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    經(jīng)典名方陽(yáng)和湯基準(zhǔn)樣品量值傳遞分析

    2023-02-08 03:20:38張澤康王昌海趙玥瑛張馨雨杜守穎
    中草藥 2023年3期

    張澤康,王昌海,趙玥瑛,張 晴,席 鋮,張馨雨,孫 萌,董 爽,杜守穎,白 潔,陸 洋

    北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,北京 102488

    陽(yáng)和湯出自清代王洪緒所著《外科證治全生集》,全方由熟地黃、鹿角膠、肉桂、炒白芥子、麻黃、姜炭、甘草7 味藥組成。具有溫陽(yáng)補(bǔ)血、散寒通滯的功效,主治陰疽。在現(xiàn)代臨床中,陽(yáng)和湯及其加減方廣泛用于治療外科(乳腺癌等惡性腫瘤)、內(nèi)科(哮喘、消化性潰瘍、心血管系統(tǒng)疾病等)、婦科(多囊卵巢綜合征、外陰濕疣、乳腺結(jié)節(jié)、痛經(jīng)等)、骨科(膝關(guān)節(jié)炎、股骨頭壞死等)、兒科(流行性腮腺炎等)、皮膚科(痤瘡、皮脂腺囊腫、蕁麻疹等)、男科(腎陽(yáng)虛損、精血不足、陰寒痰濕而致的各種男科病證等)等各類(lèi)疾病[1-6],療效顯著,開(kāi)發(fā)前景良好?!吨兴幾?cè)分類(lèi)及申報(bào)資料要求》[7]明確提出,為加強(qiáng)對(duì)古典醫(yī)籍精華的梳理和挖掘,將中藥注冊(cè)分類(lèi)中的第3 類(lèi)古代經(jīng)典名方中藥復(fù)方制劑細(xì)分為“3.1 按古代經(jīng)典名方目錄管理的中藥復(fù)方制劑”及“3.2 其他來(lái)源于古代經(jīng)典名方的中藥復(fù)方制劑”(以下簡(jiǎn)稱(chēng)3.2 類(lèi))。其中3.2 類(lèi)包括未按古代經(jīng)典名方目錄管理的古代經(jīng)典名方中藥復(fù)方制劑和基于古代經(jīng)典名方加減化裁的中藥復(fù)方制劑,對(duì)陽(yáng)和湯進(jìn)行經(jīng)典名方的開(kāi)發(fā)研究意義重大。

    目前,陽(yáng)和湯的相關(guān)文獻(xiàn)多集中在藥理作用及臨床應(yīng)用等方面,關(guān)于其基準(zhǔn)樣品量值傳遞的研究尚未見(jiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)參考《古代經(jīng)典名方中藥復(fù)方制劑及其物質(zhì)基準(zhǔn)的申報(bào)資料要求(征求意見(jiàn)稿)》[8](以下簡(jiǎn)稱(chēng)《征求意見(jiàn)稿》)相關(guān)內(nèi)容,通過(guò)制備15 批陽(yáng)和湯基準(zhǔn)樣品,建立其指紋圖譜,進(jìn)行相似度及特征峰歸屬分析,并結(jié)合指標(biāo)性成分含量、轉(zhuǎn)移率以及出膏率,進(jìn)行飲片到基準(zhǔn)樣品的量值傳遞分析及整體質(zhì)量研究,為后續(xù)復(fù)方制劑的開(kāi)發(fā)提供理論支撐。

    1 儀器與材料

    1.1 儀器

    JM-B100002 型1/10 萬(wàn)電子天平,余姚市紀(jì)銘稱(chēng)重校驗(yàn)設(shè)備有限公司;BSA 224S 型1/1 萬(wàn)電子分析天平,賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;陶瓷鍋(體積1 L,長(zhǎng)12 cm×寬12 cm×高10 cm,材質(zhì)為高嶺土/鋰輝石),九龍家居陶瓷館;SHB-III型循環(huán)水式多用真空泵,鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;H22-X3 型九陽(yáng)電陶爐,杭州九陽(yáng)生活電器有限公司;FD-2A 型真空冷凍干燥機(jī),北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;UltiMate 3000 型高效液相色譜儀,賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司,包含二極管陣列檢測(cè)器(DAD)和Chromeleon 7.2 色譜工作站。

