栽培奇楠沉香化學(xué)成分及其抗炎活性研究

張 琳 ，王 昊，董文化，李 薇，云翠鴻，袁靖喆，蔡彩虹，吳 妃，梅文莉，戴好富*，李震宇

1.山西大學(xué)化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，山西 太原 030006

2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所海南省黎藥資源天然產(chǎn)物研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/海南熱帶農(nóng)業(yè)資源研究院海南省熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?571101

沉香為瑞香科（Thymelaeaceae）沉香屬AquilariaLam.或擬沉香屬GyrinopsGaertn.植物含有樹脂的木材，是天然香料和名貴的傳統(tǒng)藥材。沉香中的主要成分為倍半萜和2-(2-苯乙基)色酮2大類化合物。奇楠沉香特指高品質(zhì)的沉香，出產(chǎn)極少，價(jià)格昂貴。因其香氣幽雅、香韻豐富、香味濃郁、留香持久、油脂豐富、質(zhì)地柔軟，在未燃時(shí)也具有清涼香甜的氣味，在宗教和香文化中備受推崇。經(jīng)考證，奇楠的2 種基原植物為海南產(chǎn)白木香A.sinensis(Lour.) Spreng 和越南產(chǎn)柯拉斯那沉香A.crassnaPierre ex Lecomte[1]。奇楠沉香的乙醇或乙醚提取物得率均顯著高于普通沉香的得率，乙醚提取物中2-(2-苯乙基)色酮和2-[2-(4-甲氧基苯)乙基]色酮的相對(duì)含量之和高達(dá)37%以上[2-4]。此外，普通沉香中母核無取代的2-(2-苯乙基)色酮類化合物（即C-3,5,6,7 和8 位沒有被取代）含量較少，而本研究組從國產(chǎn)綠奇楠沉香中分離到大量色酮母核無取代的2-(2-苯乙基)色酮類化合物[5]。

本研究組選育出的新品種“熱科2 號(hào)”白木香（瓊S-SV-AS-002-2020）所產(chǎn)沉香的乙醚提取物中2-(2-苯乙基)色酮和2-[2-(4-甲氧基苯)乙基]色酮的平均相對(duì)含量之和為64.01%，具有高品質(zhì)沉香的特性，是極具吸引力的栽培奇楠沉香良種[6-7]。GC-MS分析結(jié)果表明，“熱科2 號(hào)”栽培奇楠沉香在乙醇提取物得率、2-(2-苯乙基)色酮衍生物的相對(duì)含量等方面與野生奇楠沉香類似，均遠(yuǎn)高于普通沉香，其水蒸氣蒸餾法提取獲得的精油富含倍半萜類化合物，是“熱科2 號(hào)”栽培奇楠沉香在未燃時(shí)具有類似于奇楠沉香香氣的物質(zhì)基礎(chǔ)[2,8-9]。此外，“熱科2 號(hào)”栽培奇楠沉香及其葉片的急性毒性研究結(jié)果表明二者的急性毒性分級(jí)屬于無毒級(jí)物質(zhì)，為栽培奇楠沉香的藥用和深加工提供了可能[10]。近年來，隨著“熱科2 號(hào)”白木香良種的大面積推廣，“熱科2 號(hào)”白木香所產(chǎn)栽培奇楠沉香的產(chǎn)量不斷增加，為了更好地加工利用栽培奇楠沉香，急需對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行深入系統(tǒng)地研究，發(fā)現(xiàn)栽培奇楠沉香的更多特征性成分，為栽培奇楠沉香替代野生奇楠沉香提供理論依據(jù)，為栽培奇楠沉香的利用提供系統(tǒng)、科學(xué)的依據(jù)，實(shí)現(xiàn)栽培奇楠沉香資源的最大化利用。本研究從“熱科2 號(hào)”白木香人工打洞所產(chǎn)栽培奇楠沉香的乙醇提取物中分離并鑒定了17 個(gè)化合物（圖1），分別為 2-[(4-甲氧基苯甲酰氧基)甲基]色酮（2-[(4-methoxybenzoyloxy)methyl]chromone，1）、2-(2-苯乙基)色酮（2-(2-phenylethyl)chromone，2）、2-[2-(3-羥基-4-甲氧基苯)乙基]色酮（2-[2-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)ethyl]chromone，3）、2-[2-(3-甲氧基-4-羥基苯)乙基]色酮（2-[2-(3-methoxy-4-hydroxyphenyl)ethyl]chromone，4）、2-[2-(4-甲氧基苯)乙基]色酮（2-[2-(4-methoxyphenyl)ethyl]chromone，5）、2-[2-(2-羥基苯)乙基]色酮（2-[2-(2-hydroxyphenyl)ethyl]chromone，6）、2-[2-(4-羥基苯)乙基]色酮（2-[2-(4-hydroxyphenyl)ethyl]chromone，7）、6-羥基-2-[2-(3-羥基-4-甲氧基苯)乙基]色酮（6-hydroxy-2-[2-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)ethyl]chromone，8）、6-甲氧基-2-[2-(4-甲氧基苯)乙基)]色酮（6-methoxy-2-[2-(4-methoxyphenyl)ethyl]chromone，9）、(R)-2-[2-羥基-2-(4-羥基苯)乙基]色酮（(R)-2-[2-hydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)ethyl]chromone，10）、(S)-2-[2-羥基-2-(4-羥基苯)乙基]色酮（(S)-2-[2-hydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)ethyl]chromone，11）、4-羥基苯甲酸甲酯（methyl 4-hydroxybenzoate，12）、4-丙烯基苯甲醚（anethole，13）、7β-H-9(10)-烯-11,12-環(huán)氧-8-氧艾里莫芬烷 [7β-H-9(10)-ene-11,12-epoxy-8-oxoeremophilane，14]、(5S,7S,9S,10S)-(-)-9-羥基-芹子烷-3,11-二烯-14-醛 [(5S,7S,9S,10S)-(-)-9-hydroxyselina-3,11-dien-14-al，15]、β-欖香烯-9β-醇（β-elemen-9β-ol，16）、角鯊烯（squalene，17）。其中，化合物1 為新化合物，化合物16 首次在沉香中發(fā)現(xiàn)?？寡谆钚詼y(cè)試結(jié)果表明，化合物8 具有抗炎活性，半數(shù)抑制濃度（median inhibition concentration，IC50）值為（27.81±2.34）μmol/L。

