大孔吸附樹脂結(jié)合斑馬魚評價富集純化補(bǔ)骨脂總黃酮的工藝研究

羅利霞 ，葛 靜 #，李佳妍，李彥東，宋 捷，石子琪，寧 青*，韋英杰*

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210028

2.江蘇省中醫(yī)藥研究院，國家中醫(yī)藥管理局中藥釋藥系統(tǒng)重點研究室，江蘇 南京 210028

3.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇 南京 210028

4.煙臺毓璜頂醫(yī)院藥學(xué)部，山東 煙臺 264000

補(bǔ)骨脂PsoraleaeFructus為豆科補(bǔ)骨脂屬植物補(bǔ)骨脂Psoralea corylifoliaLinn.的干燥成熟果實[1]，在醫(yī)藥和保健等多領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用，臨床上用來治療骨質(zhì)疏松、白癜風(fēng)和牛皮癬等病[2]，補(bǔ)骨脂化學(xué)成分復(fù)雜，主要含香豆素類、黃酮類和單萜酚類。目前，從補(bǔ)骨脂中已分離50 余種黃酮類化合物[3]，具有抗炎、神經(jīng)保護(hù)作用、肥胖干預(yù)和骨質(zhì)疏松改善等多種生物活性，如補(bǔ)骨脂甲素抑制缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生抗炎作用；新補(bǔ)骨脂異黃酮調(diào)節(jié)雌激素受體α/β（estrogen receptor α/β，ERα/β）和Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runt-related transcription factor 2，Runx2）促進(jìn)成骨細(xì)胞分化；補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚激動過氧化物酶體增殖物激活受體 γ（peroxisome proliferators-activated receptors γ，PPARγ）以改善胰島素抵抗和肥胖；corylifol A 抑制人羧酸酯酶2，減少毒性水解代謝物的水解[4-5]；補(bǔ)骨脂黃酮提取物能顯著提高去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠的股骨松質(zhì)骨的骨密度[6]，能通過激活棕色脂肪細(xì)胞中的產(chǎn)熱、改善葡萄糖穩(wěn)態(tài)和保護(hù)肝臟脂肪變性等來預(yù)防肥胖[7-8]。因此，補(bǔ)骨脂黃酮具有較好的應(yīng)用和研究前景。

現(xiàn)有補(bǔ)骨脂總黃酮純化方法主要為高速逆流色譜法[9]、聚酰胺柱色譜法[7]、硅膠柱色譜法[7]和大孔吸附樹脂法[10-11]：高速逆流色譜法純化補(bǔ)骨脂黃酮需用到苯、氯仿、正已烷、醋酯乙酯、甲醇等多種有機(jī)溶劑，實驗設(shè)備條件要求高，難于普及，也不適于工業(yè)化生產(chǎn)[9]。劉靜雯[7]采用聚酰胺柱色譜法和硅膠柱色譜法富集純化補(bǔ)骨脂總黃酮，除使用乙醇外，尚用到石油醚或醋酸乙酯，工業(yè)生產(chǎn)污染大，此外聚酰胺和硅膠填料不能重復(fù)利用，生產(chǎn)成本大。大孔吸附樹脂法因選擇性好、吸附量大、熱穩(wěn)定性好和綠色環(huán)保等優(yōu)點，在總黃酮分離和純化中被廣泛應(yīng)用[12]，孫麗娟等[10]和張曉曦等[11]采用ZTC-1 或LSA-21 大孔吸附樹脂色譜法純化補(bǔ)骨脂總黃酮，篩選的洗脫劑乙醇體積分?jǐn)?shù)差異較大（50%、90%乙醇），此外，2 篇報道均未優(yōu)選大孔吸附樹脂廠家，均未測定終產(chǎn)品總黃酮含量，文獻(xiàn)考查因素較少[10]（僅上樣液體積流量、質(zhì)量濃度、洗脫液體積流量及醇體積分?jǐn)?shù)）。補(bǔ)骨脂所含黃酮類成分多，結(jié)構(gòu)類型多樣（異黃酮、二氫黃酮、黃酮和查耳酮）[3]，檢測黃酮類代表成分可更確切地反映純化效果。大孔吸附樹脂有機(jī)溶劑殘留對產(chǎn)品的安全性至關(guān)重要，不同廠家大孔吸附樹脂的有機(jī)溶劑殘留存在差異，故有必要優(yōu)選大孔吸附樹脂廠家并考慮其安全性?？梢姡罂孜綐渲兓a(bǔ)骨脂總黃酮有待進(jìn)一步深入系統(tǒng)研究。