    1.2 材料

    地黃、肉桂、芥子、麻黃、干姜和甘草藥材經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)劉春生教授鑒定,分別為玄參科地黃屬植物地黃Rehmannia glutinosaLibosch.的新鮮或干燥塊根、樟科樟屬植物肉桂Cinnamomum cassiaPresl 的干燥樹(shù)皮、十字花科白芥屬植物白芥Sinapis albaL.的干燥成熟種子、麻黃科麻黃屬植物草麻黃Ephedra sinicaStapf 的干燥草質(zhì)莖、姜科姜屬植物姜Zingiber officinaleRosc.的干燥根莖、豆科甘草屬植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的干燥根和根莖。本課題組依照《中國(guó)藥典》2020 年版各藥材項(xiàng)下飲片炮制要求,分別制成肉桂、炒白芥子、麻黃、姜炭及甘草飲片(熟地黃、鹿角膠飲片由健民藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司提供),單味藥材、飲片質(zhì)量經(jīng)本課題組前期檢測(cè)均符合要求,藥材產(chǎn)地信息見(jiàn)表1。

    表1 陽(yáng)和湯組方藥材來(lái)源信息Table 1 Source information of Yanghe Decoction prescription medicinal materials

    對(duì)照品毛蕊花糖苷(批號(hào)111530-201914,質(zhì)量分?jǐn)?shù)95.2%)、桂皮醛(批號(hào)110710-202022,質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.7%)、肉桂酸(批號(hào)110786-201604,質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.8%)、芥子堿硫氰酸鹽(批號(hào)111702-202006,質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.0%)、鹽酸麻黃堿(批號(hào)171241-201809,質(zhì)量分?jǐn)?shù)100.0%)、鹽酸偽麻黃堿(批號(hào)171237-201510,質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.8%)、6-姜辣素(批號(hào)111833-202007,質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.3%)、甘草苷(批號(hào)111610-201908,質(zhì)量分?jǐn)?shù)95.0%)、甘草酸銨(批號(hào)110731-202021,質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.2%),均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;對(duì)照品地黃苷D(CAS 號(hào)81702-08-3,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.0%)、5-羥甲基糠醛(CAS 號(hào)67-47-0,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.0%),均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。乙腈、磷酸,色譜純,F(xiàn)isher 公司;甲醇、三乙胺,分析純,北京化工廠;娃哈哈純凈水,杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司;其他試劑為分析純。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 15 批陽(yáng)和湯基準(zhǔn)樣品的制備

    《外科證治全生集》記載陽(yáng)和湯原方為“熟地一兩,鹿角膠三錢(qián),肉桂一錢(qián),白芥子二錢(qián),麻黃五分,姜炭五分,生甘草一錢(qián),治療貼骨疽,鶴膝風(fēng)等陰疽,如治乳癖和乳巖,加土貝五錢(qián)。”參照《中醫(yī)名詞術(shù)語(yǔ)選釋》[9]和《古今中藥超大劑量應(yīng)用集萃》[10]等文獻(xiàn)中的古今中藥劑量換算表記載,折算陽(yáng)和湯全方現(xiàn)代臨床用藥劑量。根據(jù)《古代經(jīng)典名方中藥復(fù)方制劑簡(jiǎn)化注冊(cè)審批管理規(guī)定》中的相關(guān)要求[11],經(jīng)典名方的制備方法要與古代醫(yī)籍中記載的一致。查閱始載陽(yáng)和湯的古籍《外科證治全生集》及不同時(shí)代記載陽(yáng)和湯的書(shū)籍及相關(guān)文獻(xiàn),均未記錄其具體的煎煮方法。因此,陽(yáng)和湯基準(zhǔn)樣品的煎煮方式參照《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》2009年版的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行[12]。最終確定處方劑量為分別稱(chēng)取熟地黃飲片37.3 g、肉桂飲片3.7 g、炒白芥子飲片7.5 g、麻黃飲片1.9 g、姜炭飲片1.9 g、甘草飲片3.7 g,加水450 mL,武火(電陶爐火鍋檔600 W)加熱煮沸后,文火(電陶爐火鍋檔200 W)煎煮30 min,放置待煎液降至50 ℃左右,300 目無(wú)紡布濾過(guò),藥渣再加水336 mL,同法煎煮30 min,300目無(wú)紡布濾過(guò),合并2 次濾液,放涼后加水調(diào)整體積至600 mL,精密移取煎液5 mL 于25 mL 西林瓶中,置于-80 ℃預(yù)冷2 h 的冷凍干燥機(jī),凍干溫度-80 ℃,真空度(5±1)Pa,冷凍干燥48 h,取出壓蓋密塞,即得陽(yáng)和湯基準(zhǔn)樣品凍干粉。鹿角膠的加入方式另行考察。