圖1 栽培奇楠沉香中化合物1～17 的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of compounds 1—17 from cultivated “Qi-Nan” agarwood

1 儀器與材料

安捷倫1260 分析型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；安捷倫1260 半制備型高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；Cosmosil 5 C18-MS-II 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，Nacalai tesque公司）；Chiralpak AD-H 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，Daicel 公司）；Bruker AV-500 型超導(dǎo)核磁儀（德國Bruker 公司）；質(zhì)譜儀（Bruker amazon SL 公司）；紅外光譜儀（Nicolet 380）；UV-2550 紫外光譜儀（Shimadzu 公司）；旋光儀MCP 5100（奧地利Anton Paar 有限公司）；圓二色譜儀MOS-500（法國Biologic 公司）；CA-1111 型冷卻水循環(huán)裝置（上海愛朗儀器有限公司）；BSA-100A 型自動(dòng)部分收集器（上海青浦滬西儀器廠）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國Heidolph Laborota）；Mettler Toledo ME204 精密和分析天平 [萬分之一，梅特勒-托力多儀器（上海）公司]；超凈工作臺(tái)（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；ELX-800 酶標(biāo)儀（美國寶特公司）；色譜硅膠板G，柱色譜硅膠（200～300、60～80 目）（青島海洋化工廠）；Sephadex LH-20 凝膠（德國Merck公司）。小鼠單核巨噬細(xì)胞（RAW264.7）購買于中國科學(xué)院干細(xì)胞庫；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（賽默飛世爾科技公司）；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、Griess 試劑、槲皮素（批號(hào)SLBZ4289）、吲哚美辛（批號(hào)RH107294）、鹽酸阿霉素（批號(hào)H03A8J41034）、MTT 試劑（美國Sigma 公司）。

栽培奇楠沉香樣品于2020年5月采自廣東電白打洞結(jié)香12 個(gè)月的“熱科2 號(hào)”白木香，經(jīng)中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所戴好富研究員鑒定基原植物為瑞香科沉香屬白木香A.sinensis(Lour.) Spreng，憑證標(biāo)本（RK220200517）保存于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所。

