基于HPLC 指紋圖譜和LC-Q-TOF/MS 的加味黃芪桂枝五物湯化學成分研究

湯書婉，李新亮，馬 莉，鄭云楓*，李存玉，成小蘭，曹 鵬,，彭國平*

1.南京中醫(yī)藥大學，江蘇 南京 210000

2.南京中醫(yī)藥大學附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇 南京 210000

加味黃芪桂枝五物湯（Jiawei Huangqi Guizhi Wuwu Decoction，JHD）是由經(jīng)典名方黃芪桂枝五物湯與芍藥甘草湯衍化而來，由黃芪、桂枝、生姜、大棗、白芍、甘草6 味藥組成。具有益氣溫經(jīng)、和血通痹之功效，主治血痹陰陽俱微、寸口關(guān)上微、尺中小緊、外證身體不仁，如風痹狀[1]?，F(xiàn)代研究表明，該方能顯著預防化療藥物奧沙利鉑引起的外周神經(jīng)病變，有效保護外周神經(jīng)元線粒體穩(wěn)態(tài)，降低化療引起的神經(jīng)元損傷[2-3]，減輕腫瘤患者在臨床治療時的疼痛，具有良好的臨床應(yīng)用前景。

JHD 組方中涉及的藥味較多，成分復雜[4-5]，增加了質(zhì)量控制標準建立的難度。物質(zhì)基礎(chǔ)是制劑質(zhì)量控制的關(guān)鍵[6]，通過指標成分的含量檢測或特征圖譜的單一手段，難以體現(xiàn)復方制劑質(zhì)量控制體系的科學性和全面性[7-8]。液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)具有高效、高分辨率、高靈敏度等優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于中藥復方的化學成分分析。本研究基于HPLC 建立了JHD 的指紋圖譜，同時采用LC-Q-TOF/MS 技術(shù)，結(jié)合對照品指認與文獻報道，對指紋圖譜中的共有峰進行定性鑒別，進一步對各共有成分的歸屬進行了解析，以期為JHD 的新藥開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters e2695 型高效液相色譜儀、2998 PDA 檢測器（美國Waters 公司）；AB SCIEX Triple TOFTM5600 型高分辨質(zhì)譜儀（美國AB SCIEX 公司）；SCIENTZ-10ND 型真空冷凍干燥機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；梅特勒MS-105DU 1/10 萬電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；TG16 A-WS型離心機（南京以馬內(nèi)利儀器設(shè)備有限公司）；DW-0.25K 型智能數(shù)顯恒溫電熱套（南通市通州暢通電熱器廠）。

1.2 材料

對照品毛蕊異黃酮苷（批號111920-201606，質(zhì)量分數(shù)97.6%）、芒柄花素（批號111703-201504，質(zhì)量分數(shù)97.5%）、黃芪甲苷（批號110781-201717，質(zhì)量分數(shù)96.9%）、桂皮醛（批號110710-201821，質(zhì)量分數(shù)99.6%）、甘草苷（批號111610-201908，質(zhì)量分數(shù)95.0%）、甘草酸銨（批號110731-201619，質(zhì)量分數(shù)93.0%）、6-姜辣素（批號111833-201806，質(zhì)量分數(shù)99.9%）、8-姜酚（批號111993-201601）、10-姜酚（批號111994-201501）、芍藥苷（批號110736-201943，質(zhì)量分數(shù)95.1%）均購自中國食品藥品檢定研究院；對照品毛蕊異黃酮（批號JBZ-0786）、芒柄花苷（批號JBZ-0778）、黃芪皂苷I（批號JBZ-0501）、異甘草苷（批號JBZ-1503）、芹糖甘草苷（批號JBZ-1725）、芹糖異甘草苷（批號JBZ-0996）均購自南京金益柏生物科技有限公司（質(zhì)量分數(shù)≥98%）；丙二酰毛蕊異黃酮苷、丙二酰芒柄花苷、丙二酰黃芪皂苷I、烏拉爾皂苷B、甘草皂苷G2 均由實驗室前期分離純化獲得[9-10]，經(jīng)HPLC 分析，質(zhì)量分數(shù)≥98%。乙腈（色譜純，美國Tedia 公司）；甲酸（色譜純，德國Merck公司）；超純水（Milli-Q超純水系統(tǒng)制備）；其余試劑均為分析純。

