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    經(jīng)典名方陽和湯基準樣品量值傳遞分析

    2023-02-08 03:20:38張澤康王昌海趙玥瑛張馨雨杜守穎
    中草藥 2023年3期

    張澤康,王昌海,趙玥瑛,張 晴,席 鋮,張馨雨,孫 萌,董 爽,杜守穎,白 潔,陸 洋

    北京中醫(yī)藥大學中藥學院,北京 102488

    陽和湯出自清代王洪緒所著《外科證治全生集》,全方由熟地黃、鹿角膠、肉桂、炒白芥子、麻黃、姜炭、甘草7 味藥組成。具有溫陽補血、散寒通滯的功效,主治陰疽。在現(xiàn)代臨床中,陽和湯及其加減方廣泛用于治療外科(乳腺癌等惡性腫瘤)、內(nèi)科(哮喘、消化性潰瘍、心血管系統(tǒng)疾病等)、婦科(多囊卵巢綜合征、外陰濕疣、乳腺結節(jié)、痛經(jīng)等)、骨科(膝關節(jié)炎、股骨頭壞死等)、兒科(流行性腮腺炎等)、皮膚科(痤瘡、皮脂腺囊腫、蕁麻疹等)、男科(腎陽虛損、精血不足、陰寒痰濕而致的各種男科病證等)等各類疾病[1-6],療效顯著,開發(fā)前景良好。《中藥注冊分類及申報資料要求》[7]明確提出,為加強對古典醫(yī)籍精華的梳理和挖掘,將中藥注冊分類中的第3 類古代經(jīng)典名方中藥復方制劑細分為“3.1 按古代經(jīng)典名方目錄管理的中藥復方制劑”及“3.2 其他來源于古代經(jīng)典名方的中藥復方制劑”(以下簡稱3.2 類)。其中3.2 類包括未按古代經(jīng)典名方目錄管理的古代經(jīng)典名方中藥復方制劑和基于古代經(jīng)典名方加減化裁的中藥復方制劑,對陽和湯進行經(jīng)典名方的開發(fā)研究意義重大。

    目前,陽和湯的相關文獻多集中在藥理作用及臨床應用等方面,關于其基準樣品量值傳遞的研究尚未見有文獻報道。本實驗參考《古代經(jīng)典名方中藥復方制劑及其物質(zhì)基準的申報資料要求(征求意見稿)》[8](以下簡稱《征求意見稿》)相關內(nèi)容,通過制備15 批陽和湯基準樣品,建立其指紋圖譜,進行相似度及特征峰歸屬分析,并結合指標性成分含量、轉(zhuǎn)移率以及出膏率,進行飲片到基準樣品的量值傳遞分析及整體質(zhì)量研究,為后續(xù)復方制劑的開發(fā)提供理論支撐。

    1 儀器與材料

    1.1 儀器

    JM-B100002 型1/10 萬電子天平,余姚市紀銘稱重校驗設備有限公司;BSA 224S 型1/1 萬電子分析天平,賽多利斯科學儀器(北京)有限公司;陶瓷鍋(體積1 L,長12 cm×寬12 cm×高10 cm,材質(zhì)為高嶺土/鋰輝石),九龍家居陶瓷館;SHB-III型循環(huán)水式多用真空泵,鄭州長城科工貿(mào)有限公司;H22-X3 型九陽電陶爐,杭州九陽生活電器有限公司;FD-2A 型真空冷凍干燥機,北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司;UltiMate 3000 型高效液相色譜儀,賽默飛世爾科技(中國)有限公司,包含二極管陣列檢測器(DAD)和Chromeleon 7.2 色譜工作站。