大孔吸附樹脂有機(jī)溶劑殘留（如苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯和二乙基苯等）的安全性問題至關(guān)重要，國家藥品監(jiān)督管理局規(guī)定需進(jìn)行相關(guān)檢測及控制[13]?，F(xiàn)有檢測方法主要為頂空氣相色譜法、氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用法，普通實驗室常不具備條件，實驗所需易致毒對照品的購買和使用不便。生物效應(yīng)法可直觀反應(yīng)毒/效，但相關(guān)研究未見用于大孔吸附樹脂有機(jī)溶劑殘留的安全性評價。斑馬魚具有發(fā)育快、個體小、易繁殖、胚胎透明、試驗周期短、可在微板中實時動態(tài)觀察毒性等優(yōu)點[14]，作為一種較理想的模式生物，早在上世紀(jì)便應(yīng)用于毒性評價，廣泛用于水質(zhì)檢測、藥物毒性評價[15-16]。本研究擬引入斑馬魚評價不同來源大孔吸附樹脂醇浸物的安全性，為大孔吸附樹脂安全性評價提供快速生物檢測方法[16-19]。本研究針對前期大孔吸附樹脂純化補(bǔ)骨脂黃酮相關(guān)研究的不足，以補(bǔ)骨脂的黃酮類代表成分（新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂甲素、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚和corylifol A）為指標(biāo)，優(yōu)選不同型號大孔吸附樹脂，用斑馬魚的形態(tài)變化和致死率評價其安全性以優(yōu)選不同廠家的大孔吸附樹脂；進(jìn)一步系統(tǒng)考察上樣藥液質(zhì)量濃度、體積流量、上樣量、吸附時間、洗脫劑乙醇體積分?jǐn)?shù)和用量等因素對補(bǔ)骨脂黃酮純化工藝的影響，比較優(yōu)選工藝純化前后黃酮、香豆素和補(bǔ)骨脂酚的含量，以確定所得組分純度高、生產(chǎn)安全性好、成本低且具有產(chǎn)業(yè)化可行性的大孔吸附樹脂富集純化補(bǔ)骨脂總黃酮的生產(chǎn)工藝。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent Technologies 1260 高效液相色譜儀，美國Agilent 公司，配DAD 檢測器和Agilent Chemstation工作站；AT201 分析天平，瑞士Mettler Toledo 公司；SPX-80 生化培養(yǎng)箱，寧波海曙賽褔實驗儀器廠；16 mm×200 mm 玻璃色譜柱，上海禾汽玻璃儀器有限公司；Nikon Eclipse E100 顯微鏡，日本Nikon 公司；Olympus TG-4 相機(jī)，日本Olympus 公司；Spectra MAX190 酶標(biāo)儀，Molecular Devices 公司。

1.2 實驗動物

斑馬魚成魚，南京堯順禹生物科技有限公司，來自德國Tuebingen 品系。

1.3 藥品與試劑

鹽補(bǔ)骨脂，批號160804，購買于南京海源中藥飲片有限公司，經(jīng)江蘇省中醫(yī)藥研究院韋英杰研究員鑒定，為豆科補(bǔ)骨脂屬植物補(bǔ)骨脂P.corylifoliaLinn.的干燥成熟果實。

對照品補(bǔ)骨脂素（批號110739-201617，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.7%）和異補(bǔ)骨脂素（批號110738-201614，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.7%）購自中國食品藥品檢定研究院；對照品新補(bǔ)骨脂異黃酮（批號DST170522-055，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）、corylifol A（批號DST170522-073，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）、4＇-O-甲基補(bǔ)骨脂查耳酮（批號DST170522-052，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）均購自成都德思特生物技術(shù)有限公司；補(bǔ)骨脂甲素（又名補(bǔ)骨脂二氫黃酮，批號JZ17031802，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）、補(bǔ)骨脂乙素（又名異補(bǔ)骨脂查耳酮，批號JZ1703180，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚（批號JZ16071904，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）、補(bǔ)骨脂定（批號JZ16110406，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）、補(bǔ)骨脂寧（又名補(bǔ)骨脂異黃酮，批號JZ16091204，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）、補(bǔ)骨脂酚（批號JZ16092103，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）均購自南京景竹生物科技有限公司；對照品蘆丁（批號100080-201811，質(zhì)量分?jǐn)?shù)91.7%）購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇（批號21010355，色譜純）、乙腈（批號17055081，色譜純）購自美國Tedia 公司；甲酸（批號G1826012，色譜純）購自阿拉丁試劑有限公司；乙醇（批號P1383736）購買于General-Reagent；NaNO2（批號C10070967）購自上海麥克林試劑有限公司；Al(NO3)3（批號1818048）購自阿拉丁試劑有限公司；NaOH（批號20140510）購自天津博迪化工股份有限公司；大孔吸附樹脂D101（批號T02J9x64575）、HPD100（批號T24A9X59689）、AB-8（批號 T02J9X64576）、DM130（批號T11D8X50200）和S-8（批號T13J9X63397）均購買于上海源葉生物科技有限公司。D101 大孔吸附樹脂D1～D10 依次來源于上海源葉生物科技有限公司、天津浩聚樹脂科技有限公司、國藥試劑集團(tuán)、南開大學(xué)化工廠（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）、酷爾化學(xué)科技（北京）有限公司、鄭州和成新材料科技有限公司、陜西樂博生化科技有限公司、滄州寶恩吸附材料科技有限公司、上海麥克林生化科技有限公司和東鴻化工有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試液的制備

