茶藤生物堿成分的分離鑒定及抗腫瘤活性研究

何琴慧 ，姜雨辰，王文玲，李麗梅

1.西南民族大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 610041

2.成都醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610500

茶藤M(fèi)elodinus magnificusTsiang 是夾竹桃科（Apocynaceae）山橙屬M(fèi)elodinusJ.R.Forst.&G.Forst.的攀援木質(zhì)藤本植物，俗稱大山橙。主要分布在中國(guó)廣西等地，多生長(zhǎng)于山地疏林或山坡向陽(yáng)處，為我國(guó)特有植物，其葉揉制作茶飲料，有興奮作用[1]，也具有清熱排毒、利喉消腫、抗菌消炎等作用[2]。目前僅見(jiàn)1 篇文獻(xiàn)報(bào)道從廣西壯族自治區(qū)上思縣的茶藤中分離得到4 個(gè)單萜吲哚生物堿[2]。本研究組在預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)茶藤的總生物堿浸膏對(duì)腫瘤細(xì)胞（人肝癌HepG2 細(xì)胞、乳腺癌MCF7 細(xì)胞和人肺癌A549 細(xì)胞）增殖有一定的抑制作用，因此，為進(jìn)一步在該植物中發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)各異且潛在的具有抗腫瘤活性的生物堿成分，本研究通過(guò)常規(guī)的天然藥物化學(xué)方法提取分離純化茶藤生物堿成分，采用核磁、質(zhì)譜等波譜技術(shù)鑒定化合物的結(jié)構(gòu)，得到的10 個(gè)化合物分別為strictamine（1）、deacetylakuammiline（2）、19-(Z)-akuammidine（3）、14,15-didehydrovincamine（4）、14,15-didehydro-16-epi-vincamine（5）、19-(S)-methoxy tubotaiwine（6）、19-(R)-methoxy-tubotaiwine（7）、rhazimine（8）、rhazicineN4-oxide（9）和rhazicine（10）；所有化合物均為首次從該植物中分離得到，化學(xué)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。并采取MTT 法篩選化合物的抗腫瘤活性，以及結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)預(yù)測(cè)具有抗腫瘤活性的生物堿的靶點(diǎn)和通路。

圖1 化合物1～10 的結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of compounds 1—10

1 儀器與材料

Brucker AV 400 核磁共振儀（瑞士Bruker 公司）；Bruker Micro TOF QII 質(zhì)譜儀（瑞士Bruker 公司）；薄層色譜硅膠板（GF254，青島海洋化工有限公司）；正相硅膠（100～200、200～300 目，青島海洋化工有限公司）；反相硅膠（RP-18，德國(guó)Merck公司）；堿性氧化鋁硅膠（100～200、200～300 目，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；葡聚糖凝膠（Sephadex LH-20 gel，美國(guó)GE 公司）；紫杉醇（PTX，購(gòu)自Sigma 公司）。

植物樣品于2018 年8 月采自云南省文山州，由昆明植分生物技術(shù)有限公司張君高級(jí)工程師鑒定為夾竹桃科山橙屬植物茶藤M(fèi).magnificusTsiang 枝葉，標(biāo)本（LMMM1808）保存在西南民族大學(xué)藥學(xué)院。

2 提取與分離

茶藤枝葉干質(zhì)量50 kg，粉碎后，選用100 L 工業(yè)級(jí)甲醇60 ℃提取3 次，每次3 h，將提取液進(jìn)行合并和濾過(guò)，并減壓濃縮直至無(wú)醇后得到醇提物。醇提物經(jīng)10 L 反滲水稀釋后，用5% HCl 將pH 值調(diào)至1～2，并使用等體積的醋酸乙酯萃取3 次，水層用NaOH 將pH 值調(diào)至9～10，并使用等體積的氯仿連續(xù)萃取4 次，減壓濃縮氯仿層，得到總生物堿53 g。

