經(jīng)典名方當(dāng)歸四逆湯物質(zhì)基準(zhǔn)指紋圖譜及關(guān)鍵質(zhì)量屬性量值傳遞規(guī)律研究

儲煙闐 ，匡艷輝，嚴(yán)曾豪，王德勤，郭海彪，張偲偲*，劉曉秋*

1.廣州白云山和記黃埔中藥有限公司現(xiàn)代中藥研究院，廣東 廣州 510000

2.沈陽藥科大學(xué)中藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016

當(dāng)歸四逆湯（Danggui Sini Decoction，DSD），來源于張仲景的《傷寒論》，由當(dāng)歸、桂枝、白芍、細(xì)辛、甘草、木通、大棗7 味藥組成，具有溫經(jīng)散寒、養(yǎng)血通脈的作用，主治血虛寒厥證[1-2]?，F(xiàn)代藥理研究表明，DSD 可用于痛經(jīng)[3]、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[4]、冠心病[5]、周圍神經(jīng)病變[6]、雷諾病[7]等諸多疾病的治療，臨床使用廣泛。DSD 在2018 年國家中醫(yī)藥管理局發(fā)布的《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》中為第13 方[8]。根據(jù)《傷寒論》原文記載，其煎煮方法為“當(dāng)歸三兩，桂枝三兩（去皮），芍藥三兩，細(xì)辛三兩，甘草二兩（炙），通草二兩，大棗二十五枚（擘），上七味，以水八升，煮取三升，去滓，溫服一升，日三服。”根據(jù)國家藥品監(jiān)督管理局2018 年5 月發(fā)布《古代經(jīng)典名方中藥復(fù)方制劑簡化注冊審批管理規(guī)定》[9]，經(jīng)典名方復(fù)方制劑開發(fā)必須首先進(jìn)行物質(zhì)基準(zhǔn)研究，為其后續(xù)的制劑開發(fā)提供依據(jù)。此外，國家藥品監(jiān)督管理局2019 年3 月發(fā)布《古代經(jīng)典名方中藥復(fù)方制劑及其物質(zhì)基準(zhǔn)申報資料要求（征求意見稿）》[10]，經(jīng)典名方的開發(fā)研究要首先明確其煎煮方法及投料規(guī)格等，且“原則上應(yīng)與經(jīng)典名方古代醫(yī)籍記載一致”。

目前，關(guān)于經(jīng)典名方DSD 的研究多見文獻(xiàn)考證及臨床應(yīng)用，少見其多個成分含量測定方法及物質(zhì)基準(zhǔn)制備工藝的研究報道[11-12]，本研究擬建立DSD指紋圖譜并結(jié)合3 種化學(xué)模式識別進(jìn)行多維度質(zhì)量評價，同時建立含量測定的方法。測定15 批DSD物質(zhì)基準(zhǔn)指紋圖譜、指標(biāo)成分的含量及出膏率，探究關(guān)鍵質(zhì)量屬性在飲片-水煎液-物質(zhì)基準(zhǔn)的傳遞規(guī)律，初步建立DSD 的全過程質(zhì)量控制體系，為DSD后續(xù)復(fù)方制劑研究提供前期基礎(chǔ)，并為其他經(jīng)典名方的物質(zhì)基準(zhǔn)研究提供借鑒。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters 2695 型高效液相色譜儀，沃特世科技中國有限公司；KQ-600VDB 型雙頻數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；C21-SDHCB9E32S型電磁爐，浙江蘇泊爾股份有限公司；CP225D 型十萬分之一電子分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；Genie U12 型超純水儀，上海樂楓生物科技有限公司；LDZ4-0.8 型離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠；FD-2D 型冷凍干燥機(jī)，上海比朗儀器制造有限公司。

1.2 材料

飲片信息如表1 所示，委托廣州采芝林藥房進(jìn)行采購，經(jīng)廣州白云山和記黃埔中藥有限公司匡艷輝制藥高級工程師鑒定均屬正品。DSD 流浸膏，批號為200601S，由廣州白云山和記黃埔中藥有限公司提供。對照品阿魏酸（批號110773-201915，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.4%）、甘草苷（批號11610-201908，質(zhì)量分?jǐn)?shù)95.0%）、苯甲酸（批號100419-201703，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.9%）、綠原酸（批號110753-202018，質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.1%）、芍藥苷（批號110736-202044，質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.8%）購自中國食品藥品檢定研究院；對照品芍藥內(nèi)酯苷（批號39011-90-0，質(zhì)量分?jǐn)?shù)90.5%）、甘草酸（批號1405-86-3，質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.3%）購自上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司。乙腈、乙酸為色譜純，德國默克公司；其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 DSD 物質(zhì)基準(zhǔn)的制備