2.1.1 補(bǔ)骨脂藥材提取液的制備 取鹽補(bǔ)骨脂（800 g）經(jīng)水煎后的藥渣，加4 倍體積的70%乙醇回流提取2 次，每次1.5 h，濾過，合并濾液，減壓回收乙醇至無醇味（約含生藥1 g/mL），靜置過夜，取沉淀物適量，用30%乙醇溶解，分別制成含生藥0.25、0.50、0.75、1.00 g/mL，供大孔吸附樹脂純化用。

2.1.2 大孔吸附樹脂優(yōu)化供試液的制備 取不同條件大孔吸附樹脂優(yōu)化后的樣品適量（相當(dāng)于20 mg生藥），加甲醇至1 mL，供大孔吸附樹脂工藝優(yōu)化檢測4 種黃酮指標(biāo)成分（新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂甲素、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚和corylifol A）用。

2.1.3 大孔吸附樹脂浸提液的制備 分別稱取不同廠家D101 大孔吸附樹脂10 g，加40 mL 95%乙醇浸泡，搖勻，1 h 后吸取4 mL 乙醇浸液于試管中，空氣吹干備用。臨用前加DMSO 適量使溶解，加培養(yǎng)基分別稀釋成高（大孔吸附樹脂0.5 g/mL）、中（大孔吸附樹脂0.25 g/mL）和低（大孔吸附樹脂0.125 g/mL）質(zhì)量濃度溶液，供斑馬魚毒性評價用。

2.2 指標(biāo)成分含量的測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Zorbax C18柱（250 mm×4.6 mm）；進(jìn)樣量10 μL；體積流量1 mL/min；柱溫25 ℃；檢測波長246 nm；流動相為0.1%甲酸水溶液-乙腈，梯度洗脫：0～30 min，10%～50%乙腈；30～45 min，50%～60%乙腈；45～50 min，60%～70%乙腈；50～55 min，70%～80%乙腈；55～65 min，80%乙腈。補(bǔ)骨脂醇提液、補(bǔ)骨脂總黃酮提取物和混合對照品的HPLC 色譜圖如圖1 所示。

圖1 補(bǔ)骨脂醇提液 (A)、補(bǔ)骨脂總黃酮提取物 (B) 和混合對照品 (C) 的HPLC 圖Fig.1 HPLC of ethanol extract of Psoraleae Fructus (A),total flavonoids extract of Psoraleae Fructus (B),and mixed standards (C)

2.2.2 線性關(guān)系考察 分別精密稱取補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂甲素、補(bǔ)骨脂寧、補(bǔ)骨脂定、補(bǔ)骨脂乙素、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚、corylifol A、4＇-O-甲基補(bǔ)骨脂查耳酮和補(bǔ)骨脂酚適量，加甲醇分別配制質(zhì)量濃度為95.00、108.00、96.30、60.80、51.00、48.00、55.10、53.63、72.88、26.13、300.00 μg/mL 的對照品母液，用2 倍稀釋法依次稀釋對照品母液，得質(zhì)量濃度相當(dāng)于母液質(zhì)量濃度1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128、1/256的系列對照品溶液，分別精密吸取對照品母液10、20、40 μL 以及系列對照品溶液10 μL，注入液相色譜儀，按照“2.2.1”項色譜條件測定。根據(jù)對照品質(zhì)量濃度（X）與檢測峰面積（Y）得到回歸方程及線性范圍分別為新補(bǔ)骨脂異黃酮[18]Y=38.798X+26.505，r=0.999 6，線性范圍0.75～192.60 μg/mL；補(bǔ)骨脂甲素[18]Y=22.580X+20.061，r=0.999 7，線性范圍1.90～243.20 μg/mL；補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚[18]Y=24.269X+7.691，r=0.999 8，線性范圍1.68～214.52 μg/mL；corylifol A[18]Y=36.361X+19.620，r=0.999 8，線性范圍1.14～291.52 μg/mL；補(bǔ)骨脂寧Y=89.313X-67.917，r=0.999 8，線性范圍3.19～51.00 μg/mL；補(bǔ)骨脂定Y=17.456X-10.242，r=0.999 8，線性范圍3.00～48.00 μg/mL；補(bǔ)骨脂乙素Y=28.72X-44.342，r=0.998 8，線性范圍3.44～55.10 μg/mL；4＇-O-甲基補(bǔ)骨脂查耳酮Y=21.016X-20.713，r=0.995 0，線性范圍1.63～26.13 μg/mL；補(bǔ)骨脂素[18]Y=57.701X+32.075，r=0.999 6，線性范圍0.74～95.00 μg/mL；異補(bǔ)骨脂素[18]Y=54.822X+71.640，r=0.999 7，線性范圍0.84～216.00 μg/mL；補(bǔ)骨脂酚[18]Y=19.427X+113.510，r=0.999 2，線性范圍2.34～600.00 μg/mL。