    同法制備單味飲片及缺單味飲片陰性樣品。

    將熟地黃、肉桂、炒白芥子、麻黃、姜炭、甘草各15 批飲片采用隨機(jī)數(shù)表法隨機(jī)組合形成15 批陽(yáng)和湯基準(zhǔn)樣品[本課題組前期對(duì)15 批干姜、甘草藥材進(jìn)行檢測(cè),質(zhì)量均符合要求。依照《中國(guó)藥典》2020 年版各藥材項(xiàng)下飲片炮制要求炮制為對(duì)應(yīng)飲片,經(jīng)檢測(cè)13 批姜炭飲片、10 批甘草飲片質(zhì)量符合要求,故隨機(jī)選定2 批姜炭飲片(批號(hào)20210706、20210711)、5 批甘草飲片(批號(hào)20210801~20210804、20210806)重復(fù)使用,組合成15 批陽(yáng)和湯基準(zhǔn)樣品],編號(hào)為S1~S15,具體組合信息見(jiàn)表2。

    表2 15 批陽(yáng)和湯基準(zhǔn)樣品隨機(jī)組合信息Table 2 Random combination information of 15 batches of Yanghe Decoction benchmark samples

    2.2 陽(yáng)和湯基準(zhǔn)樣品指紋圖譜的建立

    2.2.1 色譜條件 Zorbax SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相乙腈-0.05%磷酸水溶液(含0.05%三乙胺溶液),梯度洗脫:0~5 min,2%~3%乙腈;5~15 min,3%~5%乙腈;15~65 min,5%~30%乙腈;65~90 min,30%~70%乙腈;體積流量1 mL/min;柱溫35 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)210、260 nm;進(jìn)樣量10 μL。

    2.2.2 供試品溶液的制備 取陽(yáng)和湯基準(zhǔn)樣品凍干粉0.15 g,精密稱(chēng)定,加入10 mL 50%甲醇中,溶解,搖勻,室溫放置10 min,于10 000 r/min 離心(離心半徑5.79 cm)5 min,取上清液過(guò)0.22 μm 微孔濾膜,即得供試品溶液。

    2.2.3 精密度試驗(yàn) 取編號(hào)為S1 的陽(yáng)和湯基準(zhǔn)樣品1 份,按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次,以11 號(hào)峰(桂皮醛)為參照(參照峰選擇依據(jù):以峰形對(duì)稱(chēng),分離度優(yōu),無(wú)拖尾現(xiàn)象,且峰面積穩(wěn)定為選擇依據(jù),選定桂皮醛作為參照峰),計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD 均<0.20%,相對(duì)峰面積的RSD 均<2.58%,表明儀器精密度良好。

    2.2.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取編號(hào)為S1 的陽(yáng)和湯基準(zhǔn)樣品1 份,按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液,按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,以11 號(hào)峰(桂皮醛)為參照,計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD 均<0.98%,相對(duì)峰面積的RSD 均<1.44%,表明該方法重復(fù)性良好。

    2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取編號(hào)為S1 的陽(yáng)和湯基準(zhǔn)樣品1 份,按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件分別在制備后0、2、4、6、8、10、12、24 h 進(jìn)樣,以11 號(hào)峰(桂皮醛)為參照,計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD 均<0.72%,相對(duì)峰面積的RSD 均<3.06%,表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

    2.2.6 指紋圖譜建立及相似度評(píng)價(jià) 按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備15 批基準(zhǔn)樣品供試品溶液,按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,將15 批基準(zhǔn)樣品色譜圖導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012 版),以S1 為參照?qǐng)D譜,采用中位數(shù)法,時(shí)間窗設(shè)為0.1 min,指紋圖譜疊加圖見(jiàn)圖1。

    圖1 15 批陽(yáng)和湯基準(zhǔn)樣品的HPLC 指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints of 15 batches of benchmark samples of Yanghe Decoction

    15 批陽(yáng)和湯基準(zhǔn)樣品(S1~S15)指紋圖譜相似度分別為0.860、0.917、0.918、0.929、0.838、0.855、0.958、0.983、0.908、0.971、0.946、0.926、0.912、0.905、0.879,除S1、S5、S6、S15 相似度<0.90,其余均在0.90 以上。其中S1、S5、S6、S15 相似度較低,結(jié)合指紋圖譜發(fā)現(xiàn)5-羥甲基糠醛峰面積偏高(S1、S5)或偏低(S6、S15),本課題組前期研究[13]已表明,熟地黃飲片中5-羥甲基糠醛含量的波動(dòng)能夠直接影響陽(yáng)和湯基準(zhǔn)樣品指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)。共標(biāo)定了13 個(gè)共有峰,通過(guò)與對(duì)照品比對(duì),指認(rèn)了其中8 個(gè)共有峰,分別為2 號(hào)峰5-羥甲基糠醛、4 號(hào)峰芥子堿硫氰酸鹽、7 號(hào)峰甘草苷、8 號(hào)峰毛蕊花糖苷、10 號(hào)峰肉桂酸、11 號(hào)峰桂皮醛、12 號(hào)峰甘草酸、13 號(hào)峰鹽酸麻黃堿,陽(yáng)和湯基準(zhǔn)樣品指紋圖譜共有模式及混合對(duì)照品見(jiàn)圖2、3。以11 號(hào)峰為參照,計(jì)算15 批陽(yáng)和湯基準(zhǔn)樣品中共有峰的相對(duì)峰面積及相對(duì)保留時(shí)間,結(jié)果見(jiàn)表3、4。其中2 號(hào)峰相對(duì)峰面積的比值波動(dòng)范圍明顯高于其他特征峰,15 批陽(yáng)和湯基準(zhǔn)樣品的相對(duì)保留時(shí)間則較為穩(wěn)定。