采用隨機(jī)數(shù)表法對表1（表1 中各味飲片委托廣州采芝林大藥房進(jìn)行采購，均來自道地產(chǎn)區(qū)，每味飲片3 個產(chǎn)地，每個產(chǎn)地5 個批次）中15 批次各飲片進(jìn)行隨機(jī)組合并排序，組合信息見表2。通過本課題組前期考證及度量衡換算，宋代1 兩折算為今3 g，大棗折算為24 g，1 升換算為200 mL，煎煮時間由原文記載的“煮取3 升”即可明確，煎煮時間確定為1.5 h，煎煮次數(shù)按原文記載為1 次，稱取處方劑量當(dāng)歸9 g、桂枝9 g、白芍9 g、細(xì)辛9 g、木通6 g、甘草6 g、大棗24 g，置3 L 陶瓷罐中，加1600 mL[13]去離子水，武火1400 W 煮沸后轉(zhuǎn)文火600 W 煎煮1.5 h，煎煮至600 mL，雙層300 目篩網(wǎng)濾過，即得標(biāo)準(zhǔn)煎液，均勻取適量藥液，4000 r/min 下離心（離心半徑5 cm）10 min，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得供試品溶液；取標(biāo)準(zhǔn)煎液50 mL，冷凍干燥，即得DSD 物質(zhì)基準(zhǔn)。

表1 DSD 飲片信息Table 1 DSD pieces information

表2 15 批DSD 物質(zhì)基準(zhǔn)樣品組合信息Table 2 Information table of random combination of 15 batches of DSD substances

2.2 DSD 指紋圖譜研究

2.2.1 色譜條件 色譜柱為ACE Excel 3 C18-AR（150 mm×4.6 mm，3 μm）；流動相為乙腈-0.2%乙酸水溶液，梯度洗脫：0～18 min，8%～10%乙腈；18～48 min，10%～14%乙腈；48～70 min，14%～17%乙腈；70～85 min，17%～21%乙腈；85～95 min，21%～21.5%乙腈；95～135 min，21.5%～45%乙腈；檢測波長237 nm；體積流量0.6 mL/min；進(jìn)樣體積5 μL；柱溫25 ℃。理論塔板數(shù)以芍藥苷峰計算大于5000。

2.2.2 混合對照品溶液的制備 分別取綠原酸、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、阿魏酸、苯甲酸、甘草苷、甘草酸適量，精密稱定，加甲醇配制成質(zhì)量濃度分別為30.10、167.70、277.50、35.50、42.45、170.40、144.30 μg/mL 的混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取DSD 流浸膏2 g（物質(zhì)基準(zhǔn)1.25 g），精密稱定，置50 mL 量瓶中，加水定容，超聲處理20 min，放冷，過0.45 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液為供試品溶液。

2.2.4 指紋圖譜方法學(xué)考察

（1）參照峰的選擇：指紋圖譜中，芍藥苷的含量較高，且色譜峰穩(wěn)定故選擇芍藥苷（峰6）作為指紋圖譜的參照峰，計算指紋圖譜中各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。

（2）精密度試驗：取DSD 流浸膏，按“2.2.3”項下制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖。以芍藥苷（峰6）為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間及相對峰面積，并計算其RSD 值。結(jié)果表明各共有峰的相對保留時間RSD 均≤0.32%，相對峰面積RSD 均≤3.84%，表明儀器精密度良好。

（3）重復(fù)性試驗：按“2.2.3”項下方法平行制備6 份供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定。各共有峰的相對保留時間RSD 均≤0.53%，相對峰面積RSD 均≤3.81%，表明該方法重復(fù)性良好。