稱取總生物堿約50 g，通過(guò)200～300 目堿性氧化鋁硅膠柱，用氯仿-甲醇（100∶0～0∶100）梯度洗脫，合并稱取總生物堿約50 g，通過(guò)200～300目堿性氧化鋁硅膠柱，用氯仿-甲醇（100∶0～0∶100）梯度洗脫，合并相同組分后分為3 個(gè)組分Fr.1～3。組分Fr.1（21.7 g）以甲醇-水（10%～60%）進(jìn)行反相柱色譜梯度洗脫，10%～20%甲醇部分記為Fr.1.1（3.0 g），30%甲醇部分記為Fr.1.2（1.8 g），40%甲醇部分記為Fr.1.3（1.4 g），50%～60%甲醇部分記為Fr.1.4（7.0 g）。Fr.1.1 經(jīng)過(guò)Sephadex LH-20（甲醇）柱色譜，得到化合物4（20 mg）。Fr.1.2 經(jīng)過(guò)醋酸乙酯-甲醇（5∶1～1∶1）正相硅膠柱分離得到合物9（394膠柱色譜 [石油醚-醋酸乙酯（15∶1～1∶1）]，接著采用制備薄層色譜法[氯仿-甲醇（10∶1）]得到化合物5（12 mg）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：黃色無(wú)定形粉末，易溶于三氯甲烷；在紫外波長(zhǎng)254 nm 下觀察到暗斑，碘化鉍鉀反應(yīng)呈陽(yáng)性。ESI-MSm/z: 323 [M+H]+，分子式C20H22N2O2。1H-NMR (400 MHz,CDCl3)δ: 1.54 (3H,dd,J=7.0,2.3 Hz,H-18),1.73 (1H,dd,J=13.8,2.6 Hz,H-6b),2.01 (1H,dd,J=14.7,4.8 Hz,H-14b),2.07 (1H,d,J=3.8 Hz,H-16),2.57 (1H,m,H-14a),2.64～2.76 (3H,m,H-5,6a),3.11 (1H,d,J=17.0 Hz,H-21b),3.71 (1H,m,H-15),3.73 (3H,s,22-OMe),4.05 (1H,d,J=17.0 Hz,H-21a),4.68 (1H,d,J=5.1 Hz,H-3),5.51 (1H,q,J=6.9 Hz,H-19),7.16 (1H,t,J=7.6 Hz,H-10),7.33 (1H,t,J=7.5 Hz,H-11),7.42(1H,d,J=7.4 Hz,H-12),7.62 (1H,d,J=7.7 Hz,H-9)；13C-NMR (100 MHz,CDCl3) 數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。上述結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)基本一致[3-4]，故鑒定化合物1 為strictamine。

化合物2：黃色無(wú)定形粉末，易溶于三氯甲烷；在紫外波長(zhǎng)254 nm 下觀察示暗斑，碘化鉍鉀反應(yīng)呈陽(yáng)性。ESI-MSm/z: 353 [M+H]+，分子式C21H24N2O3。1H-NMR (400 MHz,CDCl3)δ: 1.62 (3H,dd,J=7.1,2.2 Hz,H-18),1.88 (1H,dd,J=14.4,4.4 Hz,H-14b),2.02 (1H,dd,J=14.7,3.9 Hz,H-5b),2.41 (1H,ddd,J=14.4,4.8,2.5 Hz,H-14a),2.66 (2H,ddd,J=17.8,14.2,5.1 Hz,H-6),2.86,2.98 (各1H,d,J=12.3 Hz,H-17),3.11 (1H,d,J=17.0 Hz,H-21b),3.63 (1H,m,H-15),3.66 (1H,m,H-5a),3.82 (3H,s,mg）。Fr.1.3 經(jīng)過(guò)醋酸乙酯-甲醇（50∶1～1∶1）正相硅膠柱得到化合物1（196 mg）、6 和7（27 mg）。Fr.1.4 利用石油醚-丙酮（4∶1～1∶2）正相硅膠柱分離得到Fr.1.4.1（20 mg）和Fr.1.4.2（20 mg）2個(gè)部分。Fr.1.4.1 采用氯仿-甲醇（10∶1）制備薄層色譜法得到化合物3（12 mg），F(xiàn)r.1.4.2 采用醋酸乙酯-甲醇（10∶1）制備薄層色譜法得到生物堿類化合物2（10 mg）。組分Fr.2（4.0 g）經(jīng)過(guò)Sephadex LH-20（甲醇）柱色譜得到Fr.2.1（2.8 g）和Fr.2.2（1.0 g）。Fr.2.1 經(jīng)過(guò)醋酸乙酯-甲醇（100∶0～50∶1）硅膠柱色譜，得到化合物10（100 mg）。Fr.2.2經(jīng)過(guò)制備薄層色譜 [醋酸乙酯-甲醇（10∶1）]得到合物8（134 mg）。組分Fr.3（8.0 g）先經(jīng)過(guò)正相硅22-OMe),4.10 (1H,brd,J=17.0 Hz,H-21a),4.57(1H,d,J=4.5 Hz,H-3),5.44 (1H,q,J=6.9 Hz,H-19),7.16 (1H,t,J=7.5 Hz,H-10),7.32 (1H,t,J=7.6 Hz,H-11),7.51 (1H,d,J=7.5 Hz,H-12),7.61(1H,d,J=7.7 Hz,H-9)；13C-NMR (100 MHz,CDCl3)數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。上述結(jié)果與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)基本一致[3,5]，故鑒定化合物2 為deacetylakuammiline。