    表3 15 批陽(yáng)和湯基準(zhǔn)樣品共有峰相對(duì)峰面積比值分析Table 3 Analysis on ratio of common peaks relative to peak area of 15 batches of Yanghe Decoction benchmark samples

    圖2 15 批陽(yáng)和湯基準(zhǔn)樣品的HPLC 指紋圖譜共有模式Fig.2 HPLC fingerprints common mode of 15 batches of benchmark samples of Yanghe Decoction

    圖3 混合對(duì)照品的HPLC 圖Fig.3 HPLC of mixed reference substances

    表4 15 批陽(yáng)和湯基準(zhǔn)樣品共有峰相對(duì)保留時(shí)間比值分析Table 4 Ratio analysis of relative retention time ratio of common peaks of 15 batches of Yanghe Decoction benchmark samples

    2.2.7 飲片-基準(zhǔn)樣品指紋圖譜量值傳遞關(guān)系研究熟地黃、肉桂、炒白芥子、麻黃、姜炭、甘草單味飲片及缺單味飲片陰性樣品的指紋圖譜見(jiàn)圖4,其中2、8 號(hào)峰歸屬于熟地黃;10、11 號(hào)峰歸屬于肉桂;1、3~6 號(hào)峰歸屬于炒白芥子;13 號(hào)峰歸屬于麻黃;7、9、12 號(hào)峰歸屬于甘草。將15 批基準(zhǔn)樣品生成的對(duì)照?qǐng)D譜與單味飲片的對(duì)照?qǐng)D譜進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)單味藥的特征峰均可傳遞到基準(zhǔn)樣品的對(duì)照?qǐng)D譜中,結(jié)果見(jiàn)圖5,表明飲片-基準(zhǔn)樣品指紋圖譜的傳遞在特征峰個(gè)數(shù)方面是穩(wěn)定的。并以每味藥中的一個(gè)特征峰為參照峰,計(jì)算相對(duì)峰面積,比較基準(zhǔn)樣品和各單味飲片中特征峰峰面積的比值,結(jié)果見(jiàn)表5,大部分特征峰的比值在飲片與基準(zhǔn)樣品間變化較小,歸屬關(guān)系清晰,飲片中的物質(zhì)群能較為穩(wěn)定地傳遞到基準(zhǔn)樣品中。個(gè)別特征峰的比值存在明顯差異,如2、7、11、12 號(hào)峰面積有所降低,推測(cè)可能與復(fù)方中的多成分間相互作用有關(guān),其中2 號(hào)峰(5-羥甲基糠醛)和11 號(hào)峰(桂皮醛)均屬于熱不穩(wěn)定性成分,在基準(zhǔn)樣品制備過(guò)程中易損失,導(dǎo)致峰面積下降。

    圖4 陽(yáng)和湯基準(zhǔn)樣品的特征峰歸屬Fig.4 Attribution of characteristic peaks in benchmark sample of Yanghe Decoction

    圖5 各單味飲片對(duì)照?qǐng)D譜與基準(zhǔn)樣品對(duì)照?qǐng)D譜對(duì)比Fig.5 Comparison of reference spectrum of each medicinal decoction piece with that of benchmark sample

    2.3 鹿角膠對(duì)陽(yáng)和湯基準(zhǔn)樣品指紋圖譜及指標(biāo)性成分的影響

    鹿角膠全方劑量11.2 g,作為膠類(lèi)中藥,以烊化的方式加入,本課題組在前期實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)考察了鹿角膠加入前后對(duì)基準(zhǔn)樣品指紋圖譜的影響,結(jié)果表明鹿角膠烊化后加入與否,對(duì)基準(zhǔn)樣品指紋圖譜相似度無(wú)影響,各峰面積變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。但為保證后續(xù)復(fù)方制劑的質(zhì)量研究,本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)在基準(zhǔn)樣品凍干粉中加入鹿角膠以考察其對(duì)基準(zhǔn)樣品指紋圖譜及指標(biāo)性成分的影響,為復(fù)方制劑的研究提供參考。