6 種飲片均經(jīng)南京中醫(yī)藥大學嚴輝副教授鑒定，黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus(Fisch.) Bge.var.mongholicus (Bge.)Hsiao 的干燥根；桂枝為樟科植物肉桂Cinnamomum cassiaPresl 的干燥嫩枝；白芍為毛茛科芍藥屬植物芍藥Paeonia lactifloraPall.的干燥根；生姜為姜科植物姜Zingiber officinaleRose.的新鮮根莖；大棗為鼠李科植物棗Ziziphus jujubeMill.的干燥成熟果實；甘草為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的干燥根和根莖。并依照《中國藥典》2020 年版各項下方法檢測，飲片質(zhì)量均符合規(guī)定，樣品信息見表1。

表1 藥材產(chǎn)地及批號Table 1 Batch number of origin of medicinal materials

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜與質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件 采用Hypersil ODS 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈（A）-0.2%甲酸（B）為流動相，梯度洗脫程序為：0～25 min，15%～32%A；25～60 min，32%～70% A；檢測波長250 nm，體積流量1.0 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量10 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 離子源為電噴霧離子化源（ESI），采用正、負離子模式檢測；掃描范圍m/z50～1500；噴霧電壓5500 V；離子噴霧空載電壓5500 V；解簇電壓100 V；碰撞能量10 V；離子源溫度550 ℃；霧化器壓力413 kPa；輔助加熱器壓力413 kPa；氣簾氣壓力275 kPa。

2.2 對照品溶液的制備

取對照品毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷、芒柄花素、芒柄花苷、丙二酰毛蕊異黃酮苷、丙二酰芒柄花苷、丙二酰黃芪皂苷I、黃芪皂苷I、黃芪甲苷、桂皮醛、甘草苷、甘草酸銨、6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚、芍藥苷、異甘草苷、芹糖甘草苷、芹糖異甘草苷、烏拉爾皂苷B、甘草皂苷G2 適量，精密稱定，加甲醇適量，混勻，配制成混合對照品母液。

2.3 供試品溶液的制備

稱取黃芪90 g、生姜45 g、桂枝45 g、白芍45 g、大棗45 g、甘草30 g，回流提取2 次，第1 次加入10 倍量水，提取2 h，濾過；第2 次加入8 倍量水，提取1 h，濾過，合并濾液。60 ℃減壓濃縮至含生藥2 g/mL，真空冷凍干燥12 h，粉碎成中粉。精密稱取凍干粉末1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率240 W、頻率45 kHz）15 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過。取續(xù)濾液，0.22 μm 微孔濾膜濾過，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗 取S1 號樣品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，以19號峰的保留時間和峰面積作為參考，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。20 個共有峰相對保留時間的RSD 小于1%，相對峰面積的RSD 小于3%，表明儀器和試驗方法精密度良好。

2.4.2 重復性試驗 取S1 號樣品6 份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件分別進樣，以19 號峰的保留時間和峰面積作為參考，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。20 個共有峰相對保留時間的RSD 小于1%，相對峰面積的RSD 小于5%，表明該方法重復性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 取S1 號樣品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h 內(nèi)按“2.1”項下色譜條件進行測定，以19 號峰的保留時間和峰面積作為參考，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。20 個共有峰相對保留時間的RSD 小于1%，相對峰面積的RSD 小于3%，說明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 指紋圖譜的建立

2.5.1 共有峰標記 以“2.3”項下方法制備的10批JHD 供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，將數(shù)據(jù)導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”2012 版軟件進行分析，共選取20 個共有峰，對照圖譜采用“中位數(shù)”法生成，使用多點校正對色譜峰進行匹配。JHD 的HPLC 對照指紋圖譜見圖1，10 批供試品溶液的指紋圖譜見圖2。