（4）穩(wěn)定性試驗：取DSD 流浸膏，按“2.2.3”項下制備供試品溶液，分別在0、2、4、6、12、24 h 進(jìn)樣，按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定。各共有峰的相對保留時間RSD 值均≤0.28%，相對峰面積RSD 值均≤4.10%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.5 指紋圖譜的建立及共有峰歸屬 按“2.1”項下制備物質(zhì)基準(zhǔn)取15 批DSD 物質(zhì)基準(zhǔn)、各單味藥及陰性對照樣品，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定。采用國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2012 版）軟件對樣品指紋圖譜進(jìn)行分析。以樣品S1 的指紋圖譜作為參照譜進(jìn)行指紋匹配（中位數(shù)法，時間窗0.1 min），確定了16 個共有峰，并生成對照指紋圖譜（R），15 批DSD 物質(zhì)基準(zhǔn)的HPLC指紋圖譜疊加圖見圖1。15 批DSD 物質(zhì)基準(zhǔn)指紋圖譜與對照圖譜的相似度大于0.90。指認(rèn)了其中16個共有峰，通過與對照品比較，分別為綠原酸（2 號峰）、芍藥內(nèi)酯苷（5 號峰）、芍藥苷（6 號峰）、阿魏酸（7 號峰）、苯甲酸（8 號峰）、甘草苷（9 號峰）、甘草酸（15 號峰）。如圖2 所示，其中1、4、9、10、13～16 號峰來自于甘草；2、3、11 號峰來自于木通；5、6、8、12 來自于白芍。15 批DSD 物質(zhì)基準(zhǔn)（S1～S15）相似度結(jié)果分別為0.996、0.987、0.990、0.994、0.993、0.991、0.993、0.991、0.989、0.985、0.993、0.901、0.974、0.991、0.972，相似度均大于0.90。其中S12、S13、S15 低于其他樣品，說明不同批次藥材制備的物質(zhì)基準(zhǔn)樣品存在一定的質(zhì)量差異。

圖1 15 批DSD 物質(zhì)基準(zhǔn)HPLC 指紋圖譜 (S1～S15) 和對照指紋圖譜 (R)Fig.1 HPLC fringerprints (S1—S15) and control fringerprint (R) of 15 batches of DSD substances

圖2 DSD 物質(zhì)基準(zhǔn)指紋圖譜中16 個特征峰及其歸屬Fig.2 Specific peaks and their attribution in benchmark fringerprints of DSD substances

2.2.6 層次聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）[14]采用SPSS 25.0 數(shù)據(jù)分析軟件，對15 批樣品的共有峰的峰面積進(jìn)行系統(tǒng)聚類，采用組間連接法，測量區(qū)間為平方歐氏距離，聚類結(jié)果見圖3，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)歐氏距離約為8 時，15 批DSD 物質(zhì)基準(zhǔn)可分為3 類，即樣品S1～S11、S14 為第1 類，樣品S13、S15 為第2 類，S12 為第3 類，此結(jié)果可與相似度評價結(jié)果相互印證。

圖3 15 批DSD 物質(zhì)基準(zhǔn)HCA 譜系圖Fig.3 Reference HCA pedigree of 15 batches

2.2.7 主成分分析（principal component analysis，PCA）選擇15 批DSD 物質(zhì)基準(zhǔn)的16 個共有峰的峰面積為變量，導(dǎo)入SIMCA-P+14.1（Demo）軟件進(jìn)行PCA 處理，得分矩陣圖見圖4。15 批DSD物質(zhì)基準(zhǔn)可分為3 類，即樣品S1～S11、S14 為第1類，樣品S13、S15 為第2 類，S12 為第3 類，此結(jié)果可與HCA 結(jié)果相互印證。

圖4 15 批DSD 物質(zhì)基準(zhǔn)PCA 得分矩陣Fig.4 PCA scoring plots of 15 batches of substance of DSD substances benchmarks of DSD

2.2.8 OPLS-DA 將15 批GSD 物質(zhì)基準(zhǔn)的16 個共有峰的峰面積導(dǎo)入SIMCA-P+14.1（Demo）軟件進(jìn)行OPLS-DA 處理，得分矩陣圖見圖5。結(jié)果發(fā)現(xiàn)15 批樣品聚為3 類，結(jié)合以變量重要性投影（VIP）值＞1 為判定標(biāo)準(zhǔn)，篩選差異組分，見圖6。結(jié)果共找到了4 個成分，按VIP 值大小排序分別為9（甘草苷）、10、15（甘草酸）、6（芍藥苷）號峰。上述4 個差異成分中3 個來自甘草，1 個來自白芍，進(jìn)一步說明嚴(yán)格控制甘草飲片質(zhì)量是確保DSD 物質(zhì)基準(zhǔn)質(zhì)量穩(wěn)定的關(guān)鍵。

圖5 15 批DSD 物質(zhì)基準(zhǔn)OPLS-DA 得分Fig.5 OPLS-DA scoring plots of 15 batches of substance benchmarks of DSD

圖6 DSD 物質(zhì)基準(zhǔn)OPLS-DA 的VIP 值Fig.6 VIP values of OPLS-DA of DSD substance benchmarks