化合物3：白色無(wú)定形粉末，不溶于三氯甲烷，易溶于甲醇；在紫外波長(zhǎng)254 nm 下觀察到暗斑，碘化鉍鉀反應(yīng)呈陽(yáng)性。ESI-MSm/z: 353 [M+H]+，分子式C21H24N2O3。1H-NMR (400 MHz,MeOH-d4)δ: 1.68 (3H,d,J=6.8 Hz,H-18),1.90 (1H,t,J=11.6 Hz,H-14b),2.69 (1H,dd,J=11.6,2.4 Hz,H-14a),2.80 (1H,brs,H-5),2.81 (1H,m,H-6a),2.94 (3H,s,22-OMe),3.31 (1H,d,J=3.2 Hz,H-15),3.40 (1H,m,H-6b),3.51 (1H,d,J=16.9 Hz,H-21b),3.60 (1H,m,H-21a),3.66 (1H,d,J=9.7 Hz,H-17b),3.78 (1H,d,J=9.7 Hz,H-17a),4.22 (1H,d,J=9.8 Hz,H-3),5.45(1H,q,J=6.5 Hz,H-19),6.96 (1H,t,J=7.5 Hz,H-10),7.04 (1H,t,J=7.5 Hz,H-11),7.27 (1H,d,J=8.0 Hz,H-12),7.37 (1H,d,J=7.7 Hz,H-9)；13C-NMR (100 MHz,MeOH-d4) 數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。上述結(jié)果與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)基本一致[6]，故鑒定化合物3 為19-(Z)-akuammidine。

表1 化合物1～3、5～10 的13C-NMR 波譜數(shù)據(jù)Table 1 13C-NMR data of compounds 1—3,5—10

化合物4：白色無(wú)定形粉末；在紫外波長(zhǎng)254 nm下觀察到暗斑，碘化鉍鉀反應(yīng)呈陽(yáng)性。ESI-MSm/z:353 [M+H]+，分子式C21H24N2O3。1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ: 0.92 (3H,t,J=7.5 Hz,H-18),1.52 (1H,dq,J=14.7,7.4 Hz,H-19b),1.84 (1H,dq,J=14.7,7.4 Hz,H-19a),2.15 (1H,d,J=14.2 Hz,H-17b),2.36 (1H,d,J=14.2 Hz,H-17a),2.44 (1H,dd,J=15.8,5.2 Hz,H-6b),2.84 (1H,d,J=17.3 Hz,H-3b),2.95 (1H,m,H-3a),3.02 (1H,m,H-6a),3.25(2H,m,H-5),3.72 (3H,s,22-OMe),3.97 (1H,s,H-21),5.38 (1H,dt,J=10.3,2.8 Hz,H-14),5.67 (1H,d,J=10.3 Hz,H-15),6.56 (1H,s,OH),6.97～7.04(3H,m,H-10～12),7.37 (1H,m,H-9)；以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)基本一致[7]，故鑒定化合物4 為14,15-didehydrovincamine。