圖1 JHD 的HPLC 對照指紋圖譜Fig.1 Reference HPLC fingerprint of JHD

圖2 10 批JHD 的HPLC 指紋圖譜Fig.2 HPLC fingerprints of 10 batches of JHD

2.5.2 相似度評價 10 批JHD 與對照指紋圖譜相似度分別為0.920～0.990，具體數(shù)據(jù)見表2。

表2 10 批JHD 的指紋圖譜相似度Table 2 HPLC fingerprints of 10 batches of JHD

2.5.3 共有峰的指認及相關(guān)分析 按“2.3”項下方法制備的各單味藥供試品溶液，以及缺少各單味藥的陰性供試品溶液（S1 中各批次單味藥及陰性樣品），以“2.1”項下色譜條件進行測定，見圖3，通過比對其保留時間、陰性樣品色譜圖，確定JHD 指紋圖譜中的20 個特征峰在6 味藥材中的歸屬，并與混合對照品溶液比對，確定了其中11 個成分，其中3（毛蕊異黃酮苷）、7（丙二酰毛蕊異黃酮苷）、11（芒柄花苷）號峰來源于黃芪；9、12、13、14（桂皮醛）、17 號峰來源于桂枝；1、2（芍藥苷）、6、8號峰來源于白芍；4（芹糖甘草苷）、5（甘草苷）、10（芹糖異甘草苷）、15、16、18（甘草皂苷G2）、19（甘草酸）、20（烏拉爾甘草B）號峰來源于甘草。

圖3 單味藥與JHD 的HPLC 指紋圖譜對比Fig.3 Comparison of HPLC fingerprints of single herb and JHD

2.6 質(zhì)譜定性分析

為了更為全面地解析JHD中化學成分的組成，采用LC-Q-TOF/MS 正、負離子模式獲得JHD 指紋圖譜中化合物的質(zhì)譜信息見圖4，并采用對照品對色譜峰進行確認，同時結(jié)合處方中各藥材化學成分研究相關(guān)文獻報道[11-17]，建立了各單味藥成分的化合物數(shù)據(jù)庫，共鑒定了70 個化合物，見表3。

圖4 JHD 的正離子 (A) 和負離子 (B) BPI 圖Fig.4 Base peak intensity (BPI) diagram of positive (A) and negative (B) of JHD

表3 JHD 中化學成分定性分析Table 3 Qualitative analysis of chemical constituents of JHD

續(xù)表3

續(xù)表3

選擇代表性化合物對成分結(jié)構(gòu)鑒定過程進行解析。其中，黃酮類化合物在正離子模式下響應(yīng)較高，同時可以檢測到豐富二級碎片離子峰，進一步依據(jù)它們的準分子離子峰及碎片離子進行了結(jié)構(gòu)鑒定。以15 號峰（tR=10.744 min）毛蕊異黃酮苷為例，其準分子離子峰為m/z447.130 3 [M+H]+，在誤差范圍內(nèi)計算得到的分子式為C22H22O10，在二級質(zhì)譜圖中，可見碎片離子m/z285.070 6 [M+H-Glc]+，再失去B 環(huán)上CH3得到m/z270.052 1[M+H-Glc-CH3]+，或失去1 分子 -CH3OH 得到m/z253.048 7 [M+H-Glc-CH3OH]+，其裂解規(guī)律如圖5 所示。

圖5 毛蕊異黃酮苷在正離子模式下裂解規(guī)律圖Fig.5 Fragmentation of mass spectra of calycosin-7-glucoside in positive ion mode

三萜皂苷類化合物具有多氫蒎的五環(huán)母核，以峰46 甘草皂苷G2 為例，在正離子模式下，其準分子離子峰為m/z839.407 4 [M+H]+，確定其分子式為C42H62O17，進一步在其二級質(zhì)譜圖中，從分子離子峰失去1 分子葡萄糖醛酸基及同時失去2 分子葡萄糖醛酸基，形成m/z663.377 6 [M+H-GlcA]+及苷元碎片離子m/z487.341 9 [M+H-2GlcA]+，苷元碎片離子m/z487.341 9 由于結(jié)構(gòu)中3-OH 的性質(zhì)活潑，很容易失去H2O 形成基峰 [B]+，相對分子質(zhì)量為m/z469.330 9 [aglycone+H-H2O]+，進一步同時或連繼丟失中性分子H2O 及CH2O，形成碎片離子m/z451.321 6 [B-H2O]+及m/z439.321 9 [BCH2O]+，其裂解規(guī)律見圖6。

圖6 甘草皂苷G2 在正離子模式下裂解規(guī)律Fig.6 Fragmentation of mass spectra of licorice saponin G2 in positive ion mode

