xù)需對水化體積進行優(yōu)化。

表2 水化體積對Phl@mPEG-PLA/NM 包封率、載藥量和沉降率的影響 (,n=3)Table 2 Effects of hydration volume on Phl@mPEG-PLA/NM encapsulation efficiency,drug loading and sedimentation rate (,n=3)

表2 水化體積對Phl@mPEG-PLA/NM 包封率、載藥量和沉降率的影響 (,n=3)Table 2 Effects of hydration volume on Phl@mPEG-PLA/NM encapsulation efficiency,drug loading and sedimentation rate (,n=3)

2.5.3 水化溫度的考察 固定根皮素用量為10 mg，mPEG-PLA 用量為100 mg，水化體積為9 mL，水化時間為2 h，超聲時間為10 min 等條件不變，考察水化溫度對Phl@mPEG-PLA/NM 包封率、載藥量和沉降率的影響。結(jié)果見表3。隨著水化溫度的升高，納米膠束的包封率和載藥量逐漸增加，說明適當(dāng)提高水合溫度利于mPEG-PLA 包載藥物，但溫度達到50 ℃時包封率、載藥量開始下降，可能由于過高的溫度影響mPEG-PLA 穩(wěn)定性，進而影響包載藥物，也可能對已形成的膠束產(chǎn)生破壞作用。水化溫度對沉降率也有較大影響，故后續(xù)需對水化溫度繼續(xù)進行優(yōu)化。

表3 水化溫度對Phl@mPEG-PLA/NM 包封率、載藥量和沉降率的影響 (,n=3)Table 3 Effects of hydration temperature on Phl@mPEGPLA/NM encapsulation efficiency,drug loading and sedimentation rate (,n=3)

表3 水化溫度對Phl@mPEG-PLA/NM 包封率、載藥量和沉降率的影響 (,n=3)Table 3 Effects of hydration temperature on Phl@mPEGPLA/NM encapsulation efficiency,drug loading and sedimentation rate (,n=3)

2.5.4 水化時間 固定根皮素用量為10 mg，mPEGPLA 用量為100 mg，水化體積為9 mL，水化溫度為45 ℃，超聲時間為10 min 等條件不變，考察水化時間對Phl@mPEG-PLA/NM 包封率、載藥量和沉降率的影響。結(jié)果見表4。隨著水化時間的增加，納米膠束的包封率和載藥量逐漸增加，說明適當(dāng)增加水化時間對mPEG-PLA 包載藥物產(chǎn)生積極影響，但水化時間達到4 h 時膠束的包封率和載藥量均出現(xiàn)下降，沉降率上升?？赡苡捎谀z束是熱力學(xué)不穩(wěn)定體系，過長的水化時間可能對膠束產(chǎn)生破壞作用。由于水化時間為3 h 時，膠束包封率、載藥量和沉降率均相對理想，故選之。

表4 水化時間對Phl@mPEG-PLA/NM 包封率、載藥量和沉降率的影響 (,n=3)Table 4 Effects of hydration time on Phl@mPEG-PLA/NM encapsulation efficiency,drug loading and sedimentation rate (,n=3)

表4 水化時間對Phl@mPEG-PLA/NM 包封率、載藥量和沉降率的影響 (,n=3)Table 4 Effects of hydration time on Phl@mPEG-PLA/NM encapsulation efficiency,drug loading and sedimentation rate (,n=3)

2.5.5 超聲時間的考察 固定根皮素用量為10 mg，mPEG-PLA 用量為100 mg，水化體積為9 mL，水化時間3 h，水化溫度為45 ℃等條件不變，考察超聲時間對Phl@mPEG-PLA/NM 包封率、載藥量和沉降率的影響。由結(jié)果（表5）可知，過長的超聲時間可能破壞納米膠束結(jié)構(gòu)，超聲時間為12 min 時，膠束的各個指標(biāo)均相對理想。