2.2.3 方法學(xué)考察結(jié)果 補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂甲素、補(bǔ)骨脂寧、補(bǔ)骨脂定、補(bǔ)骨脂乙素、4＇-O-甲基補(bǔ)骨脂查耳酮、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚、corlyfol A 和補(bǔ)骨脂酚的RSD，在重復(fù)性試驗中分別為3.3%、1.7%、2.9%、3.1%、5.8%、5.5%、4.7%、5.3%、2.9%、2.9%、3.0%；在精密度試驗中分別為0.6%、0.8%、1.5%、2.2%、3.8%、5.0%、2.8%、5.7%、0.8%、2.8%、0.2%；在穩(wěn)定性試驗中分別為2.9%、2.4%、2.3%、2.9%、3.2%、3.7%、3.3%、3.3%、1.9%、2.7%、0.9%；在準(zhǔn)確度試驗中分別為3.8%、2.5%、8.4%、2.2%、8.7%、2.2%、3.5%、10.0%、5.6%、10.2%、6.4%；在準(zhǔn)確度試驗中平均加樣回收率分別為108.8%、106.5%、103.2%、103.1%、91.0%、91.2%、96.4%、110.9%、93.3%、90.9%、99.6%。

2.3 總黃酮含量的測定

精密稱定蘆丁對照品10 mg，加乙醇制成0.40 mg/mL 的溶液，分別取適量體積于25 mL 量瓶中，加水稀釋至不同質(zhì)量濃度的對照品溶液（總體積為6 mL），加5% NaNO2溶液1 mL 混勻，靜置6 min，加10% Al(NO3)3溶液1 mL 混勻，靜置6 min，加NaOH 試液（取氫氧化鈉4.3 g，使溶解成100 mL，即得）10 mL，加水定容搖勻，靜置15 min，在500 nm 波長處測定吸光度（A）值，以A值與對照品質(zhì)量濃度（X）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程A=0.007 2X-0.027 3，r=0.999 2，線性范圍為16.94～84.70μg/mL。

2.4 總黃酮富集純化工藝優(yōu)化

2.4.1 大孔吸附樹脂類型的篩選

（1）靜態(tài)吸附和解吸附實驗：95%乙醇浸泡D101、AB-8、DM130、S-8、HPD100 大孔吸附樹脂24 h 后，95%乙醇淋洗，再用蒸餾水淋洗至洗出液無醇味和不顯渾濁。分別取預(yù)處理好的5 種大孔吸附樹脂各10 mL，置三角瓶中，加入質(zhì)量濃度為0.5 g/mL 的補(bǔ)骨脂提取液10 mL，每隔30 min 振搖10 s，使大孔吸附樹脂與補(bǔ)骨脂提取液充分接觸，2 h 后取未吸附上清液；棄去未吸附液，加入90%乙醇10 mL，振蕩器中振搖2 h 進(jìn)行解吸附，取解吸附上清液。取樣未吸附液和解吸附液適量（20 mg 生藥量），進(jìn)樣10 μL，進(jìn)行HPLC 測定，記錄4 種黃酮類代表成分（新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂甲素、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚和corylifol A）的峰面積，計算靜態(tài)吸附率和靜態(tài)解吸附率。

靜態(tài)吸附率=(上樣溶液中某成分峰面積-未吸附液中某成分峰面積)/上樣溶液中某成分峰面積

靜態(tài)解吸附率=解吸附液中某成分峰面積/(上樣溶液中某成分峰面積-未吸附液中某成分峰面積)

5 種不同型號大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附和解吸能力結(jié)果見表1，D101、AB-8 與DM130 大孔吸附樹脂對4 種黃酮類代表成分的靜態(tài)吸附率均較高（94%以上），平均值均大于97%，吸附能力均較好且相近；HPD100 大孔吸附樹脂對補(bǔ)骨脂甲素的吸附能力較弱（76.1%）；S-8 對4 種黃酮的靜態(tài)吸附率均相對較低（84.4%～95.3%）。3 種吸附力較好的大孔吸附樹脂D101、AB-8 與DM130 對4 種黃酮的解吸附力以D101 與DM130 為優(yōu)。

表1 不同型號大孔吸附樹脂對黃酮類代表成分的靜態(tài)吸附率與靜態(tài)解吸附率Table 1 Static adsorption rate and desorption rate of representative components of flavonoids with different types of macroporous adsorption resins