    1.2 材料

    地黃、肉桂、芥子、麻黃、干姜和甘草藥材經(jīng)北京中醫(yī)藥大學劉春生教授鑒定,分別為玄參科地黃屬植物地黃Rehmannia glutinosaLibosch.的新鮮或干燥塊根、樟科樟屬植物肉桂Cinnamomum cassiaPresl 的干燥樹皮、十字花科白芥屬植物白芥Sinapis albaL.的干燥成熟種子、麻黃科麻黃屬植物草麻黃Ephedra sinicaStapf 的干燥草質(zhì)莖、姜科姜屬植物姜Zingiber officinaleRosc.的干燥根莖、豆科甘草屬植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的干燥根和根莖。本課題組依照《中國藥典》2020 年版各藥材項下飲片炮制要求,分別制成肉桂、炒白芥子、麻黃、姜炭及甘草飲片(熟地黃、鹿角膠飲片由健民藥業(yè)集團股份有限公司提供),單味藥材、飲片質(zhì)量經(jīng)本課題組前期檢測均符合要求,藥材產(chǎn)地信息見表1。

    表1 陽和湯組方藥材來源信息Table 1 Source information of Yanghe Decoction prescription medicinal materials

    對照品毛蕊花糖苷(批號111530-201914,質(zhì)量分數(shù)95.2%)、桂皮醛(批號110710-202022,質(zhì)量分數(shù)98.7%)、肉桂酸(批號110786-201604,質(zhì)量分數(shù)98.8%)、芥子堿硫氰酸鹽(批號111702-202006,質(zhì)量分數(shù)99.0%)、鹽酸麻黃堿(批號171241-201809,質(zhì)量分數(shù)100.0%)、鹽酸偽麻黃堿(批號171237-201510,質(zhì)量分數(shù)99.8%)、6-姜辣素(批號111833-202007,質(zhì)量分數(shù)99.3%)、甘草苷(批號111610-201908,質(zhì)量分數(shù)95.0%)、甘草酸銨(批號110731-202021,質(zhì)量分數(shù)96.2%),均購自中國食品藥品檢定研究院;對照品地黃苷D(CAS 號81702-08-3,質(zhì)量分數(shù)≥98.0%)、5-羥甲基糠醛(CAS 號67-47-0,質(zhì)量分數(shù)≥98.0%),均購自上海源葉生物科技有限公司。乙腈、磷酸,色譜純,F(xiàn)isher 公司;甲醇、三乙胺,分析純,北京化工廠;娃哈哈純凈水,杭州娃哈哈集團有限公司;其他試劑為分析純。

    2 方法與結果

    2.1 15 批陽和湯基準樣品的制備

    《外科證治全生集》記載陽和湯原方為“熟地一兩,鹿角膠三錢,肉桂一錢,白芥子二錢,麻黃五分,姜炭五分,生甘草一錢,治療貼骨疽,鶴膝風等陰疽,如治乳癖和乳巖,加土貝五錢?!眳⒄铡吨嗅t(yī)名詞術語選釋》[9]和《古今中藥超大劑量應用集萃》[10]等文獻中的古今中藥劑量換算表記載,折算陽和湯全方現(xiàn)代臨床用藥劑量。根據(jù)《古代經(jīng)典名方中藥復方制劑簡化注冊審批管理規(guī)定》中的相關要求[11],經(jīng)典名方的制備方法要與古代醫(yī)籍中記載的一致。查閱始載陽和湯的古籍《外科證治全生集》及不同時代記載陽和湯的書籍及相關文獻,均未記錄其具體的煎煮方法。因此,陽和湯基準樣品的煎煮方式參照《醫(yī)療機構中藥煎藥室管理規(guī)范》2009年版的相關規(guī)定進行[12]。最終確定處方劑量為分別稱取熟地黃飲片37.3 g、肉桂飲片3.7 g、炒白芥子飲片7.5 g、麻黃飲片1.9 g、姜炭飲片1.9 g、甘草飲片3.7 g,加水450 mL,武火(電陶爐火鍋檔600 W)加熱煮沸后,文火(電陶爐火鍋檔200 W)煎煮30 min,放置待煎液降至50 ℃左右,300 目無紡布濾過,藥渣再加水336 mL,同法煎煮30 min,300目無紡布濾過,合并2 次濾液,放涼后加水調(diào)整體積至600 mL,精密移取煎液5 mL 于25 mL 西林瓶中,置于-80 ℃預冷2 h 的冷凍干燥機,凍干溫度-80 ℃,真空度(5±1)Pa,冷凍干燥48 h,取出壓蓋密塞,即得陽和湯基準樣品凍干粉。鹿角膠的加入方式另行考察。