2 提取與分離

栽培奇楠沉香樣品（177.7 g）粉碎后用95%乙醇（1.8 L）回流提取3 次，減壓濃縮后得浸膏（85.3 g）。隨后將浸膏用減壓硅膠柱色譜進(jìn)行粗劃段，用石油醚-醋酸乙酯系統(tǒng)（1∶0→2∶1）和二氯甲烷-甲醇系統(tǒng)（40∶1→0∶1）洗脫，得14 個(gè)流分（Fr.1～14）。Fr.1（220.5 mg）經(jīng)石油醚-醋酸乙酯（1000∶1→300∶1）硅膠柱洗脫得到化合物17（7.1 mg）。Fr.2（605.5 mg）經(jīng)Sephadex LH-20 凝膠柱（氯仿-甲醇1∶1）洗脫獲得流分Fr.2.1～2.4，F(xiàn)r.2.3（146.1 mg）分別經(jīng)凝膠柱色譜（甲醇）和硅膠柱色譜[石油醚-丙酮（500∶1→50∶1）]洗脫獲得流分Fr.2.3.1～2.3.9 和化合物14（2.0 mg），F(xiàn)r.2.3.1（32.1 mg）經(jīng)石油醚-氯仿-丙酮（5∶1∶0→5∶5∶0.01）硅膠柱洗脫，得到化合物13（5.1 mg）和16（1.3 mg）。Fr.3（4.569 g）分別經(jīng)凝膠柱（氯仿-甲醇1∶1）和石油醚-醋酸乙酯（40∶1→25∶1）硅膠柱洗脫獲得化合物2（813.2 mg）。Fr.4（11.693 g）分別經(jīng)凝膠柱（甲醇）和石油醚-醋酸乙酯（12∶1→4∶1）硅膠柱洗脫得到化合物5（10.147 g）和7（3.4 mg）。Fr.5（1.256 g）經(jīng)凝膠柱（甲醇）洗脫，得到流分Fr.5.1 和Fr.5.2，F(xiàn)r.5.1（536.1 mg）分別經(jīng)凝膠柱（甲醇）和硅膠柱色譜[石油醚-氯仿-丙酮（5∶5∶0→5∶5∶0.4）]洗脫，得到化合物15（2.0 mg），F(xiàn)r.5.2（351.8 mg）經(jīng)硅膠柱色譜[石油醚-氯仿-異丙醇（5∶3∶0→5∶3∶0.15）]洗脫得到流分Fr.5.2.1～5.2.7，化合物4（4.5 mg）和6（6.5 mg），F(xiàn)r.5.2.2（20.0 mg）經(jīng)硅膠柱，以石油醚-醋酸乙酯（8∶1→4∶1）洗脫得到化合物1（2.7 mg）。Fr.9（8.407 g）經(jīng)凝膠柱（氯仿-甲醇1∶1）洗脫，然后重結(jié)晶得化合物3（3.645 g）。Fr.10（900.8 mg）分別經(jīng)凝膠柱（氯仿-甲醇1∶1）和硅膠柱色譜（石油醚-醋酸乙酯2∶1）洗脫得流分Fr.10.1～10.8 和化合物12（1.8 mg），F(xiàn)r.10.4（72.8 mg）經(jīng)半制備高效液相色譜（C18柱，甲醇-水13∶7）分離純化得到化合物9（3.7 mg，tR=29.0 min）。濾過Fr.11（19.467 g）中析出的固體，將固體用氯仿溶解后，重結(jié)晶得化合物8（6.389 g），F(xiàn)r.11 的母液分別經(jīng)凝膠柱（氯仿-甲醇1∶1）和石油醚-醋酸乙酯（25∶1→6∶1）硅膠柱洗脫，得到流分Fr.11.1～11.6，F(xiàn)r.11.5（583.2 mg）經(jīng)石油醚-醋酸乙酯（6∶1→1∶1）硅膠柱洗脫得到外消旋混合物（2.0 mg）。隨后，采用正向手性柱（正己烷-異丙醇3∶7）將外消旋混合物拆分得到化合物10（0.6 mg，tR=7.7 min）和11（0.4 mg，tR=8.2 min）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