表5 超聲時間對Phl@mPEG-PLA/NM 包封率、載藥量和沉降率的影響 (,n=3)Table 5 Effects of ultrasonic time on Phl@mPEG-PLA/ NM encapsulation efficiency,drug loading and sedimentation rate (,n=3)

表5 超聲時間對Phl@mPEG-PLA/NM 包封率、載藥量和沉降率的影響 (,n=3)Table 5 Effects of ultrasonic time on Phl@mPEG-PLA/ NM encapsulation efficiency,drug loading and sedimentation rate (,n=3)

2.6 Box-Behnken 設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化處方工藝

2.6.1 試驗設(shè)計 采用包封率、載藥量和沉降率3個指標(biāo)對Phl@mPEG-PLA/NM 處方工藝進行優(yōu)化，并分別作為因變量Y1、Y2和Y3。根據(jù)“2.5”項單因素考察發(fā)現(xiàn)，mPEG-PLA 用量（X1）、水化體積（X2）和水化溫度（X3）對該3 個指標(biāo)影響較大，根據(jù)單因素考察結(jié)果確定各考察因素的水平見表6。

為綜合反映包封率、載藥量和沉降率3 個指標(biāo)對處方工藝的影響，將該3 個指標(biāo)作歸一化處理，按照如下步驟計算總評歸一值（overall desirability，OD）。包封率和載藥量的計算公式為dmax=(Mi-Mmin)/(Mmax-Mmin)；沉降率計算公式為dmin=(Mmax-Mi)/(Mmax-Mmin)，公式中Mi為實際值，Mmin和Mmax分別為試驗中最小值和最大值；將所得包封率和載藥量的dmax及沉降率的dmin值帶入OD=(d1d2…dk)1/k，k為指標(biāo)數(shù)，即得各組試驗的OD 值，結(jié)果見表6。

2.6.2 數(shù)學(xué)模型、顯著性檢查及結(jié)果 利用Design Expert V8.0.6軟件對表6中數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得OD 方程為OD=0.970+0.060X1+0.029X2+0.068X3-0.048X1X2+0.088X1X3-0.087X2X3-0.290X12-0.130X22-0.580X32，R2=0.993 1，Radj2=0.984 3。顯著性檢查結(jié)果見表7，模型P值具有極顯著性水平；失擬項為0.069 7＞0.05，提示無顯著性水平，因此，擬合得到的數(shù)學(xué)模型基本無干擾性。

表6 Box-Behnken 設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化處方工藝的試驗設(shè)計與結(jié)果 (n=3)Table 6 Experiments design and results of Box-behnken design-response surface method to optimize formulation process (n=3)

表7 方差分析 (OD 值)Table 7 Analysis of variance (OD values)

方差分析結(jié)果顯示，X1、X3、X1X3、X2X3、X12、X22和X32均有統(tǒng)計學(xué)意義。各因素對響應(yīng)值OD 的3D 響應(yīng)面圖見圖2，Phl@mPEG-PLA/NM 最佳處方為mPEG-PLA 用量為104.09 mg、水化體積為9.21 mL、水化溫度40.21 ℃，預(yù)測包封率為90.16%，載藥量為9.04%，沉降率為7.79%。

圖2 自變量 (X1,X2,X3) 與響應(yīng)值 (OD) 的三維圖Fig.2 Three-dimensional plot of independent factors (X1,X2,X3) and response values (OD)

2.7 工藝驗證

為便于操作，將Phl@mPEG-PLA/NM 處方調(diào)整為mPEG-PLA 用量為105 mg、水化體積為9.5 mL、水化溫度40 ℃。平行制備3 批納米膠束并凍干，外觀見圖3，根皮素原料藥混懸液可見不溶性藥物顆粒及沉淀，但納米膠束呈現(xiàn)透明的藍色乳光，兩者有明顯差別，凍干粉外觀均一飽滿。測定各主要指標(biāo)并計算偏差，公式為偏差=(預(yù)測值-實際值)/預(yù)測值，結(jié)果見表8。各指標(biāo)的相對偏差均小于±5%，說明Box-Behnken 設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化Phl@mPEGPLA/NM 處方時具有重現(xiàn)性好、精確度高的特點。凍干粉復(fù)溶后測得平均粒徑為（85.07±6.12）nm，PDI 為0.065±0.008，粒徑分布見圖4；平均ζ 電位為（-23.56±1.49）mV，ζ 電位見圖5。