    同法制備單味飲片及缺單味飲片陰性樣品。

    將熟地黃、肉桂、炒白芥子、麻黃、姜炭、甘草各15 批飲片采用隨機數(shù)表法隨機組合形成15 批陽和湯基準樣品[本課題組前期對15 批干姜、甘草藥材進行檢測,質(zhì)量均符合要求。依照《中國藥典》2020 年版各藥材項下飲片炮制要求炮制為對應飲片,經(jīng)檢測13 批姜炭飲片、10 批甘草飲片質(zhì)量符合要求,故隨機選定2 批姜炭飲片(批號20210706、20210711)、5 批甘草飲片(批號20210801~20210804、20210806)重復使用,組合成15 批陽和湯基準樣品],編號為S1~S15,具體組合信息見表2。

    表2 15 批陽和湯基準樣品隨機組合信息Table 2 Random combination information of 15 batches of Yanghe Decoction benchmark samples

    2.2 陽和湯基準樣品指紋圖譜的建立

    2.2.1 色譜條件 Zorbax SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相乙腈-0.05%磷酸水溶液(含0.05%三乙胺溶液),梯度洗脫:0~5 min,2%~3%乙腈;5~15 min,3%~5%乙腈;15~65 min,5%~30%乙腈;65~90 min,30%~70%乙腈;體積流量1 mL/min;柱溫35 ℃;檢測波長210、260 nm;進樣量10 μL。

    2.2.2 供試品溶液的制備 取陽和湯基準樣品凍干粉0.15 g,精密稱定,加入10 mL 50%甲醇中,溶解,搖勻,室溫放置10 min,于10 000 r/min 離心(離心半徑5.79 cm)5 min,取上清液過0.22 μm 微孔濾膜,即得供試品溶液。

    2.2.3 精密度試驗 取編號為S1 的陽和湯基準樣品1 份,按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液,按“2.2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6 次,以11 號峰(桂皮醛)為參照(參照峰選擇依據(jù):以峰形對稱,分離度優(yōu),無拖尾現(xiàn)象,且峰面積穩(wěn)定為選擇依據(jù),選定桂皮醛作為參照峰),計算各共有峰的相對保留時間的RSD 均<0.20%,相對峰面積的RSD 均<2.58%,表明儀器精密度良好。

    2.2.4 重復性試驗 取編號為S1 的陽和湯基準樣品1 份,按“2.2.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液,按“2.2.1”項下色譜條件進樣,以11 號峰(桂皮醛)為參照,計算各共有峰的相對保留時間的RSD 均<0.98%,相對峰面積的RSD 均<1.44%,表明該方法重復性良好。

    2.2.5 穩(wěn)定性試驗 取編號為S1 的陽和湯基準樣品1 份,按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液,按“2.2.1”項下色譜條件分別在制備后0、2、4、6、8、10、12、24 h 進樣,以11 號峰(桂皮醛)為參照,計算各共有峰的相對保留時間的RSD 均<0.72%,相對峰面積的RSD 均<3.06%,表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

    2.2.6 指紋圖譜建立及相似度評價 按“2.2.2”項下方法制備15 批基準樣品供試品溶液,按“2.2.1”項下色譜條件進樣,將15 批基準樣品色譜圖導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012 版),以S1 為參照圖譜,采用中位數(shù)法,時間窗設為0.1 min,指紋圖譜疊加圖見圖1。

    圖1 15 批陽和湯基準樣品的HPLC 指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints of 15 batches of benchmark samples of Yanghe Decoction