2.3 DSD 物質(zhì)基準(zhǔn)指標(biāo)成分芍藥苷、甘草苷、甘草酸定量測定

2.3.1 色譜條件 同“2.2.1”項下，3 個成分的理論板數(shù)均大于5000，分離度大于1.5。色譜圖見圖7。

圖7 DSD 樣品 (A) 和混合對照品 (B) 的HPLC 圖Fig.7 HPLC of DSD sample (A) and mixed reference substances (B)

2.3.2 混合對照品溶液的制備 同“2.2.2”項下方法制備芍藥苷、甘草苷、甘草酸混合對照品溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備 同“2.2.3”項下。

2.3.4 方法學(xué)考察

（1）線性關(guān)系考察：分別精密吸取適量“2.3.2”項下的混合對照品溶液，加甲醇稀釋，得芍藥苷質(zhì)量濃度為13.88、27.75、55.50、111.00、222.00、277.50 μg/mL，甘草苷質(zhì)量濃度為8.52、17.04、34.08、68.16、136.32、170.40 μg/mL，甘草酸質(zhì)量濃度為7.22、14.43、28.86、57.72、115.44、144.30 μg/mL 的系列混合對照品溶液。取各個質(zhì)量濃度的混合對照品溶液各5 μL 注入液相色譜儀，按“2.2.1”項下色譜條件測定各成分的峰面積，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：芍藥苷Y=9 025.82X-1 653.98，r=1.000 0，線性范圍13.88～277.50 μg/mL；甘草苷Y=17 790.30X-17 745.64，r=1.000 0，線性范圍8.52～170.40 μg/mL；甘草酸Y=4 436.94X-2 084.58，r=1.000 0，線性范圍7.22～144.30 μg/mL。結(jié)果表明，各成分在各自質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

（2）精密度試驗：精密吸取中等質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣分析6 次，分別計算峰面積。結(jié)果芍藥苷、甘草苷和甘草酸峰面積的RSD 分別為0.81%、1.00%、1.03%，表明儀器精密度良好。

（3）穩(wěn)定性試驗：精密吸取“2.3.3”項下方法制備所得的供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12、24 h，精密吸取5 μL 供試品溶液并按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果芍藥苷、甘草苷和甘草酸峰面積的RSD 分別為2.55%、2.56%、2.09%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

（4）重復(fù)性試驗：根據(jù)“2.3.3”項下方法平行制備6 份供試品溶液，分別精密吸取5 μL 供試品溶液并按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果流浸膏中芍藥苷、甘草苷和甘草酸質(zhì)量濃度平均值分別為4.427 9、1.075 6、2.192 8 mg/g，RSD 分別為2.80%、2.81%、2.87%，表明該方法重復(fù)性良好。

（5）加樣回收率試驗：取6 份已測定各成分量的流浸膏1 g，精密稱定，分別加入芍藥苷4.23 mg、甘草苷1.11 mg、甘草酸2.19 mg，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，分別精密吸取5 μL 供試品溶液并按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，計算各成分的平均回收率和RSD 值，結(jié)果芍藥苷、甘草苷和甘草酸的平均加樣回收率分別為98.81%、96.68%、100.75%，RSD 分別為2.17%、2.33%、1.78%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.4 DSD 物質(zhì)基準(zhǔn)指標(biāo)成分在飲片-水煎液-物質(zhì)基準(zhǔn)之間的量值傳遞分析

飲片的含量測定方法參考《中國藥典》2020 年版，選取“2.3”項建立含量測定方法中具有特征性的白芍、甘草中的芍藥苷、甘草苷及甘草酸探究其飲片-水煎液-物質(zhì)基準(zhǔn)的量值傳遞規(guī)律，DSD 物質(zhì)基準(zhǔn)水煎液中指標(biāo)成分的測定按“2.1”項下制備供試品溶液及物質(zhì)基準(zhǔn)。

ω表示物質(zhì)基準(zhǔn)中指標(biāo)成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，m表示物質(zhì)基準(zhǔn)樣品質(zhì)量，W表示飲片中有效成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，M表示處方中的飲片質(zhì)量

各藥味指標(biāo)成分的含量及從飲片-物質(zhì)基準(zhǔn)轉(zhuǎn)移率結(jié)果如表3 所示，芍藥苷、甘草苷、甘草酸從飲片-物質(zhì)基準(zhǔn)平均轉(zhuǎn)移率分別為52.94%、48.79%、47.39%。結(jié)果見圖8。