圖3 Phl@mPEG-PLA/NM 外觀Fig.3 Appearance of PHL-mPEG-PLA nanomicelles

表8 預(yù)測值和實際值的比較 (,n=3)Table 8 Comparison of predictive and actual value (,n=3)

表8 預(yù)測值和實際值的比較 (,n=3)Table 8 Comparison of predictive and actual value (,n=3)

圖4 Phl@mPEG-PLA/NM 的粒徑分布Fig.4 Distribution diagram of particle size Phl@mPEGPLA/NM

圖5 Phl@mPEG-PLA/NM 的ζ 電位Fig.5 Diagram of ζ potential of Phl@mPEG-PLA/NM

2.8 TEM 觀察

采用純化水將Phl@mPEG-PLA/NM 混懸液稀釋40 倍，震蕩混勻，吸取適量滴至銅網(wǎng)上，1.5%磷鎢酸鈉染色，室溫自然晾干，置于TEM 下觀察其外貌，結(jié)果見圖6?？梢?，納米膠束為類球形，無黏連現(xiàn)象。

圖6 納米膠束的TEM 圖 (×14 000)Fig.6 TEM picture of nanomicelles (× 14 000)

2.9 體外釋藥及模型擬合

取根皮素原料藥作為對照，加入無水乙醇溶解，取適量（使根皮素質(zhì)量為10 mg）加入空白釋藥介質(zhì)至4 mL，備用。取適量Phl@mPEG-PLA/NM 凍干粉適量（使根皮素質(zhì)量為8 mg），加空白釋藥介質(zhì)至4 mL 制備混懸液。分別置于活化的透析袋中，兩端扎緊后置于溫度為（37±1）℃、體積為1000 mL 的1.5%的SDS 水溶液中，于轉(zhuǎn)速為75 r/min 條件下比較釋藥情況，于0.50、0.75、1.00、1.50、2.00、4.00、6.00、12.00、18.00、24.00、48.00、72.00 h 取樣，取樣量和補加空白釋藥介質(zhì)均為3 mL。用0.22 μm 濾膜濾過后測定根皮素含量，結(jié)果見圖7。根皮素在4 h 基本釋放完全，但Phl@mPEG-PLA/NM 釋藥過程表現(xiàn)出一定的緩釋特點，在6、12、24、72 h的累積釋放率分別為27.03%、42.95%、63.17%、82.76%。納米膠束體外釋藥模型擬合結(jié)果見表9，根據(jù)相關(guān)系數(shù)R2判斷，Phl@mPEG-PLA/NM 體外釋藥過程與Higuchi 模型擬合程度最高，擬合方程為Mt/M∞=0.113t1/2+0.034。

圖7 體外釋放曲線 (,n=6)Fig.7 Release profiles in vitro (,n=6)

表9 藥物釋放模型和相關(guān)系數(shù)Table 9 Fitting release model and coefficient

2.10 凍干粉穩(wěn)定性考察

取Phl@mPEG-PLA/NM 凍干粉置于恒溫恒濕箱中（溫度30 ℃，濕度65%），于0、15、30、45、60、90 d 取樣測定復(fù)溶后包封率、粒徑及沉降率，結(jié)果見表10。凍干粉在90 d 內(nèi)包封率和粒徑基本維持不變，說明穩(wěn)定性較高。

表10 穩(wěn)定性考察 (,n=3)Table 10 Study of stability (,n=3)