（2）動態(tài)吸附和解吸附實驗：取預(yù)處理好的D101、AB-8、DM130、S-8 和HPD100 大孔吸附樹脂各10 mL，裝入不同色譜柱，以0.5 g/mL 補(bǔ)骨脂提取液10 mL 上樣，30%乙醇清洗樹脂中未被吸附成分，一并收集流出液。后用2 倍柱體積（BV）90%乙醇洗脫，收集洗脫液。取流出液和洗脫液適量（20 mg 生藥量），HPLC 測定并記錄4 種黃酮類代表成分的峰面積，計算動態(tài)吸附率和動態(tài)解吸附率。

動態(tài)吸附率=(上樣溶液中某成分峰面積-上樣流出液中某成分峰面積)/上樣溶液中某成分峰面積

動態(tài)解吸附率=90%乙醇洗脫液中某成分峰面積/(上樣溶液中某成分峰面積-上樣流出液中某成分峰面積)

5 種不同型號大孔吸附樹脂對補(bǔ)骨脂黃酮類代表成分的動態(tài)吸附率與動態(tài)解吸附率見表2，D101、DM130 和HPD100 大孔吸附樹脂對黃酮類成分的動態(tài)吸附率均較高（大于95%），其次為AB-8 和S-8；S-8 的動態(tài)解吸附率最高，其次是解吸附能力相近的D101 和AB-8，HPD100 和DM130 相對較低。

表2 不同型號大孔吸附樹脂對黃酮類代表成分的動態(tài)吸附率與動態(tài)解吸附率Table 2 Dynamic adsorption rate and desorption rate of representative components of flavonoids with different types of macroporous adsorption resins

靜態(tài)和動態(tài)的吸附與解吸附實驗結(jié)果表明，D101 兼具較好的吸附和解吸附能力，且價低易得，應(yīng)用范圍廣，故選擇D101 為最佳吸附樹脂。

2.4.2 D101 大孔吸附樹脂廠家的篩選 不同廠家來源的大孔吸附樹脂有化學(xué)純和分析純等級別，常見的苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯和二乙烯苯等致癌有機(jī)溶劑殘留不同，通常導(dǎo)致終產(chǎn)品的有機(jī)溶劑殘留不同，常用GC-MS 法測定。本研究通過比較斑馬魚致畸和致死效果快速評價不同廠家D101 大孔吸附樹脂的相對安全性。收集斑馬魚成魚自然交配產(chǎn)生的胚胎，置培養(yǎng)基中于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取受精后1 d（days after fertilization，dpf）斑馬魚胚胎（1 dpf），置24 孔板中，每孔8 個胚胎，每組平行2 孔，分別暴露于不同質(zhì)量濃度的大孔吸附樹脂浸提液中，用95%乙醇按“2.1”項大孔吸附樹脂浸提液的制備方法制備得的培養(yǎng)基（含4 mL 95%乙醇揮干物/mL）作對照組。每天計數(shù)魚死亡數(shù)量并計算死亡率，顯微鏡觀察并記錄3～6 dpf 魚的形態(tài)。參考文獻(xiàn)報道方法評價斑馬魚形態(tài)[20]，見表3。

表3 斑馬魚形態(tài)變化評價Table 3 Evaluation of morphological changes in zebrafish

（1）不同廠家D101 大孔吸附樹脂浸液對斑馬魚形態(tài)影響：結(jié)果見表4 和圖2，培養(yǎng)基對照組斑馬魚幼魚（3 dpf）正常孵出，體節(jié)明顯可見，心包無水腫；與對照組相比，經(jīng)不同廠家D101 大孔吸附樹脂醇浸液培養(yǎng)后，斑馬魚中毒程度基本呈濃度相關(guān)性，出現(xiàn)的畸形特征有心包水腫、卵黃囊腫脹或發(fā)黑和身體彎曲等。

圖2 不同廠家大孔吸附樹脂醇浸提液對斑馬魚幼魚 (3 dpf) 形態(tài)的影響Fig.2 Effects of ethanol extracts of macroporous adsorptive resin from different manufacturers on morphology of zebrafish(3 dpf)

表4 不同廠家大孔吸附樹脂不同質(zhì)量濃度浸提液對斑馬魚幼魚 (3 dpf) 形態(tài)的影響Table 4 Effects of different mass concentrations of macroporous adsorptive resins extracts from different manufacturers on morphology of zebrafish (3 dpf)