化合物5：黃色無(wú)定形粉末，易溶于三氯甲烷；在紫外波長(zhǎng)254 nm 下觀察到暗斑，碘化鉍鉀反應(yīng)呈陽(yáng)性。ESI-MSm/z: 353 [M+H]+，分子式C21H24N2O3。1H-NMR (400 MHz,CDCl3)δ: 0.93 (3H,t,J=7.5 Hz,H-18),1.44 (1H,dd,J=13.7,7.3 Hz,H-19a),1.78 (1H,dd,J=13.7,7.3 Hz,H-19b),2.01(1H,d,J=14.2 Hz,H-17a),2.50 (1H,m,H-6a),2.60(1H,m,H-17b),3.01 (1H,m,H-3a),3.04 (1H,m,H-6b),3.17 (1H,m,H-3b),3.24 (1H,m,H-5a),3.38(1H,dd,J=13.8,6.9 Hz,H-5b),3.47 (3H,s,22-OMe),3.77 (1H,s,H-21),5.24 (1H,d,J=10.2 Hz,H-15),5.46 (1H,dt,J=10.2,3.0 Hz,H-14),7.07(1H,m,H-10),7.13 (1H,m,H-11),7.39 (1H,m,H-9),7.50 (1H,m,H-12)；13C-NMR (100 MHz,CDCl3) 數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)基本一致[8]，故鑒定化合物5 為14,15-didehydro-16-epi-vincamine。

化合物6：黃色無(wú)定形粉末，易溶于三氯甲烷；在紫外波長(zhǎng)254 nm 下觀察到暗斑，碘化鉍鉀反應(yīng)呈陽(yáng)性。ESI-MSm/z: 355 [M+H]+，分子式C21H26N2O3。1H-NMR (400 MHz,CDCl3)δ: 0.94 (3H,d,J=6.0 Hz,H-18),1.80 (2H,m,H-14),1.89 (1H,m,H-6a),2.04 (1H,m,H-20),2.50 (2H,m,H-3a,19),2.86 (2H,m,H-5b,6b),2.99 (3H,s,19-OMe),3.08(2H,m,H-3b,5a),3.46 (1H,brs,H-15),3.85 (3H,s,22-OMe),3.96 (1H,brs,H-21),6.81 (1H,d,J=7.7 Hz,H-12),6.89 (1H,t,J=7.1 Hz,H-10),7.10 (1H,m,H-11),7.16 (1H,d,J=7.4 Hz,H-9),8.93 (1H,s,NH)；13C-NMR (100 MHz,CDCl3) 數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[9]，故鑒定化合物6 為19-(S)-methoxytubotaiwine。

化合物7：黃色無(wú)定形粉末，易溶于三氯甲烷；在紫外波長(zhǎng)254 nm 下觀察到暗斑，碘化鉍鉀反應(yīng)呈陽(yáng)性。ESI-MSm/z355 [M+H]+，分子式C21H26N2O3。1H-NMR (400 MHz,CDCl3)δ: 0.89 (3H,d,J=5.9 Hz,H-18),1.80 (2H,m,H-14),1.89 (1H,m,H-6a),2.04 (1H,m,H-20),2.40 (1H,m,H-19),2.50(1H,m,H-3a),2.65 (3H,s,19-OMe),2.86 (2H,m,H-5b,6b),3.07 (1H,brs,H-15),3.08 (2H,m,H-3b,5a),3.85 (3H,s,22-OMe),4.37 (1H,brs,H-21),6.81(1H,d,J=7.7 Hz,H-12),6.89 (1H,t,J=7.1 Hz,H-10),7.10 (1H,m,H-11),7.22 (1H,d,J=7.3 Hz,H-9),8.82 (1H,s,NH)；13C-NMR (100 MHz,CDCl3)見(jiàn)表1?；衔? 與6 的核磁數(shù)據(jù)相似，推測(cè)其互為差向異構(gòu)體，且與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)基本一致[9]，故鑒定化合物7 為19-(R)-methoxytubotaiwine。