    2.3.1 鹿角膠的加入方式 將鹿角膠粉碎過(guò)3 號(hào)篩,折算鹿角膠在基準(zhǔn)樣品凍干粉中的生藥量,取“2.1”項(xiàng)下制得的陽(yáng)和湯基準(zhǔn)樣品凍干粉適量,加入鹿角膠粉末,其余操作與“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法一致。

    2.3.2 結(jié)果分析 采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012 版)評(píng)價(jià)陽(yáng)和湯基準(zhǔn)樣品指紋圖譜相似度,結(jié)果表明加入鹿角膠和不加鹿角膠所制得的供試品溶液的指紋圖譜相似度均為1.00,對(duì)基準(zhǔn)樣品指紋圖譜無(wú)影響;對(duì)比指紋圖譜中各指標(biāo)性成分的含量,結(jié)果見(jiàn)表6,其對(duì)5-羥甲基糠醛、桂皮醛、肉桂酸、芥子堿硫氰酸鹽及甘草酸含量的影響均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

    表6 鹿角膠對(duì)基準(zhǔn)樣品指紋圖譜中指標(biāo)性成分含量的影響 (n=2)Table 6 Effect of Cervi Cornus Colla on the content of index components in benchmark sample fingerprint (n=2)

    2.4 陽(yáng)和湯基準(zhǔn)樣品多成分含量測(cè)定

    本實(shí)驗(yàn)以5-羥甲基糠醛、桂皮醛、肉桂酸、芥子堿硫氰酸鹽、甘草酸為指標(biāo)性成分,建立了陽(yáng)和湯基準(zhǔn)樣品的含量測(cè)定方法。

    2.4.1 色譜條件 與“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件一致。

    2.4.2 對(duì)照品溶液的制備 取5-羥甲基糠醛、桂皮醛、肉桂酸、芥子堿硫氰酸鹽、甘草酸對(duì)照品適量,精密稱(chēng)定,加50%甲醇制成質(zhì)量濃度分別為17.90、22.64、13.47、19.88、14.60 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液,備用。

    2.4.3 供試品溶液的制備 與“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法一致。

    2.4.4 線性關(guān)系考察 取不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液,按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,以進(jìn)樣質(zhì)量為橫坐標(biāo)(X),峰面積為縱坐標(biāo)(Y),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算回歸方程,結(jié)果分別為5-羥甲基糠醛Y=37.391X-0.134 8,R2=0.999 7,線性范圍0.052~0.654 μg 和Y=37.237X+0.035 4,R2=0.999 9,線性范圍0.523~3.401 μg(陽(yáng)和湯基準(zhǔn)樣品中5-羥甲基糠醛含量波動(dòng)較大,故建立2 段標(biāo)準(zhǔn)曲線);桂皮醛Y=52.831X+0.019 5,R2=1.000 0,線性范圍0.034~0.480 μg;肉桂酸Y=147.68X-0.007 2,R2=1.000 0,線性范圍0.004~0.023 μg;芥子堿硫氰酸鹽Y=8.608 9X+0.006 3,R2=1.000 0,線性范圍0.095~1.327 μg;甘草酸Y=8.624 3X+0.001 8,R2=1.000 0,線性范圍0.096~1.344 μg。

    2.4.5 精密度考察 取陽(yáng)和湯基準(zhǔn)樣品(S1)供試品溶液1 份,按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件,連續(xù)進(jìn)樣6 次,計(jì)算各指標(biāo)性成分峰面積的RSD 值,結(jié)果5-羥甲基糠醛、桂皮醛、肉桂酸、芥子堿硫氰酸鹽、甘草酸峰面積的RSD 分別為2.02%、0.48%、0.30%、0.77%、1.76%,表明儀器精密度良好。

    2.4.6 重復(fù)性考察 取陽(yáng)和湯基準(zhǔn)樣品(S1),按“2.4.3”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6 份,按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,計(jì)算各指標(biāo)性成分峰面積的RSD 值,結(jié)果5-羥甲基糠醛、桂皮醛、肉桂酸、芥子堿硫氰酸鹽、甘草酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD 分別為1.16%、0.30%、1.18%、2.66%、2.30%,表明該方法重復(fù)性良好。

    2.4.7 穩(wěn)定性考察 取陽(yáng)和湯基準(zhǔn)樣品(S1)供試品溶液1 份,按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件分別在制備后0、2、4、6、8、10、12、24 h 進(jìn)樣,計(jì)算各指標(biāo)性成分峰面積的RSD 值,結(jié)果5-羥甲基糠醛、桂皮醛、肉桂酸、芥子堿硫氰酸鹽、甘草酸峰面積的RSD分別為2.14%、0.41%、1.84%、0.71%、1.73%,表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