芍藥苷（峰14）是白芍中一類蒎烷單萜苷，在JHD 中含量相對較高，其在負離子模式下，呈現(xiàn)加甲酸的準分子離子峰m/z525.159 1 [M+HCOO]-，二級質(zhì)譜圖中見m/z479.154 2 [M-H]-，以及失去1 分子甲醛形成的碎片離子m/z449.142 8 [M-HCH2O]-，進一步可分別形成苯甲酸碎片離子峰m/z121.030 0 及失去苯甲酸的m/z327.108 2 [M-HCH2O-C7H6O2]-碎片離子；而m/z165.054 6 碎片離子則為蒎烷結(jié)構(gòu)所形成的特征碎片離子，其裂解規(guī)律見圖7。

圖7 芍藥苷在負離子模式下裂解規(guī)律Fig.7 Fragmentation of mass spectra of paeoniflorin in negative ion mode

3 討論

10 批JHD 指紋圖譜中，不同批次樣品之間的相似度波動范圍較大，從各樣品的指紋圖譜中，可以發(fā)現(xiàn)峰12、13 具有明顯差異，成分歸屬結(jié)果顯示峰12 與峰13 來源于桂枝。進一步分析樣品來源發(fā)現(xiàn)，S1～S3 號樣品中所用的桂枝來自廣西省貴港市，其余樣品中的桂枝均來自廣西省北海市。除產(chǎn)地差異外，桂枝藥材商品規(guī)格等級也不同，貴港市的為桂枝中粒，北海市的為桂枝小粒，而不同規(guī)格等級的藥材，其活性成分的含量存在差異[18-19]。因此，在中藥方劑以及中成藥的質(zhì)量標準的制定過程中，需要保證所用的原藥材的質(zhì)量穩(wěn)定可靠[20]，嚴格控制藥材的來源以及所采用的規(guī)格等級，從而能夠提高中藥方劑與中成藥藥效的穩(wěn)定性。

JHD 指紋圖譜研究中標定出20 個共有峰，均明確了其相應(yīng)藥味的歸屬，其中源于桂枝的共有峰9、12、13、14（桂皮醛）、17 在質(zhì)譜中未被檢測到。這可能是因為桂皮醛等成分具有較強的揮發(fā)性，成分在進入質(zhì)譜檢測時經(jīng)電噴霧離子化加熱過程中因揮發(fā)而損失，因此未能體現(xiàn)在質(zhì)譜信息中，相關(guān)文獻也報道了類似的結(jié)果[21]。

在JHD 質(zhì)譜鑒定的70 個成分中，來自黃芪和甘草飲片中的成分多為黃酮類（28 個）及三萜類（23個）化合物，白芍中以單萜苷類（5 個）及有機酸類化合物（5 個）為主，生姜中主要以姜辣素類（5個）成分為主，而大棗中鑒定出的化合物相對較少，可能是由于大棗中主要功效物質(zhì)為大極性的糖類組分，質(zhì)譜鑒定存在一定困難。此外，質(zhì)譜圖中一些響應(yīng)較好的成分如黃芪甲苷由于結(jié)構(gòu)中沒有共軛體系，紫外吸光系數(shù)低，因而在HPLC-UV 指紋圖譜中未能體現(xiàn)。黃芪為方中的君藥，其皂苷類化合物具有抗菌、強心、免疫調(diào)節(jié)等作用[22]，因此可針對這些皂苷類成分的結(jié)構(gòu)特點，建立HPLC-ELSD 指紋圖譜或多成分含量測定，完善對JHD 的質(zhì)量控制。

本研究中采用的質(zhì)譜檢測方法其靈敏度高，依據(jù)豐富的質(zhì)譜信息結(jié)合對照品及文獻，能夠鑒定出較多的化學成分，可以較為全面地反映JHD 中的化學成分信息；而HPLC 指紋圖譜是目前控制中藥復方整體質(zhì)量的常用方法，儀器設(shè)備相對于質(zhì)譜來說可及性較好，比較適用于常規(guī)分析與檢驗，二者相結(jié)合，既可從總體上反映JHD 中所含化學成分的信息，又體現(xiàn)了處方中各藥味在方中的貢獻，為其質(zhì)量控制及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突