化合物8：白色無(wú)定形粉末，易溶于三氯甲烷；在紫外波長(zhǎng)254 nm 下觀察到暗斑，碘化鉍鉀反應(yīng)呈陽(yáng)性。ESI-MSm/z: 351 [M+H]+，分子式C21H22N2O3。1H-NMR (400 MHz,CDCl3)δ: 1.58 (3H,dd,J=7.1,2.3 Hz,H-18),2.10 (1H,d,J=14.9 Hz,H-14b),2.48 (1H,ddd,J=14.9,5.4,2.7 Hz,H-14a),2.80 (1H,dd,J=15.7,3.2 Hz,H-5b),2.94～3.12 (2H,m,H-6),3.24 (1H,d,J=17.3 Hz,H-21b),3.52 (3H,s,22-OMe),3.76 (1H,m,H-15),3.77 (1H,m,H-5a),3.90 (1H,d,J=5.1 Hz,H-3),4.11 (1H,d,J=17.3 Hz,H-21a),5.57 (1H,q,J=6.6 Hz,H-19),7.32～7.43 (4H,m,H-9-12),7.70 (1H,s,H-17)；13C-NMR(100 MHz,CDCl3) 數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[3-4]，故鑒定化合物8 為rhazimine。

化合物9：黃色無(wú)定形粉末，易溶于甲醇；在紫外波長(zhǎng)254 nm 下觀察到暗斑，碘化鉍鉀反應(yīng)呈陽(yáng)性。ESI-MSm/z385 [M+H]+，分子式C21H24N2O5。1H-NMR (400 MHz,MeOH-d4)δ: 1.57 (3H,dd,J=7.0,2.3 Hz,H-18),2.37 (1H,d,J=14.6 Hz,H-6a),2.64 (2H,m,H-6b,14a),3.00 (1H,m,H-14b),3.48(1H,dd,J=11.5,4.5 Hz,H-5a),3.58 (3H,s,22-OMe),3.77 (1H,m,H-15),3.83 (1H,m,H-3),4.05 (1H,d,J=15.5 Hz,H-5b),4.20 (1H,t,J=14.5 Hz,H-21a),4.30 (1H,d,J=14.5 Hz,H-21b),5.06 (1H,s,H-17),5.67 (1H,q,J=6.7 Hz,H-19),6.57 (1H,m,H-10),6.79(1H,m,H-11),7.07 (1H,d,J=7.1 Hz,H-12),7.28 (1H,d,J=7.8 Hz,H-9)；13C-NMR (100 MHz,MeOH-d4) 見(jiàn)表1。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)基本一致[10]，故鑒定化合物9為rhazicineN4-oxide。

化合物10：黃色無(wú)定形粉末，易溶于三氯甲烷；在紫外波長(zhǎng)254 nm 下觀察到暗斑，碘化鉍鉀反應(yīng)呈陽(yáng)性。ESI-MSm/z369 [M+H]+，分子式C21H24N2O4。1H-NMR (400 MHz,CDCl3)δ: 1.48 (3H,m,H-18),1.95 (1H,d,J=18.0 Hz,H-14a),2.40 (2H,m,H-6b,14b),2.92 (1H,d,J=11.9 Hz,H-6a),2.97(1H,m,H-5b),3.15 (1H,d,J=16.4 Hz,H-21a),3.53(3H,s,22-OMe),3.63 (2H,m,H-5a,15),3.71 (1H,m,H-3),4.04 (1H,d,J=16.4 Hz,H-21b),4.91 (1H,s,H-17),5.47 (1H,m,H-19),6.56 (1H,d,J=7.6 Hz,H-12),6.79 (1H,m,H-10),7.07 (1H,m,H-11),7.19(1H,d,J=7.4 Hz,H-9)；13C-NMR (100 MHz,CDCl3)數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)基本一致[3-4]，故鑒定化合物10 為rhazicine。