    15 批陽和湯基準樣品(S1~S15)指紋圖譜相似度分別為0.860、0.917、0.918、0.929、0.838、0.855、0.958、0.983、0.908、0.971、0.946、0.926、0.912、0.905、0.879,除S1、S5、S6、S15 相似度<0.90,其余均在0.90 以上。其中S1、S5、S6、S15 相似度較低,結合指紋圖譜發(fā)現(xiàn)5-羥甲基糠醛峰面積偏高(S1、S5)或偏低(S6、S15),本課題組前期研究[13]已表明,熟地黃飲片中5-羥甲基糠醛含量的波動能夠直接影響陽和湯基準樣品指紋圖譜相似度評價。共標定了13 個共有峰,通過與對照品比對,指認了其中8 個共有峰,分別為2 號峰5-羥甲基糠醛、4 號峰芥子堿硫氰酸鹽、7 號峰甘草苷、8 號峰毛蕊花糖苷、10 號峰肉桂酸、11 號峰桂皮醛、12 號峰甘草酸、13 號峰鹽酸麻黃堿,陽和湯基準樣品指紋圖譜共有模式及混合對照品見圖2、3。以11 號峰為參照,計算15 批陽和湯基準樣品中共有峰的相對峰面積及相對保留時間,結果見表3、4。其中2 號峰相對峰面積的比值波動范圍明顯高于其他特征峰,15 批陽和湯基準樣品的相對保留時間則較為穩(wěn)定。

    表3 15 批陽和湯基準樣品共有峰相對峰面積比值分析Table 3 Analysis on ratio of common peaks relative to peak area of 15 batches of Yanghe Decoction benchmark samples

    圖2 15 批陽和湯基準樣品的HPLC 指紋圖譜共有模式Fig.2 HPLC fingerprints common mode of 15 batches of benchmark samples of Yanghe Decoction

    圖3 混合對照品的HPLC 圖Fig.3 HPLC of mixed reference substances

    表4 15 批陽和湯基準樣品共有峰相對保留時間比值分析Table 4 Ratio analysis of relative retention time ratio of common peaks of 15 batches of Yanghe Decoction benchmark samples

    2.2.7 飲片-基準樣品指紋圖譜量值傳遞關系研究熟地黃、肉桂、炒白芥子、麻黃、姜炭、甘草單味飲片及缺單味飲片陰性樣品的指紋圖譜見圖4,其中2、8 號峰歸屬于熟地黃;10、11 號峰歸屬于肉桂;1、3~6 號峰歸屬于炒白芥子;13 號峰歸屬于麻黃;7、9、12 號峰歸屬于甘草。將15 批基準樣品生成的對照圖譜與單味飲片的對照圖譜進行比對,發(fā)現(xiàn)單味藥的特征峰均可傳遞到基準樣品的對照圖譜中,結果見圖5,表明飲片-基準樣品指紋圖譜的傳遞在特征峰個數(shù)方面是穩(wěn)定的。并以每味藥中的一個特征峰為參照峰,計算相對峰面積,比較基準樣品和各單味飲片中特征峰峰面積的比值,結果見表5,大部分特征峰的比值在飲片與基準樣品間變化較小,歸屬關系清晰,飲片中的物質(zhì)群能較為穩(wěn)定地傳遞到基準樣品中。個別特征峰的比值存在明顯差異,如2、7、11、12 號峰面積有所降低,推測可能與復方中的多成分間相互作用有關,其中2 號峰(5-羥甲基糠醛)和11 號峰(桂皮醛)均屬于熱不穩(wěn)定性成分,在基準樣品制備過程中易損失,導致峰面積下降。

    圖4 陽和湯基準樣品的特征峰歸屬Fig.4 Attribution of characteristic peaks in benchmark sample of Yanghe Decoction

    圖5 各單味飲片對照圖譜與基準樣品對照圖譜對比Fig.5 Comparison of reference spectrum of each medicinal decoction piece with that of benchmark sample

    2.3 鹿角膠對陽和湯基準樣品指紋圖譜及指標性成分的影響

    鹿角膠全方劑量11.2 g,作為膠類中藥,以烊化的方式加入,本課題組在前期實驗中已經(jīng)考察了鹿角膠加入前后對基準樣品指紋圖譜的影響,結果表明鹿角膠烊化后加入與否,對基準樣品指紋圖譜相似度無影響,各峰面積變化無統(tǒng)計學差異。但為保證后續(xù)復方制劑的質(zhì)量研究,本實驗擬通過在基準樣品凍干粉中加入鹿角膠以考察其對基準樣品指紋圖譜及指標性成分的影響,為復方制劑的研究提供參考。