D2、D5、D6 大孔吸附樹脂的低（大孔吸附樹脂0.125 g/mL）和中（大孔吸附樹脂0.250 g/mL）質(zhì)量濃度組斑馬魚未顯示或顯示輕微變化，高（大孔吸附樹脂0.500 g/mL）質(zhì)量濃度組斑馬魚顯示輕度或中度畸形；D10 大孔吸附樹脂的低與中質(zhì)量濃度組、D7、D8、D9 大孔吸附樹脂不同質(zhì)量濃度組的斑馬魚幼魚未孵化出，提示發(fā)育遲緩或異常；D3大孔吸附樹脂浸液對斑馬魚的致畸性呈較明顯的質(zhì)量濃度相關(guān)性；中和高質(zhì)量濃度的D1 和D4 的大孔吸附樹脂浸液都致斑馬魚3 d 全部死亡，提示對斑馬魚胚胎有較大的發(fā)育毒性。

（2）不同廠家D101 大孔吸附樹脂浸液對斑馬魚胚胎的時-量-毒關(guān)系：結(jié)果如表5 所示。D5 大孔吸附樹脂醇浸液在考察質(zhì)量濃度范圍內(nèi)未致斑馬魚胚胎死亡，D2、D6、D10 大孔吸附樹脂各質(zhì)量濃度對斑馬魚胚胎累積死亡率均小于20%，為安全質(zhì)量濃度[21]；D7、D8、D9 大孔吸附樹脂給藥期間致斑馬魚死亡率為20%～75%；D1、D3（除低質(zhì)量濃度外）、D4 大孔吸附樹脂致斑馬魚死亡率均達(dá)100%，呈時間相關(guān)性。綜合斑馬魚形態(tài)變化和存活率的結(jié)果，不同廠家大孔吸附樹脂醇浸液對斑馬魚胚胎發(fā)育的急性毒性由大到小順序初步為D1＞D4＞D3＞D7、D9＞D8＞D10＞D6＞D2、D5。提示D2 和D5廠家的D101 大孔吸附樹脂安全性最好。

表5 不同廠家D101 大孔吸附樹脂不同質(zhì)量濃度醇浸提液致斑馬魚死亡的時-量-毒關(guān)系Table 5 Time-quantity-toxicity relationship of zebrafish death caused by ethanol extracts of D101 macroporous adsorptive resin from different manufacturers with different mass concentrations

2.4.3 大孔吸附樹脂純化補(bǔ)骨脂總黃酮工藝參數(shù)考察

（1）吸附時間考察：取D101 大孔吸附樹脂（天津浩聚樹脂科技有限公司，下同）10 mL 濕法裝柱，加0.5 g/mL 補(bǔ)骨脂提取液10 mL，以1 mL/min 體積流量上樣，分別吸附0、0.5、1.0、1.5、2.0 h，之后用30%乙醇清洗大孔吸附樹脂中未被吸附的成分，收集流出液，取樣（20 mg 生藥量，進(jìn)樣10 μL，下同）測定4 種黃酮成分，記錄峰面積，計算吸附率。結(jié)果如表6 所示，D101 大孔吸附樹脂在不同吸附時間對4 種黃酮指標(biāo)成分的吸附率均大于92%，相差不大。在動態(tài)吸附過程中，黃酮成分平均吸附率隨時間增加逐步增大，在1.5 h 時吸附率最高，故確定最佳吸附時間為1.5 h。

表6 不同吸附時間的黃酮類代表成分吸附率Table 6 Adsorption rate of representative components of flavonoids with different adsorption time

（2）上樣藥液質(zhì)量濃度考察：取D101 大孔吸附樹脂10 mL 濕法裝柱，分別以1 mL/min 的體積流量各質(zhì)量濃度（0.25、0.50、0.75、1.00 g/mL）的補(bǔ)骨脂提取液10 mL 進(jìn)行動態(tài)吸附，后用等量的30%乙醇以等體積流量清洗大孔吸附樹脂中未被吸附的成分，一并收集流出液，取樣測定4 種黃酮成分，記錄峰面積，計算吸附率。結(jié)果如表7 所示，D101 大孔吸附樹脂對0.25～1.00 g/mL 藥液的4 種黃酮指標(biāo)成分吸附率均在85%以上，其中黃酮成分平均吸附率隨質(zhì)量濃度增大而先上升后下降，0.50 g/mL 時的平均吸附率較高。

表7 不同藥液質(zhì)量濃度的黃酮類代表成分吸附率Table 7 Adsorption rate of representative components of flavonoids by different mass concentration solution

（3）上樣藥液體積流量考察：以0.5 g/mL 補(bǔ)骨脂提取液1 BV 分別控制體積流量為0.5、1.0、2.0、4.0 mL/min 進(jìn)行吸附。之后用等量的30%乙醇以等體積流量清洗大孔吸附樹脂中未被吸附的成分，收集流出液，取樣測定4 種黃酮成分，記錄峰面積，計算吸附率。如表8 所示，吸附體積流量在0.5～4.0 mL/min 時，4 種黃酮指標(biāo)成分吸附率均較高（大于92%），在0.5、1.0 mL/min 時黃酮成分平均吸附率均大于97%，體積流量大于1.0 mL/min 時，各成分吸附率均降低。綜合各成分的吸附效果及提高生產(chǎn)效率，擬確定體積流量為1.0 mL/min。