4 抗腫瘤活性

4.1 腫瘤細(xì)胞毒活性篩選

用胰酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，離心收集細(xì)胞（離心條件是5 min、800 r/min），棄去上清液，稀釋細(xì)胞懸液25 倍，并計(jì)數(shù)，于96 孔培養(yǎng)板中以5×103個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種，每孔的體積為200 μL。在培養(yǎng)箱中放置接種好的96 孔培養(yǎng)板并培養(yǎng)24 h，加入PBS 進(jìn)行清洗，更換為含1%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基并加入待測(cè)化合物。實(shí)驗(yàn)組化合物和陽(yáng)性對(duì)照藥物紫杉醇（PTX，購(gòu)自Sigma 公司）的濃度設(shè)置為31.25、62.50、125.00、250.00、1 000.00 nmol/L，對(duì)照組加等體積的空白培養(yǎng)基，并設(shè)置空白組以扣除背景影響，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次，各組分別設(shè)定6 個(gè)復(fù)孔。

按上述實(shí)驗(yàn)分組處理培養(yǎng)48 h，緊接著每孔加入5 mg/mL 的 MTT 溶液10 μL，用手振蕩30 s，然后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，緩慢的吸去培養(yǎng)液中的上清液，并向96 孔培養(yǎng)板中每孔加入100 μL的DMSO，常溫避光振搖5 min，等甲臜結(jié)晶完全溶解后，用酶標(biāo)儀在490 nm/570 nm 處檢測(cè)吸光度（A）值。根據(jù)檢測(cè)到的A值計(jì)算細(xì)胞存活率，最后利用細(xì)胞存活率作為縱坐標(biāo)（Y），濃度的對(duì)數(shù)值作為橫坐標(biāo)（X），作回歸曲線，計(jì)算IC50值。

細(xì)胞存活率=(A實(shí)驗(yàn)-A空白)/(A對(duì)照-A空白)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，化合物1 和9 對(duì)A549 和HepG2細(xì)胞有顯著的抑制作用，化合物4 對(duì)MCF7 細(xì)胞有顯著的抑制作用，化合物5 對(duì)A549 和MCF7 細(xì)胞有明顯的抗增殖活性，化合物6 和7 對(duì)A549 細(xì)胞有明顯的抗增殖活性，化合物8 對(duì)A549、HepG2和MCF7 細(xì)胞有明顯的抗增殖活性。其中化合物8對(duì)MCF7 細(xì)胞的細(xì)胞毒活性最強(qiáng)，IC50值為0.40 μmol/L。如表2 所示，以上對(duì)腫瘤細(xì)胞有抑制作用的化合物的IC50值均小于陽(yáng)性對(duì)照PTX。其他化合物沒(méi)有抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性（IC50＞50 μmol/L）。

表2 生物堿化合物腫瘤細(xì)胞毒活性結(jié)果 (n=3)Table 2 Cytotoxicity results of compounds against tumor cells (n=3)

4.2 抗腫瘤潛在靶點(diǎn)和通路

4.2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析 將化合物導(dǎo)入Pharmmaper 網(wǎng)站進(jìn)行反向找靶的初步篩選，緊接著使用String 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行靶標(biāo)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)也就是PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，接著利用Metascape 網(wǎng)站進(jìn)行GO 分析和KEGG 通路富集，然后采用Cytoscape軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)分析以及構(gòu)建“化合物-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析[11-13]。

4.2.2 分子對(duì)接 利用AutoDock Vina 進(jìn)行分子對(duì)接模擬，并采用PyMol 制作化合物4 與蛋白R(shí)XRA的結(jié)合模式圖[11,14]。

4.2.3 化合物-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建圖 “化合物-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖中節(jié)點(diǎn)顏色由綠到紅表示Degree逐步升高，Degree 越高說(shuō)明該靶點(diǎn)蛋白在網(wǎng)絡(luò)中占有較大比例，分別調(diào)控多條癌癥通路[13]。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)分析可知靶點(diǎn)蛋白R(shí)XRA（degree=8）、SRC（degree=7）、MAPK1（degree=6）和PIK3R1（degree=6）是該網(wǎng)絡(luò)中占主要地位的靶點(diǎn)蛋白，是化合物發(fā)揮抗腫瘤作用的最關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白（圖2）。