    2.3.1 鹿角膠的加入方式 將鹿角膠粉碎過3 號篩,折算鹿角膠在基準樣品凍干粉中的生藥量,取“2.1”項下制得的陽和湯基準樣品凍干粉適量,加入鹿角膠粉末,其余操作與“2.2.2”項下供試品溶液的制備方法一致。

    2.3.2 結果分析 采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012 版)評價陽和湯基準樣品指紋圖譜相似度,結果表明加入鹿角膠和不加鹿角膠所制得的供試品溶液的指紋圖譜相似度均為1.00,對基準樣品指紋圖譜無影響;對比指紋圖譜中各指標性成分的含量,結果見表6,其對5-羥甲基糠醛、桂皮醛、肉桂酸、芥子堿硫氰酸鹽及甘草酸含量的影響均無統(tǒng)計學差異。

    表6 鹿角膠對基準樣品指紋圖譜中指標性成分含量的影響 (n=2)Table 6 Effect of Cervi Cornus Colla on the content of index components in benchmark sample fingerprint (n=2)

    2.4 陽和湯基準樣品多成分含量測定

    本實驗以5-羥甲基糠醛、桂皮醛、肉桂酸、芥子堿硫氰酸鹽、甘草酸為指標性成分,建立了陽和湯基準樣品的含量測定方法。

    2.4.1 色譜條件 與“2.2.1”項下色譜條件一致。

    2.4.2 對照品溶液的制備 取5-羥甲基糠醛、桂皮醛、肉桂酸、芥子堿硫氰酸鹽、甘草酸對照品適量,精密稱定,加50%甲醇制成質(zhì)量濃度分別為17.90、22.64、13.47、19.88、14.60 μg/mL 的混合對照品溶液,備用。

    2.4.3 供試品溶液的制備 與“2.2.2”項下供試品溶液的制備方法一致。

    2.4.4 線性關系考察 取不同質(zhì)量濃度的混合對照品溶液,按“2.4.1”項下色譜條件進樣,以進樣質(zhì)量為橫坐標(X),峰面積為縱坐標(Y),繪制標準曲線并計算回歸方程,結果分別為5-羥甲基糠醛Y=37.391X-0.134 8,R2=0.999 7,線性范圍0.052~0.654 μg 和Y=37.237X+0.035 4,R2=0.999 9,線性范圍0.523~3.401 μg(陽和湯基準樣品中5-羥甲基糠醛含量波動較大,故建立2 段標準曲線);桂皮醛Y=52.831X+0.019 5,R2=1.000 0,線性范圍0.034~0.480 μg;肉桂酸Y=147.68X-0.007 2,R2=1.000 0,線性范圍0.004~0.023 μg;芥子堿硫氰酸鹽Y=8.608 9X+0.006 3,R2=1.000 0,線性范圍0.095~1.327 μg;甘草酸Y=8.624 3X+0.001 8,R2=1.000 0,線性范圍0.096~1.344 μg。

    2.4.5 精密度考察 取陽和湯基準樣品(S1)供試品溶液1 份,按“2.4.1”項下色譜條件,連續(xù)進樣6 次,計算各指標性成分峰面積的RSD 值,結果5-羥甲基糠醛、桂皮醛、肉桂酸、芥子堿硫氰酸鹽、甘草酸峰面積的RSD 分別為2.02%、0.48%、0.30%、0.77%、1.76%,表明儀器精密度良好。

    2.4.6 重復性考察 取陽和湯基準樣品(S1),按“2.4.3”項下方法平行制備供試品溶液6 份,按“2.4.1”項下色譜條件進樣,計算各指標性成分峰面積的RSD 值,結果5-羥甲基糠醛、桂皮醛、肉桂酸、芥子堿硫氰酸鹽、甘草酸質(zhì)量分數(shù)的RSD 分別為1.16%、0.30%、1.18%、2.66%、2.30%,表明該方法重復性良好。

    2.4.7 穩(wěn)定性考察 取陽和湯基準樣品(S1)供試品溶液1 份,按“2.4.1”項下色譜條件分別在制備后0、2、4、6、8、10、12、24 h 進樣,計算各指標性成分峰面積的RSD 值,結果5-羥甲基糠醛、桂皮醛、肉桂酸、芥子堿硫氰酸鹽、甘草酸峰面積的RSD分別為2.14%、0.41%、1.84%、0.71%、1.73%,表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