表10 穩(wěn)定性考察 (,n=3)Table 10 Study of stability (,n=3)

2.11 藥動學(xué)研究

2.1 1.1 藥動學(xué)研究方案 取12 只健康SD 大鼠（雌雄兼具），分為根皮素原料藥和Phl@mPEG-PLA/NM 2 組，自由飲水但禁食12 h。按60 mg/kg 分別進行ig 給藥，分別于10、15、30 min 及1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、12.0 h 于眼眶后靜脈叢取血約250 μL，至離心管中（肝素浸潤），震蕩混勻，3500 r/min 離心（離心半徑8.6 cm）4 min，取上層淡黃色血漿，冷凍保存。

2.1 1.2 血漿樣品的處理[19]室溫下解凍血漿樣品，精密吸取100 μL 至空白離心管中，加入50 μL地塞米松內(nèi)標(biāo)溶液（1000 ng/mL）、100 μL 甲醇和1 mL 醋酸乙酯，渦旋5 min 后超聲30 s，8000 r/min離心（離心半徑8.6 cm）5 min。取上清液于40 ℃水浴中氮氣緩慢吹干，加入100 μL 甲醇復(fù)溶后8000 r/min 離心5 min，取上清液測定。

2.1 1.3 溶液的配制及線性關(guān)系考察 采用甲醇配制濃度為1000 ng/mL 的地塞米松對照品溶液，作為內(nèi)標(biāo)溶液。用甲醇配制質(zhì)量濃度為1.6 μg/mL 的根皮素對照品溶液，并稀釋至1600、800、400、100、50、25 ng/mL，分別取200 μL，40 ℃水浴中氮氣緩慢吹干，加入200 μL 空白血漿，渦旋5 min 后超聲30 s。按“2.11.2”項方法處理，即得根皮素血漿對照品溶液（含內(nèi)標(biāo)），以根皮素與地塞米松峰面積比為縱坐標(biāo)（y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），得回歸方程y=0.014 6x+0.500 6，r=0.995 8，結(jié)果表明根皮素線性范圍為25～1600 ng/mL。

2.1 1.4 方法學(xué)考察 取空白血漿、血漿對照品（根皮素質(zhì)量濃度為400 ng/mL）和血漿樣品溶液（根皮素原料藥ig 給藥4 h）分別進樣，結(jié)果見圖8，血漿內(nèi)源性物質(zhì)不干擾根皮素和地塞米松的色譜峰，專屬性高。

圖8 空白血漿 (A)、血漿樣品 (B) 和血漿對照品溶液 (C)的HPLC 圖Fig.8 HPLC of blank plasma (A),plasma sample (B),plasma reference solution (C)

取25、400、1600 ng/mL 的根皮素血漿對照品溶液，同1 d 內(nèi)連續(xù)測定6 次，計算得根皮素與地塞米松峰面積比值的RSD 分別為6.17%、5.02%、3.90%，結(jié)果表明日內(nèi)精密度良好；于6 d 內(nèi)分別進行測試，計算得根皮素與地塞米松峰面積比值的RSD 分別為8.23%、4.73%、5.45%，結(jié)果表明日間精密度良好。

取血漿樣品溶液于0、2、4、8、12、24 h 進樣測試，計算得根皮素與地塞米松峰面積比值的RSD為7.91%，結(jié)果表明穩(wěn)定性良好。

取25、400、1600 ng/mL（低、中、高質(zhì)量濃度）的根皮素血漿對照品溶液，每個質(zhì)量濃度均3 份，進樣測試根皮素與地塞米松峰面積比值，帶入血漿對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線計算根皮素的測得含量，并與實際含量比較，計算得3 種質(zhì)量濃度下的平均回收率為94.16%，RSD 為8.82%，可見本實驗的準(zhǔn)確度較高。