圖8 DSD 物質(zhì)基準(zhǔn)指標(biāo)成分轉(zhuǎn)移率Fig.8 Component transfer rate of DSD material benchmark index

表3 白芍及甘草藥味指標(biāo)成分含量及飲片-物質(zhì)基準(zhǔn)轉(zhuǎn)移率Table 3 Content of medicinal flavor index components and reference transfer rate of decoction pieces and substances of paeoniflorin and glycyrrhizae

2.5 DSD 物質(zhì)基準(zhǔn)制備過程中各藥味干膏率傳遞規(guī)律研究

按上述確定的工藝制備15 批次的DSD 物質(zhì)基準(zhǔn)樣品，測定其干膏率。干膏率的測定方式為取100 mL（n=2）提取液或單味藥材105 ℃烘干至恒定質(zhì)量，計算公式為干膏率=6m/M，公式中6m表示干膏的質(zhì)量，M表示各組稱取的飲片量。比較全方的理論干膏率與實際干膏率的轉(zhuǎn)移規(guī)律。

結(jié)果如圖9 和表4 所示，15 批DSD 物質(zhì)基準(zhǔn)全方理論干膏率為24.26%～26.88%，實際全方干膏率為19.13%～24.58%，干膏率的平均轉(zhuǎn)移率為86.40%。

表4 15 批DSD 單味藥及物質(zhì)基準(zhǔn)干膏率及傳遞率結(jié)果Table 4 Results of 15 batches of DSD single drug and substance reference dry paste rate and transmissibility

圖9 DSD 物質(zhì)基準(zhǔn)干膏率及傳遞率分析Fig.9 Analysis of DSD material standard dry paste rate and transmissibility

理論干膏率=∑(單味藥干膏率×單味藥生藥量)/全方生藥量

3 討論

DSD 方中具有當(dāng)歸、桂枝、芍藥、細(xì)辛、甘草（炙）、通草、大棗（擘）7 味藥，方中桂枝辛溫，溫經(jīng)散寒以通脈，與當(dāng)歸共為君藥；白芍、細(xì)辛共為臣藥，助桂枝溫通血脈[15]。

原文記載的芍藥、通草、細(xì)辛和甘草均為多基原藥材，經(jīng)過前期文獻(xiàn)研究中進(jìn)行的本草考證，并結(jié)合《傷寒論》所處歷史時期，基本確定DSD 中所用的芍藥藥材基原為毛茛科芍藥屬植物芍藥P.lactifloraPall.的干燥根；通草藥材基原為木通科木通屬植物木通A.quinata(Thunb.) Decne、三葉木通A.trifoliata(Thunb.) Koidz.的干燥藤莖；細(xì)辛藥材基原為馬兜鈴科細(xì)辛屬植物北細(xì)辛A.heterotropoidesFr.Schmidt var.mandshuricum(Maxim.) Kitag.的干燥根；甘草藥材基原為豆科甘草屬植物甘草G.uralensisFisch.的干燥根及根莖。其他3 味藥所用基原均為《中國藥典》2020 年版中各自藥材基原，當(dāng)歸為傘形科當(dāng)歸屬植物當(dāng)歸A.sinensis(Oliv.) Diels.干燥根，桂枝為樟科樟屬植物肉桂C.cassiaPresl.干燥嫩枝，大棗為鼠李科棗屬植物棗Z.jujubaMill.干燥成熟果實。方中甘草原文記載為“炙甘草”，經(jīng)考證該炮制品為炒甘草，炮制方法取甘草片，照清炒法（炮制通則）炒至深黃色[16]。

課題組在建立指紋圖譜和含量測定方法時，對比了4.6 μm 及3 μm 不同粒徑色譜柱，3 μm 粒徑的色譜柱分離度更好，因此，最終選擇采用粒徑為3 μm 的色譜柱，建立復(fù)雜中藥復(fù)方制劑的含量測定方法，在流動相體積流量篩選過程中，由于色譜柱的內(nèi)填物粒徑較小，為3 μm，且色譜柱為150 mm的短柱，因此選用0.6 mL/min 的體積流量，從而避免高體積流量導(dǎo)致的高壓對高效液相色譜儀器及色譜柱的損耗。

采用了Agilent 1260 和Waters 2695 高效液相色譜儀測定供試品溶液中各成分的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各成分含量差異不大；采用ACE Excel 3 C18-AR（150 mm×4.6 mm，3 μm）、Titank C18（150 mm×4.6 mm，3 μm）、SuperLu C18（150 mm×4.6 mm，3 μm）3 種品牌的色譜柱測定各成分含量、分離度、理論塔板數(shù)及拖尾因子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各成分含量差異不大，分離度良好，理論塔板數(shù)較高，拖尾因子符合要求，說明該含量測定方法的耐用性良好。