表8 不同吸附體積流量的黃酮類代表成分吸附率Table 8 Adsorption rate of representative components of flavonoids by different flow rate

（4）洗脫劑乙醇體積分?jǐn)?shù)考察：按照已經(jīng)確定的條件濕法裝柱及上樣進(jìn)行動態(tài)吸附。1 BV 30%乙醇洗去大孔吸附樹脂柱中未被吸附的成分，再分別用2 BV 的不同體積分?jǐn)?shù)乙醇（30%、50%、70%、90%）以相同的體積流量洗脫，收集洗脫液，取樣測定4 種黃酮成分，記錄峰面積，外標(biāo)法計算含量，計算解吸附量。結(jié)果如表9 所示，30%～50%乙醇對目標(biāo)黃酮成分的解吸附量基本為0，乙醇體積分?jǐn)?shù)大于50%時，乙醇體積分?jǐn)?shù)越高，目標(biāo)黃酮成分的解吸附量越大，90%乙醇時解吸附量最大，提示以90%乙醇洗脫為優(yōu)。

表9 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)的黃酮類代表成分洗脫量Table 9 Elution amount of representative components of flavonoids with different ethanol volume fraction

（5）最大上樣量考察：取D101 大孔吸附樹脂10 mL 濕法裝柱，補(bǔ)骨脂提取液以1 mL/min 的體積流量上樣，分別以0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 BV 上樣，收集泄漏流分，取樣測定4 種黃酮成分，記錄峰面積，外標(biāo)法計算含量。結(jié)果如表10 所示，4 種黃酮類指標(biāo)成分的泄露量隨著上樣量的增加呈增加趨勢，上樣量為0.6 BV 時泄漏量最低，增加至1.0～1.4 BV 時，平均泄漏量基本不變；大于1.4 BV 時，新補(bǔ)骨脂異黃酮和補(bǔ)骨脂甲素泄露量則顯著上升，考慮到實際生產(chǎn)效率，選擇上樣量為1.0 BV（10 mL）。

表10 不同上樣量的黃酮類代表成分泄露量Table 10 Leakage amount of representative components of flavonoids with different sample volumes

（6）洗脫劑用量考察：按照已經(jīng)確定的條件濕法裝柱及上樣，1 BV 30%乙醇洗去大孔吸附樹脂中未被吸附的成分，用不同體積（1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 BV）90%乙醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，取樣測定4 種黃酮成分，記錄峰面積，外標(biāo)法計算含量。取4 BV 與7 BV 洗脫液濃縮和干燥，得補(bǔ)骨脂總黃酮提取物粉末，分別精密稱取適量，加甲醇配制成200 μg/mL 的供試品溶液，HPLC 法測定4種黃酮成分，記錄峰面積，外標(biāo)法計算含量。

結(jié)果如表11 所示，洗脫劑用量在第1、2 個BV時，目標(biāo)黃酮成分的洗脫量最大（120～650 μg/g 生藥）；后隨著洗脫劑用量增加，洗脫量降低，在第4個BV 時降至30～110 μg/g 生藥；至第7 BV 時，各黃酮類代表成分洗脫近完全。對4 BV 與7 BV 洗脫量進(jìn)行比較，測定所得黃酮提取物干粉的 4 種指標(biāo)成分含量和相當(dāng)，分別為25.3%和25.8%，考慮節(jié)約成本，選擇4 BV 進(jìn)行洗脫。

表11 不同洗脫體積的黃酮類代表成分洗脫量Table 11 Elution amount of representative components of flavonoids with different elution volume

2.4.4 大孔吸附樹脂純化補(bǔ)骨脂總黃酮工藝驗證實驗 取預(yù)處理好的D101 大孔吸附樹脂10 mL 濕法裝柱，加0.5 g/mL 補(bǔ)骨脂提取液1 BV 上樣，以1 mL/min 體積流量吸附，吸附1.5 h 后，用30%乙醇1 BV 洗去未被吸附的成分，用4 BV 90%乙醇洗脫，收集洗脫液，濃縮干燥得補(bǔ)骨脂總黃酮提取物。按以上工藝重復(fù)3 次。

精密稱取大孔吸附樹脂純化前后提取物10 mg，加甲醇配制成200 μg/mL 的供試品溶液，進(jìn)樣10 μL，進(jìn)行HPLC 測定，記錄峰面積，外標(biāo)法計算8 種黃酮類成分、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素和補(bǔ)骨脂酚含量。另以蘆丁為對照品，精密量取補(bǔ)骨脂總黃酮提取物供試液2 mL（精密稱取補(bǔ)骨脂總黃酮提取物10 mg，加乙醇制成2 mg/mL 的溶液）于25 mL量瓶中，加水4 mL，按“2.3”項下用紫外-可見分光光度法測定并計算提取中物總黃酮含量。