    2.4.8 加樣回收率考察 精密稱(chēng)定已測(cè)知指標(biāo)性成分含量的陽(yáng)和湯基準(zhǔn)樣品凍干粉適量,共6 份,分別加入一定量的對(duì)照品溶液,按“2.4.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣,進(jìn)行含量測(cè)定,計(jì)算5 種指標(biāo)性成分的加樣回收率及RSD 值,結(jié)果5-羥甲基糠醛、桂皮醛、肉桂酸、芥子堿硫氰酸鹽、甘草酸的平均加樣回收率分別為105.35%、98.83%、105.52%、105.26%、93.10%,RSD 分別為0.82%、3.03%、1.81%、0.55%、1.67%,表明該方法加樣回收率良好。

    2.4.9 含量測(cè)定 按“2.4.3”項(xiàng)下方法制備15 批基準(zhǔn)樣品供試品溶液,并按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,對(duì)15 批基準(zhǔn)樣品進(jìn)行含量測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)表7。15 批基準(zhǔn)樣品中各成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5-羥甲基糠醛0.028%~0.508%、桂皮醛0.076%~0.244%、肉桂酸0.006%~0.018%、芥子堿硫氰酸鹽 0.430%~0.677%、甘草酸0.100%~0.335%。根據(jù)《征求意見(jiàn)稿》中含量測(cè)定的波動(dòng)范圍一般不超過(guò)均值的±30%,因此,暫定基準(zhǔn)樣品中各成分的含量范圍為5-羥甲基糠醛0.113%~0.209%、桂皮醛0.114%~0.212%、肉桂酸0.007%~0.013%、芥子堿硫氰酸鹽0.372%~0.691%、甘草酸0.135%~0.251%。

    表7 15 批陽(yáng)和湯基準(zhǔn)樣品含量測(cè)定Table 7 Content determination of 15 batches of Yanghe Decoction benchmark samples

    2.4.10 量值傳遞研究 15 批基準(zhǔn)樣品和對(duì)應(yīng)飲片中指標(biāo)性成分含量測(cè)定結(jié)果及轉(zhuǎn)移率見(jiàn)表8。15 批基準(zhǔn)樣品中各成分平均轉(zhuǎn)移率為5-羥甲基糠醛5.35%、桂皮醛5.33%、肉桂酸19.21%、芥子堿硫氰酸鹽51.18%、甘草酸10.23%。根據(jù)《征求意見(jiàn)稿》中相關(guān)內(nèi)容,飲片-基準(zhǔn)樣品的指標(biāo)性成分轉(zhuǎn)移率也應(yīng)在其均值的±30%范圍內(nèi),在本實(shí)驗(yàn)中桂皮醛、肉桂酸、芥子堿硫氰酸鹽和甘草酸4 個(gè)成分的轉(zhuǎn)移率大部分都在其均值的±30%范圍內(nèi),說(shuō)明前期肉桂、炒白芥子、甘草飲片和基準(zhǔn)樣品的制備工藝相對(duì)穩(wěn)定可行。但部分批次5-羥甲基糠醛轉(zhuǎn)移率超出了其均值的±30%范圍,根據(jù)熟地黃飲片性狀、含量測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn),河南省焦作市武陟縣和溫縣兩個(gè)產(chǎn)地的飲片質(zhì)地柔韌、表面黏膩、含量高;河南省駐馬店市泌陽(yáng)縣產(chǎn)地的飲片質(zhì)地較硬、表面無(wú)黏膩感、含量偏低。此外5-羥甲基糠醛易受溫度、時(shí)間等影響[14],而基準(zhǔn)樣品的制備工藝是加水共高溫煎煮1 h,因此,在基準(zhǔn)樣品中含量波動(dòng)較大,若取其均值的±30%,存在的誤差相對(duì)較大。且熟地黃不同批次不同產(chǎn)地間含量差異較大,甚至同一產(chǎn)地不同采購(gòu)地點(diǎn)含量差異也較大[15-16]。因此,在制備基準(zhǔn)樣品時(shí),要嚴(yán)格把控飲片的質(zhì)量,保證飲片質(zhì)量屬性穩(wěn)定均一。

    表8 陽(yáng)和湯基準(zhǔn)樣品指標(biāo)性成分含量測(cè)定及轉(zhuǎn)移率Table 8 Content and transfer rate of index components in Yanghe Decoction benchmark sample

    2.5 出膏率及其傳遞關(guān)系

    分別取“2.1”項(xiàng)下全方及各單味飲片煎液,水浴濃縮至稠膏,60 ℃真空干燥,測(cè)得全方基準(zhǔn)樣品實(shí)際出膏率和單味飲片出膏率。按公式(理論出膏率=∑單味飲片出膏率×單味飲片質(zhì)量/全方飲片總質(zhì)量)計(jì)算基準(zhǔn)樣品理論出膏率,結(jié)果見(jiàn)表9。15批基準(zhǔn)樣品出膏率為27.38%~40.73%,9 批基準(zhǔn)樣品出膏率在其均值的±10%范圍內(nèi),其中S5、S14出膏率高于均值的±10%范圍。