    2.4.8 加樣回收率考察 精密稱定已測知指標性成分含量的陽和湯基準樣品凍干粉適量,共6 份,分別加入一定量的對照品溶液,按“2.4.3”項下方法制備供試品溶液,按“2.4.1”項下色譜條件分別進樣,進行含量測定,計算5 種指標性成分的加樣回收率及RSD 值,結果5-羥甲基糠醛、桂皮醛、肉桂酸、芥子堿硫氰酸鹽、甘草酸的平均加樣回收率分別為105.35%、98.83%、105.52%、105.26%、93.10%,RSD 分別為0.82%、3.03%、1.81%、0.55%、1.67%,表明該方法加樣回收率良好。

    2.4.9 含量測定 按“2.4.3”項下方法制備15 批基準樣品供試品溶液,并按“2.4.1”項下色譜條件進樣,對15 批基準樣品進行含量測定,結果見表7。15 批基準樣品中各成分質(zhì)量分數(shù)為5-羥甲基糠醛0.028%~0.508%、桂皮醛0.076%~0.244%、肉桂酸0.006%~0.018%、芥子堿硫氰酸鹽 0.430%~0.677%、甘草酸0.100%~0.335%。根據(jù)《征求意見稿》中含量測定的波動范圍一般不超過均值的±30%,因此,暫定基準樣品中各成分的含量范圍為5-羥甲基糠醛0.113%~0.209%、桂皮醛0.114%~0.212%、肉桂酸0.007%~0.013%、芥子堿硫氰酸鹽0.372%~0.691%、甘草酸0.135%~0.251%。

    表7 15 批陽和湯基準樣品含量測定Table 7 Content determination of 15 batches of Yanghe Decoction benchmark samples

    2.4.10 量值傳遞研究 15 批基準樣品和對應飲片中指標性成分含量測定結果及轉(zhuǎn)移率見表8。15 批基準樣品中各成分平均轉(zhuǎn)移率為5-羥甲基糠醛5.35%、桂皮醛5.33%、肉桂酸19.21%、芥子堿硫氰酸鹽51.18%、甘草酸10.23%。根據(jù)《征求意見稿》中相關內(nèi)容,飲片-基準樣品的指標性成分轉(zhuǎn)移率也應在其均值的±30%范圍內(nèi),在本實驗中桂皮醛、肉桂酸、芥子堿硫氰酸鹽和甘草酸4 個成分的轉(zhuǎn)移率大部分都在其均值的±30%范圍內(nèi),說明前期肉桂、炒白芥子、甘草飲片和基準樣品的制備工藝相對穩(wěn)定可行。但部分批次5-羥甲基糠醛轉(zhuǎn)移率超出了其均值的±30%范圍,根據(jù)熟地黃飲片性狀、含量測定結果發(fā)現(xiàn),河南省焦作市武陟縣和溫縣兩個產(chǎn)地的飲片質(zhì)地柔韌、表面黏膩、含量高;河南省駐馬店市泌陽縣產(chǎn)地的飲片質(zhì)地較硬、表面無黏膩感、含量偏低。此外5-羥甲基糠醛易受溫度、時間等影響[14],而基準樣品的制備工藝是加水共高溫煎煮1 h,因此,在基準樣品中含量波動較大,若取其均值的±30%,存在的誤差相對較大。且熟地黃不同批次不同產(chǎn)地間含量差異較大,甚至同一產(chǎn)地不同采購地點含量差異也較大[15-16]。因此,在制備基準樣品時,要嚴格把控飲片的質(zhì)量,保證飲片質(zhì)量屬性穩(wěn)定均一。

    表8 陽和湯基準樣品指標性成分含量測定及轉(zhuǎn)移率Table 8 Content and transfer rate of index components in Yanghe Decoction benchmark sample