表1 化合物1 的1H-NMR (500 MHz,CDCl3) 和13C-NMR (125 MHz,CDCl3) 數(shù)據(jù)Table 1 1H-NMR (500 MHz,CDCl3) and 13C-NMR (125 MHz,CDCl3) data of compound 1

高分辨質(zhì)譜HR-ESI-MSm/z333.073 8 [M+Na]+（計(jì)算值333.073 3，C18H14NaO5+），分子式為C18H14O5，不飽和度為12。紅外譜圖顯示，該化合物存在色酮結(jié)構(gòu)中共軛羰基（1630 cm-1），不含有羥基的吸收峰。1H-NMR 譜（表1）上顯示1 組1,4-二取代苯環(huán)質(zhì)子信號(hào) [δH8.07 (2H,d,J=7.7 Hz,H-2＇,6＇),6.96 (2H,d,J=7.7 Hz,H-3＇,5＇)]，1 個(gè)沉香中色酮特征性質(zhì)子信號(hào) [δH6.48 (1H,s,H-3)]，1 組1,2-二取代苯環(huán)質(zhì)子信號(hào) [δH8.20 (1H,d,J=8.0Hz,H-5),7.42 (1H,dd,J=8.0,7.5 Hz,H-6),7.68(1H,dd,J=8.4,7.5 Hz,H-7),7.47 (1H,d,J=8.4 Hz,H-8)]，1 個(gè)連氧亞甲基 [δH5.25 (2H,s,H-8＇)]和1個(gè)甲氧基 [δH3.88 (3H,s,4＇-OCH3)]?；衔? 的13C-NMR 顯示該化合物有18 個(gè)碳原子，結(jié)合DEPT 135 及HSQC 譜圖可以得出該化合物含有7 個(gè)季碳、9 個(gè)次甲基、1 個(gè)連氧亞甲基和1 個(gè)甲氧基（表1）。化合物1 的核磁數(shù)據(jù)與2-[2-(4-甲氧基)苯乙基]色酮（5）相似，表明化合物1 也具有C-2 位連有取代基色酮母核和1,4 二取代苯環(huán)，不同之處在于化合物1多出1 個(gè)酯羰基（δC165.4,C-7＇）和1 個(gè)連氧亞甲基（δC61.9,C-8＇），而缺少乙-1,2-叉基。在HMBC譜上，H-8＇與C-2（δC163.2）、C-3（δC110.1）的遠(yuǎn)程相關(guān)信號(hào)和H-3 與C-2、C-8＇的遠(yuǎn)程相關(guān)信號(hào)表明C-8＇與C-2 連接；H-8＇與C-7＇的遠(yuǎn)程相關(guān)信號(hào)表明C-8＇與C-7＇形成酯鍵；H-2＇和H-6＇與C-7＇、C-4＇（δC164.2）的遠(yuǎn)程相關(guān)信號(hào)，和4＇-OCH3與C-4＇的遠(yuǎn)程相關(guān)信號(hào)表明C-7＇與C-1＇連接以及C-4＇被甲氧基取代（圖2）。此外，化合物1 的ROESY 譜中4＇-OCH3與H-3＇和H-5＇的NOE 效應(yīng)也進(jìn)一步確定甲氧基位于C-4＇。綜合分析化合物1 的2D NMR 信號(hào)，表明其他結(jié)構(gòu)片段與2-[2-(4-甲氧基)苯乙基]色酮的一致，其結(jié)構(gòu)如圖1 所示，命名為2-[(4-甲氧基苯甲酰氧基)甲基]色酮。栽培奇楠沉香的主要成分2-[2-(4-甲氧基)苯乙基]色酮（5）可能是化合物1 的前體，其C-7＇被氧化成酮羰基，然后發(fā)生Baeyer-Villiger 氧化反應(yīng)形成化合物1[11]（圖3）。

圖2 化合物1 的關(guān)鍵2D NMR 相關(guān)信號(hào)Fig.2 Key 2D NMR correlations of compound 1