    表9 陽(yáng)和湯基準(zhǔn)樣品出膏率Table 9 Extract rate of benchmark sample of Yanghe Decoction

    熟地黃作為組方君藥,用藥劑量占全方2/3,溯源發(fā)現(xiàn)基準(zhǔn)樣品對(duì)應(yīng)批次熟地黃飲片20210314(S5)、20210315(S14)出膏率均顯著高于15 批熟地黃飲片出膏率均值,而其他單味飲片出膏率均接近于各自均值,說(shuō)明熟地黃飲片出膏率對(duì)基準(zhǔn)樣品出膏率的影響較大,導(dǎo)致S5、S14 出膏率高于均值的±10%范圍。S4、S6、S9、S10 出膏率雖不在均值的±10%范圍內(nèi),但也略接近于臨界值,因此,可將其納入范圍,基準(zhǔn)樣品出膏率控制在27.38%~34.44%。

    3 討論

    3.1 鹿角膠對(duì)基準(zhǔn)樣品的影響

    本課題組在前期研究中已經(jīng)明確了鹿角膠烊化后加入與否對(duì)基準(zhǔn)樣品并無(wú)影響,建立的色譜檢測(cè)條件和供試品溶液的制備方法既能全面反映全方色譜信息,又能穩(wěn)定考察其質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上又考察了鹿角膠對(duì)基準(zhǔn)樣品凍干粉的影響,結(jié)果表明其對(duì)基準(zhǔn)樣品指紋圖譜相似度及指標(biāo)性成分峰面積均未造成干擾,可為后期復(fù)方制劑的研制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    3.2 流動(dòng)相、檢測(cè)波長(zhǎng)、柱溫的考察

    本實(shí)驗(yàn)分別考察了在乙腈-水、甲醇-水、甲醇-0.05%磷酸水溶液(含0.05%三乙胺)以及乙腈-0.05%磷酸水溶液(0.05%三乙胺)4 種不同的流動(dòng)相體系和比例下色譜峰的分離情況,結(jié)果顯示,乙腈-0.05%磷酸水溶液(0.05%三乙胺)為流動(dòng)相時(shí),基線平穩(wěn)、色譜峰分離良好;分別考察不同波長(zhǎng),全波長(zhǎng)掃描結(jié)果表明在260 nm 時(shí)各成分色譜行為良好,在210 nm 時(shí)鹽酸麻黃堿色譜峰響應(yīng)較好,雜質(zhì)干擾小;另外,考察了柱溫對(duì)色譜峰分離度的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在35 ℃條件下,各色譜峰的分離度較好。

    3.3 指標(biāo)性成分選擇分析

    經(jīng)典名方基準(zhǔn)樣品作為后續(xù)復(fù)方制劑研究及質(zhì)量控制的參照,指標(biāo)性成分的選擇在基準(zhǔn)樣品質(zhì)量控制中具有重要意義。熟地黃、鹿角膠為君藥,具有養(yǎng)血滋陰、填精益髓的功效。肉桂、姜炭為臣藥,肉桂大辛大熱,既能溫陽(yáng)還能行血通脈,姜炭既能溫陽(yáng)又可通利血脈。白芥子、麻黃為佐藥,白芥子性溫味辛,除皮里膜外之痰,麻黃宣肺解表。甘草為使藥,解毒并調(diào)和諸藥。諸藥合用,溫陽(yáng)補(bǔ)血、寒散痰消。在熟地黃中,5-羥甲基糠醛是快速區(qū)分生、熟地黃的潛在質(zhì)量標(biāo)志物,結(jié)合補(bǔ)血止血的藥理作用,能被選擇為指標(biāo)性成分之一[17-18]。肉桂中主要含有桂皮醛、肉桂酸等成分發(fā)揮解熱、鎮(zhèn)痛、抑菌、抗病毒作用[19]。炒白芥子中芥子堿硫氰酸鹽具有鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘,抗炎鎮(zhèn)痛等作用[20]。甘草調(diào)和諸藥,含量較高的活性化合物甘草苷、甘草酸銨能抑制炎癥因子的釋放,產(chǎn)生抗炎作用[21]。而基準(zhǔn)樣品中甘草苷相對(duì)甘草酸含量較低,因此,可僅選擇甘草酸作為含量測(cè)定中表征甘草藥材的指標(biāo)性成分。