    2.5 出膏率及其傳遞關系

    分別取“2.1”項下全方及各單味飲片煎液,水浴濃縮至稠膏,60 ℃真空干燥,測得全方基準樣品實際出膏率和單味飲片出膏率。按公式(理論出膏率=∑單味飲片出膏率×單味飲片質(zhì)量/全方飲片總質(zhì)量)計算基準樣品理論出膏率,結果見表9。15批基準樣品出膏率為27.38%~40.73%,9 批基準樣品出膏率在其均值的±10%范圍內(nèi),其中S5、S14出膏率高于均值的±10%范圍。

    表9 陽和湯基準樣品出膏率Table 9 Extract rate of benchmark sample of Yanghe Decoction

    熟地黃作為組方君藥,用藥劑量占全方2/3,溯源發(fā)現(xiàn)基準樣品對應批次熟地黃飲片20210314(S5)、20210315(S14)出膏率均顯著高于15 批熟地黃飲片出膏率均值,而其他單味飲片出膏率均接近于各自均值,說明熟地黃飲片出膏率對基準樣品出膏率的影響較大,導致S5、S14 出膏率高于均值的±10%范圍。S4、S6、S9、S10 出膏率雖不在均值的±10%范圍內(nèi),但也略接近于臨界值,因此,可將其納入范圍,基準樣品出膏率控制在27.38%~34.44%。

    3 討論

    3.1 鹿角膠對基準樣品的影響

    本課題組在前期研究中已經(jīng)明確了鹿角膠烊化后加入與否對基準樣品并無影響,建立的色譜檢測條件和供試品溶液的制備方法既能全面反映全方色譜信息,又能穩(wěn)定考察其質(zhì)量。本實驗在前期研究基礎上又考察了鹿角膠對基準樣品凍干粉的影響,結果表明其對基準樣品指紋圖譜相似度及指標性成分峰面積均未造成干擾,可為后期復方制劑的研制提供實驗依據(jù)。

    3.2 流動相、檢測波長、柱溫的考察

    本實驗分別考察了在乙腈-水、甲醇-水、甲醇-0.05%磷酸水溶液(含0.05%三乙胺)以及乙腈-0.05%磷酸水溶液(0.05%三乙胺)4 種不同的流動相體系和比例下色譜峰的分離情況,結果顯示,乙腈-0.05%磷酸水溶液(0.05%三乙胺)為流動相時,基線平穩(wěn)、色譜峰分離良好;分別考察不同波長,全波長掃描結果表明在260 nm 時各成分色譜行為良好,在210 nm 時鹽酸麻黃堿色譜峰響應較好,雜質(zhì)干擾小;另外,考察了柱溫對色譜峰分離度的影響,結果發(fā)現(xiàn),在35 ℃條件下,各色譜峰的分離度較好。

    3.3 指標性成分選擇分析

    經(jīng)典名方基準樣品作為后續(xù)復方制劑研究及質(zhì)量控制的參照,指標性成分的選擇在基準樣品質(zhì)量控制中具有重要意義。熟地黃、鹿角膠為君藥,具有養(yǎng)血滋陰、填精益髓的功效。肉桂、姜炭為臣藥,肉桂大辛大熱,既能溫陽還能行血通脈,姜炭既能溫陽又可通利血脈。白芥子、麻黃為佐藥,白芥子性溫味辛,除皮里膜外之痰,麻黃宣肺解表。甘草為使藥,解毒并調(diào)和諸藥。諸藥合用,溫陽補血、寒散痰消。在熟地黃中,5-羥甲基糠醛是快速區(qū)分生、熟地黃的潛在質(zhì)量標志物,結合補血止血的藥理作用,能被選擇為指標性成分之一[17-18]。肉桂中主要含有桂皮醛、肉桂酸等成分發(fā)揮解熱、鎮(zhèn)痛、抑菌、抗病毒作用[19]。炒白芥子中芥子堿硫氰酸鹽具有鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘,抗炎鎮(zhèn)痛等作用[20]。甘草調(diào)和諸藥,含量較高的活性化合物甘草苷、甘草酸銨能抑制炎癥因子的釋放,產(chǎn)生抗炎作用[21]。而基準樣品中甘草苷相對甘草酸含量較低,因此,可僅選擇甘草酸作為含量測定中表征甘草藥材的指標性成分。