圖2 化合物1、4～9 的化合物-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Compound-target-pathway network of compounds 1 and 4—9

4.2.4 分子對(duì)接結(jié)果 分子對(duì)接結(jié)果顯示，在化合物和蛋白質(zhì)對(duì)接過(guò)程中均進(jìn)入活性位點(diǎn)，并且形成1～3 個(gè)氫鍵?；衔?、4～9 分別對(duì)蛋白R(shí)XRA、SRC、MAPK1、PIK3R1 均具有較好的結(jié)合能力，表明化合物可能通過(guò)作用于這4 個(gè)蛋白發(fā)揮抗腫瘤作用。其中化合物4 與蛋白R(shí)XRA 的結(jié)合能最低，結(jié)合能為-46.75 kJ/mol，表明化合物4 與蛋白R(shí)XRA的結(jié)合能力最強(qiáng)。

利用PyMol 制作化合物4 與蛋白R(shí)XRA 的結(jié)合模式圖，見(jiàn)圖3。灰色部分是蛋白R(shí)XRA，黃色部分是化合物4。蛋白R(shí)XRA 與化合物4 通過(guò)氫鍵結(jié)合，分析表明化合物與RXRA 共形成2 個(gè)氫鍵：RXRA 蛋白上LYS-175 的羰基和化合物4 上的羥基形成1 個(gè)氫鍵，鍵長(zhǎng)為0.27 nm；TYR-189 的羥基與化合物4 上的羰基形成1 個(gè)氫鍵，鍵長(zhǎng)為0.23 nm。

圖3 化合物4 和蛋白R(shí)XRA 分子對(duì)接結(jié)果Fig.3 Molecular docking results of compound 4 and RXRA

5 討論

本研究通過(guò)常規(guī)天然藥物化學(xué)方法從茶藤中分離鑒定10 個(gè)生物堿化合物，并且通過(guò)MTT 法和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選出7個(gè)具有抗腫瘤活性的生物堿化合物。“化合物-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)結(jié)果顯示化合物1 和化合物4～9 主要通過(guò)基因RXRA、SRC、MAPK1和PIK3R1作用于非小細(xì)胞肺癌、肝癌和乳腺癌3 條腫瘤通路。RXRA、SRC、MAPK1 和PIK3R1 蛋白都能夠參與細(xì)胞的分化、生長(zhǎng)與發(fā)育等許多關(guān)鍵的生理過(guò)程，從而調(diào)控腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[15-18]。

吲哚環(huán)結(jié)構(gòu)可能是茶藤生物堿化合物發(fā)揮抗腫瘤活性的必要結(jié)構(gòu)，不同類型的取代基可能會(huì)對(duì)吲哚環(huán)發(fā)揮體外抗腫瘤活性產(chǎn)生不同的影響[19-20]。給電子基，如羥基、甲氧基等，減弱化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抗增殖活性；吸電子基，如羰基、酯基等，增強(qiáng)化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抗增殖活性[21]。化合物4 由于具有吸電子作用的酯基和平面的五元環(huán)結(jié)構(gòu)使得抗腫瘤活性增強(qiáng)，且與蛋白質(zhì)結(jié)合的能量最低，是最具有潛在抗腫瘤活性的化合物。

本研究中所有單萜吲哚生物堿成分均為首次從茶藤中分離得到，豐富了該植物化學(xué)成分的多樣性。另外，從細(xì)胞水平和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)層面初步探討了這些生物堿化合物的抗腫瘤活性，研究結(jié)果為茶藤中抗腫瘤活性成分的發(fā)現(xiàn)奠定了基礎(chǔ)。后續(xù)將在此基礎(chǔ)上進(jìn)行更深入的體外、體內(nèi)作用機(jī)制研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突