在供試品溶液的制備過程中，考察了水和不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇超聲提取對各成分含量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各成分含量差異不大，其中水提取的供試品溶液較為澄清且重復(fù)性較好，因此，選擇水作為其提取溶劑以最大程度保留DSD 的物質(zhì)概貌。課題組在前期建立色譜條件時，將桂皮醛納入含量測定的范圍中，但由于其性質(zhì)不穩(wěn)定且極性小在水中的提取率較低，最終在物質(zhì)基準(zhǔn)中的含量僅為0.01 mg/g，不建議對其進(jìn)行含量檢測，后續(xù)研究可考慮進(jìn)行薄層色譜的鑒別。

在結(jié)合3 種化學(xué)模式進(jìn)行15 批次DSD 物質(zhì)基準(zhǔn)多維度質(zhì)量差異分析時，結(jié)果表明造成差異的主要原因來源于甘草中的甘草苷（峰9），其次是結(jié)合課題組后期質(zhì)譜分析確定的芹糖甘草苷（峰10）及甘草酸（峰15），其原因可能是由于甘草不同部位對應(yīng)含量不均勻而導(dǎo)致的差異[17]，此外，甘草不同產(chǎn)地的含量也存在一定差異，甘草中總皂苷、總黃酮和甘草酸含量較高的經(jīng)度區(qū)間均在95°0＇～99°59＇和104°0＇～118°59＇，地理位置上這2 個點分別處于新疆與甘肅的交界、內(nèi)蒙古與吉林的交界[18]，經(jīng)典名方開發(fā)過程中建議采用道地產(chǎn)區(qū)的優(yōu)質(zhì)藥材并嚴(yán)格按照飲片部位、大小等進(jìn)行分類以確保物質(zhì)基準(zhǔn)的質(zhì)量穩(wěn)定性。

通過開展指紋圖譜研究，共指認(rèn)了16 個共有峰，15 批物質(zhì)基準(zhǔn)的相似度大于0.90。同時指認(rèn)了綠原酸、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、阿魏酸、苯甲酸、甘草苷、甘草酸7 個成分，15 批物質(zhì)基準(zhǔn)中芍藥苷、甘草苷、甘草酸的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為8.267 8、2.533 3、5.160 5 mg/g，其中15 批物質(zhì)基準(zhǔn)芍藥苷、甘草酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均在均值的70%～130%，甘草苷含量范圍為2.56～3.35 mg/g。芍藥苷、甘草苷和甘草酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于1 mg/g，可作為含量測定指標(biāo)，探究量值傳遞規(guī)律。

經(jīng)典名方物質(zhì)基準(zhǔn)的制備工藝主要包括煎煮、濾過、干燥等工藝，本課題組前期通過考察煎煮工藝過程中所用的加熱源、煎煮容器、加熱火力、是否浸泡、過濾和干燥方法，確定了物質(zhì)基準(zhǔn)制備工藝的各項參數(shù)。以確定的工藝制備15 批次的物質(zhì)基準(zhǔn)，從指標(biāo)成分的含量、特征圖譜、干膏率3 個方面開展質(zhì)量相關(guān)研究，擬從多個角度分析并闡述制備過程中的質(zhì)量變化規(guī)律探究飲片-中間體-物質(zhì)基準(zhǔn)的量值傳遞規(guī)律，其中芍藥苷、甘草苷、甘草酸從飲片-中間體的傳遞率接近50%，證明水溶性成分在制備過程中轉(zhuǎn)移率高。在分析15 批次DSD 物質(zhì)基準(zhǔn)干膏率時，干膏率均在均值的±10%以內(nèi)，但實際干膏率要低于理論干膏率的數(shù)值，其原因可能是由于單味藥進(jìn)行煎煮時其吸水量要大于全方進(jìn)行煎煮時的吸水量，因此理論干膏率的數(shù)值要大于實際值[19]。

本實驗建立DSD 指紋圖譜及含量測定方法，從飲片入手探究飲片-中間體-物質(zhì)基準(zhǔn)的量值傳遞規(guī)律，證明DSD 物質(zhì)基準(zhǔn)在制備過程中其指標(biāo)成分的含量、指紋圖譜相似性及干膏率均穩(wěn)定。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突