    3.4 基準樣品指紋圖譜分析

    15 批基準樣品歸屬了13 個共有峰,分別來自熟地黃、肉桂、炒白芥子、麻黃、甘草。但本實驗尚存在不足之處,方中熟地黃、鹿角膠、麻黃、姜炭未指認出《中國藥典》2020 年版單味藥項下規(guī)定的指標性成分,其中地黃苷D 和鹽酸偽麻黃堿在全波長掃描后,兩者最佳吸收波長一致(210 nm),重新建立色譜條件后,2 種成分仍互相存在干擾且均屬于末端吸收,未能分離檢測;鹿角膠中主要成分為氨基酸,屬于大極性分子,表征難度大,不具備HPLC-UV 檢測的結構特點;6-姜辣素未能在基準樣品指紋圖譜中檢識出,但其對照品在“2.2.1”項下色譜條件可出峰,分析原因可能是干姜在炒炭高溫過程中姜酚類化合物作為揮發(fā)性成分極其不穩(wěn)定,導致姜酚類物質(zhì)逐漸降低[22]。對于上述不足之處,本課題組今后將進一步深入研究,力求各藥味均有《中國藥典》2020 年版單味藥項下的質(zhì)控成分。

    3.5 基準樣品量值傳遞研究

    15 批基準樣品中5-羥甲基糠醛、桂皮醛和甘草酸的轉(zhuǎn)移率較低,而肉桂酸、芥子堿硫氰酸鹽的轉(zhuǎn)移率相對較高,5 種成分轉(zhuǎn)移率的高低反映了不同藥味成分間相互作用導致溶解性發(fā)生變化[23]。5-羥甲基糠醛、桂皮醛在飲片中含量較高,轉(zhuǎn)移率卻較低,原因在于在熟地黃飲片的含量測定中提取對象為過2 號篩的粉末,而在基準樣品含量測定中首先是以飲片的形式經(jīng)過合煎而成水煎液制成凍干粉,再以50%甲醇復溶,相較于粉末提取效率不高,導致轉(zhuǎn)移率較低。其次,本課題組在研究熟地黃飲片質(zhì)量時發(fā)現(xiàn),同一產(chǎn)地同一批次間5-羥甲基糠醛含量忽高忽低,導致在制備基準樣品后,計算其含量和轉(zhuǎn)移率均值的±30%就會出現(xiàn)相對更大的誤差,因此是否可考慮對含量高低不同的成分進行具體分析,而不是都把范圍限定在其均值的±30%,以減少誤差;桂皮醛為揮發(fā)油類成分,在煎煮過程中易受熱揮發(fā),因此轉(zhuǎn)移率更低;甘草不同組織成分存在差異,根木質(zhì)部的甘草酸含量普遍低于根皮部[24],加之飲片投料量少,含量分布不均,經(jīng)過煎煮等處理過程含量損失較大。同批甘草用于制備多批基準樣品,尚且出現(xiàn)離散值,若增加不同的甘草批次進行投料,差異可能更為明顯。建議將甘草飲片大小及部位嚴格分等、取樣均勻或采取不同批次飲片混批投料方式,以確?;鶞蕵悠焚|(zhì)量穩(wěn)定[25]。

    4 結論

    陽和湯組方嚴謹、用藥精煉,具有溫陽補血、散寒通滯之功效,是治療陰疽的經(jīng)典方,世有“陰疽活命丹”之稱。為保證經(jīng)典名方制劑質(zhì)量療效一致,需建立從藥材到飲片、中間體、制劑全過程的質(zhì)量控制體系,基準樣品作為其中的關鍵點,其質(zhì)量穩(wěn)定的前提是處方所用藥材及飲片的質(zhì)量均一、穩(wěn)定[26]。

    本實驗采用指紋圖譜、指標性成分含量測定及出膏率相結合的模式,對經(jīng)典名方陽和湯基準樣品的量值傳遞過程進行研究分析,初步建立了科學穩(wěn)定的基準樣品質(zhì)量評價方法,以期為經(jīng)典名方陽和湯的后續(xù)開發(fā)及相關制劑的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

    利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

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