2.1 1.5 藥動學(xué)結(jié)果 藥-時曲線見圖9，血藥濃度數(shù)據(jù)用DAS 2.0 軟件非房室模型對數(shù)據(jù)進行分析，主要藥動學(xué)參數(shù)見表11。與根皮素原料藥混懸液的主要藥動學(xué)參數(shù)tmax、t1/2、Cmax、AUC0～t等藥動學(xué)參數(shù)相比，Phl@mPEG-PLA/NM 主要藥動學(xué)參數(shù)發(fā)生顯著變化（P＜0.05、0.01）。Phl@mPEG-PLA/NM 將根皮素的tmax延后至（2.04±0.42）h，且t1/2增加至（4.60±0.84）h。且Cmax增加至2.82 倍，說明mPEGPLA 納米膠束極大促進了根皮素的口服吸收，相對口服生物利用度提高至3.34 倍。

圖9 藥-時曲線 (,n=6)Fig.9 Profiles of plasma concentration-time (,n=6)

表11 主要藥動學(xué)參數(shù) (,n=6)Table 11 Main pharmacokinetic parameters (,n=6)

表11 主要藥動學(xué)參數(shù) (,n=6)Table 11 Main pharmacokinetic parameters (,n=6)

與根皮素原料藥比較：*P＜0.05 **P＜0.01*P ＜ 0.05 **P ＜ 0.01 vs phloretin drug substance

3 討論

mPEG-PLA 作為兩親性高分子材料，在水相中的濃度超過臨界膠束濃度后可形成納米膠束，可提高藥物的溶解度、溶出度及生物利用度[10,20]，制備方法簡單。本研究報道的Phl@mPEG-PLA/NM 無需使用表面活性劑，減少了輔料種類，避免了潛在的毒副作用及不良反應(yīng)。

納米膠束常用的制備方法有溶劑揮發(fā)法、薄膜分散法等，但薄膜分散法制得膠束的包封率和載藥量較高[21-22]。可能是由于通過薄膜分散法可使藥物與載體充分融合、接觸，使疏水性藥物更易被聚合物中疏水性鏈段締合、包裹從而形成膠束[17]。溶劑揮發(fā)法需加熱攪拌除去有機溶劑，可能會影響聚合物材料的穩(wěn)定性，而且也可能存在溶劑殘留問題。Phl@mPEG-PLA/NM 體外釋藥具有一定的緩釋特點，這可能是由于根皮素分子結(jié)構(gòu)中活潑性基團與聚合物載體基團之間，形成了某種作用力（如氫鍵等）[22-23]，使藥物從膠束的內(nèi)核擴散至釋藥介質(zhì)阻力較大所致。

一室模型與二室模型擬合結(jié)果均不理想，故最終采用了基于統(tǒng)計矩理論的非房室模型進行計算。Phl@mPEG-PLA/NM 的tmax延后至（2.04±0.42）h，可能是由于Phl@mPEG-PLA/NM 粒徑較小，極易吸附于胃腸道中延緩了入血速度[24]，另外膠束載體材料的阻滯作用也可能對tmax產(chǎn)生影響。納米膠束的t1/2得到延長，說明增加了藥物在體內(nèi)的血藥濃度水平，有助于提高生物利用度。

Phl@mPEG-PLA/NM 的口服相對生物利用度提高至3.34 倍，可能是由于根皮素包裹進mPEGPLA 膠束內(nèi)核后藥物的親水性得到提高，有利于與腸道親水性黏液層接觸，進而利于藥物吸收；納米膠束可增加藥物腸道滲透吸收[25-26]；藥物的粒徑得到極大下降，利于溶解度的提高及與胃腸道充分接觸[27-28]；mPEG-PLA 表面的mPEG 接枝可避免網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬[10,29]，增加體循環(huán)時間，因而最終提高了根皮素的口服吸收生物利用度。本研究完成了Phl@mPEG-PLA/NM 制備工藝及口服藥動學(xué)評價，將來繼續(xù)對注射藥動學(xué)、藥效學(xué)進行研究，為該制劑提供更為完整的研究資料。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突