    3.4 基準(zhǔn)樣品指紋圖譜分析

    15 批基準(zhǔn)樣品歸屬了13 個(gè)共有峰,分別來(lái)自熟地黃、肉桂、炒白芥子、麻黃、甘草。但本實(shí)驗(yàn)尚存在不足之處,方中熟地黃、鹿角膠、麻黃、姜炭未指認(rèn)出《中國(guó)藥典》2020 年版單味藥項(xiàng)下規(guī)定的指標(biāo)性成分,其中地黃苷D 和鹽酸偽麻黃堿在全波長(zhǎng)掃描后,兩者最佳吸收波長(zhǎng)一致(210 nm),重新建立色譜條件后,2 種成分仍互相存在干擾且均屬于末端吸收,未能分離檢測(cè);鹿角膠中主要成分為氨基酸,屬于大極性分子,表征難度大,不具備HPLC-UV 檢測(cè)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn);6-姜辣素未能在基準(zhǔn)樣品指紋圖譜中檢識(shí)出,但其對(duì)照品在“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件可出峰,分析原因可能是干姜在炒炭高溫過(guò)程中姜酚類(lèi)化合物作為揮發(fā)性成分極其不穩(wěn)定,導(dǎo)致姜酚類(lèi)物質(zhì)逐漸降低[22]。對(duì)于上述不足之處,本課題組今后將進(jìn)一步深入研究,力求各藥味均有《中國(guó)藥典》2020 年版單味藥項(xiàng)下的質(zhì)控成分。

    3.5 基準(zhǔn)樣品量值傳遞研究

    15 批基準(zhǔn)樣品中5-羥甲基糠醛、桂皮醛和甘草酸的轉(zhuǎn)移率較低,而肉桂酸、芥子堿硫氰酸鹽的轉(zhuǎn)移率相對(duì)較高,5 種成分轉(zhuǎn)移率的高低反映了不同藥味成分間相互作用導(dǎo)致溶解性發(fā)生變化[23]。5-羥甲基糠醛、桂皮醛在飲片中含量較高,轉(zhuǎn)移率卻較低,原因在于在熟地黃飲片的含量測(cè)定中提取對(duì)象為過(guò)2 號(hào)篩的粉末,而在基準(zhǔn)樣品含量測(cè)定中首先是以飲片的形式經(jīng)過(guò)合煎而成水煎液制成凍干粉,再以50%甲醇復(fù)溶,相較于粉末提取效率不高,導(dǎo)致轉(zhuǎn)移率較低。其次,本課題組在研究熟地黃飲片質(zhì)量時(shí)發(fā)現(xiàn),同一產(chǎn)地同一批次間5-羥甲基糠醛含量忽高忽低,導(dǎo)致在制備基準(zhǔn)樣品后,計(jì)算其含量和轉(zhuǎn)移率均值的±30%就會(huì)出現(xiàn)相對(duì)更大的誤差,因此是否可考慮對(duì)含量高低不同的成分進(jìn)行具體分析,而不是都把范圍限定在其均值的±30%,以減少誤差;桂皮醛為揮發(fā)油類(lèi)成分,在煎煮過(guò)程中易受熱揮發(fā),因此轉(zhuǎn)移率更低;甘草不同組織成分存在差異,根木質(zhì)部的甘草酸含量普遍低于根皮部[24],加之飲片投料量少,含量分布不均,經(jīng)過(guò)煎煮等處理過(guò)程含量損失較大。同批甘草用于制備多批基準(zhǔn)樣品,尚且出現(xiàn)離散值,若增加不同的甘草批次進(jìn)行投料,差異可能更為明顯。建議將甘草飲片大小及部位嚴(yán)格分等、取樣均勻或采取不同批次飲片混批投料方式,以確?;鶞?zhǔn)樣品質(zhì)量穩(wěn)定[25]。

    4 結(jié)論

    陽(yáng)和湯組方嚴(yán)謹(jǐn)、用藥精煉,具有溫陽(yáng)補(bǔ)血、散寒通滯之功效,是治療陰疽的經(jīng)典方,世有“陰疽活命丹”之稱(chēng)。為保證經(jīng)典名方制劑質(zhì)量療效一致,需建立從藥材到飲片、中間體、制劑全過(guò)程的質(zhì)量控制體系,基準(zhǔn)樣品作為其中的關(guān)鍵點(diǎn),其質(zhì)量穩(wěn)定的前提是處方所用藥材及飲片的質(zhì)量均一、穩(wěn)定[26]。

    本實(shí)驗(yàn)采用指紋圖譜、指標(biāo)性成分含量測(cè)定及出膏率相結(jié)合的模式,對(duì)經(jīng)典名方陽(yáng)和湯基準(zhǔn)樣品的量值傳遞過(guò)程進(jìn)行研究分析,初步建立了科學(xué)穩(wěn)定的基準(zhǔn)樣品質(zhì)量評(píng)價(jià)方法,以期為經(jīng)典名方陽(yáng)和湯的后續(xù)開(kāi)發(fā)及相關(guān)制劑的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

    利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

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