測定了大孔吸附樹脂純化驗證試驗總黃酮提取物中新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂甲素、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚、corylifol A、補(bǔ)骨脂寧、補(bǔ)骨脂定、補(bǔ)骨脂乙素、4＇-O-甲基補(bǔ)骨脂查耳酮、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素（黃酮類和香豆素類），以及補(bǔ)骨脂酚的含量，并與樹脂純化前的醇提物進(jìn)行比較，以各成分含量占所測成分含量總和的百分比作為相對百分含量。

結(jié)果（圖1 和表12）表明，大孔吸附樹脂純化前，補(bǔ)骨脂醇提物中以補(bǔ)骨脂酚為主，相對百分含量約為60%，黃酮成分的相對百分含量約為33%，香豆素類含量最低，約為7%；大孔吸附樹脂純化可有效提高黃酮成分的含量，純化后的新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂甲素、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚、corylifol A、補(bǔ)骨脂寧、補(bǔ)骨脂定、補(bǔ)骨脂乙素和4＇-O-甲基補(bǔ)骨脂查耳酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為9.39%、4.82%、6.03%、4.99%、0.68%、6.74%、5.36%、2.75%，各黃酮成分純化后含量約是純化前的1.3～5.1 倍，8 種黃酮成分含量和（平均值40.76%）約是純化前（14.13%）的3 倍，黃酮成分總量的相對百分含量提高至約93.6%，同時有效去除補(bǔ)骨脂酚，香豆素類成分含量變化不大。以蘆丁為對照品，通過紫外-可見分光光度法測得總黃酮含量約為54%。結(jié)果表明，采用D101 大孔吸附樹脂富集純化補(bǔ)骨脂總黃酮的工藝穩(wěn)定可行。

表12 大孔吸附樹脂分離純化前后補(bǔ)骨脂提取物中黃酮類代表成分、香豆素及補(bǔ)骨脂酚含量Table 12 Contents of representative components of flavonoids,coumarins and bakuchiol of Psoraleae Fructus before and after purification with macroporous adsorptive resin

3 討論

通過比較極性（S-8）、弱極性（AB-8 和DM130）和非極性（D101 和HPD100）5 種型號大孔吸附樹脂對補(bǔ)骨脂的黃酮類代表成分（新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂甲素、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚和corylifol A）的靜態(tài)、動態(tài)吸附率和解吸附率，優(yōu)選出非極性D101大孔吸附樹脂，該型號樹脂價廉易得，普適性強(qiáng)，易于推廣應(yīng)用。

不同廠家D101 大孔吸附樹脂醇浸物對斑馬魚的形態(tài)和死亡率影響不同，能直觀和客觀反應(yīng)毒性大小，實驗在微孔板中進(jìn)行，周期短（6 d），可實時動態(tài)觀察，簡單高效。不同來源大孔吸附樹脂安全性差異與其有機(jī)溶劑殘留密切相關(guān)，斑馬魚評價為大孔吸附樹脂安全性提供生物檢測法依據(jù)。

異黃酮和二氫黃酮均為補(bǔ)骨脂主要黃酮結(jié)構(gòu)類型，本研究以2 種二氫黃酮（補(bǔ)骨脂甲素和補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚）和2 種異黃酮（新補(bǔ)骨脂異黃酮和corylifol A）為指標(biāo)，含量相對較高，極性差異較大，具有代表性，較紫外-可見分光光度法測定總黃酮指標(biāo)更明確。補(bǔ)骨脂醇提物主要含有補(bǔ)骨脂酚（約60%）、黃酮類（約33%）和少量香豆素（約7.0%），其中補(bǔ)骨脂酚是補(bǔ)骨脂致毒關(guān)鍵成分[18]，有必要比較3 類成分純化前后的含量。用HPLC 法測定8 種黃酮、2種香豆素和補(bǔ)骨脂酚的含量，結(jié)果表明D101大孔吸附樹脂純化可有效提高黃酮成分含量同時去除高毒成分補(bǔ)骨脂酚，純化后8 種黃酮成分含量和（平均值40.76%）約是純化前（14.13%）的3 倍，各黃酮成分純化后含量約是純化前的1.3～5.1 倍，黃酮成分總量占所測成分的百分量由32.9%提高至約93.6%，2 種香豆素含量（補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素）在純化前后的相對量均較低（7.0%和6.4%）。另用紫外-可見分光光度法測定純化后總黃酮含量約為54%。

綜上，本研究選擇D101 大孔吸附樹脂純化補(bǔ)骨脂總黃酮成本低，安全性好，制備總黃酮含量高，大孔吸附樹脂吸附和洗脫過程中僅用無毒乙醇做溶媒，產(chǎn)業(yè)化前景好，為中藥黃酮成分的富集純化提供參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突