圖3 化合物1 可能的生物合成途徑Fig.3 The proposed biosynthesis pathway of compound 1

化合物2：黃色油狀物。ESI-MSm/z273.3 [M+Na]+，分子式C17H14O2；1H-NMR (500 MHz,CD3OD)δ: 8.04 (1H,d,J=8.0 Hz,H-5),7.72 (1H,dd,J=8.4,7.0 Hz,H-7),7.51 (1H,d,J=8.4 Hz,H-8),7.41 (1H,dd,J=8.0,7.0 Hz,H-6),7.32 (2H,m,H-2＇,6＇),7.23(3H,m,H-3＇～5＇),6.12 (1H,s,H-3),3.04 (2H,m,H-7＇),2.96 (2H,m,H-8＇)；13C-NMR (125 MHz,CD3OD)δ: 171.6 (C-2),110.7 (C-3),180.5 (C-4),126.1 (C-5),126.5 (C-6),135.4 (C-7),119.2 (C-8),158.0 (C-9),124.3 (C-10),141.2 (C-1＇),129.6 (C-2＇,6＇),129.4 (C-3＇,5＇),127.5 (C-4＇),33.9 (C-7＇),37.0(C-8＇)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[5]，確定化合物2 為2-(2-苯乙基)色酮。

化合物3：淡黃色針晶（甲醇）。ESI-MSm/z297.3 [M+H]+，分子式C18H16O4；1H-NMR (500 MHz,CDCl3)δ: 8.17 (1H,d,J=8.0 Hz,H-5),7.65(1H,dd,J=8.4,7.0 Hz,H-7),7.44 (1H,d,J=8.4 Hz,H-8),7.37 (1H,dd,J=8.0,7.0 Hz,H-6),6.79 (1H,d,J=2.0 Hz,H-2＇),6.75 (1H,d,J=8.2 Hz,H-5＇),6.65(1H,dd,J=8.2,2.0 Hz,H-6＇),6.14 (1H,s,H-3),3.85(3H,s,4＇-OCH3),2.96 (2H,m,H-7＇),2.88 (2H,m,H-8＇)；13C-NMR (125 MHz,CDCl3)δ: 168.6 (C-2),110.2 (C-3),178.4 (C-4),125.6 (C-5),125.0 (C-6),133.5 (C-7),117.8 (C-8),156.4 (C-9),123.6 (C-10),132.9 (C-1＇),114.4 (C-2＇),145.7 (C-3＇),145.2 (C-4＇),110.8 (C-5＇),119.6 (C-6＇),32.3 (C-7＇),36.2 (C-8＇),55.9 (4＇-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[5]，確定化合物3 為2-[2-(3-羥基-4-甲氧基苯)乙基]色酮。

化合物4：無色針晶（甲醇）。ESI-MSm/z297.3[M+H]+，分子式C18H16O4；1H-NMR (500 MHz,CDCl3)δ: 8.17 (1H,d,J=8.0 Hz,H-5),7.64 (1H,dd,J=8.4,7.2 Hz,H-7),7.43 (1H,d,J=8.4 Hz,H-8),7.37 (1H,dd,J=8.0,7.2 Hz,H-6),6.83 (1H,d,J=8.0 Hz,H-5＇),6.69 (1H,brd,J=8.0 Hz,H-6＇),6.67(1H,brs,H-2＇),6.15 (1H,s,H-3),3.80 (3H,s,3＇-OCH3),2.98 (2H,m,H-7＇),2.89 (2H,m,H-8＇)；13C-NMR (125 MHz,CDCl3)δ: 168.6 (C-2),110.1(C-3),178.3 (C-4),125.6 (C-5),125.0 (C-6),133.5(C-7),117.7 (C-8),156.4 (C-9),123.6 (C-10),131.5(C-1＇),110.8 (C-2＇),146.5 (C-3＇),144.2 (C-4＇),114.5(C-5＇),120.8 (C-6＇),32.7 (C-7＇),36.4 (C-8＇),55.8(3＇-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[5]，確定化合物4 為2-[2-(3-甲氧基-4-羥基苯)乙基]色酮。

化合物5：無色針晶（甲醇）。ESI-MSm/z303.3[M+Na]+，分子式C18H16O3；1H-NMR (500 MHz,CDCl3)δ: 8.16 (1H,d,J=7.9 Hz,H-5),7.63 (1H,dd,J=8.4,7.2 Hz,H-7),7.42 (1H,d,J=8.4 Hz,H-8),7.41 (1H,dd,J=7.9,7.2 Hz,H-6),7.10 (2H,d,J=8.6 Hz,H-2＇,6＇),6.81 (2H,d,J=8.6 Hz,H-3＇,5＇),6.12 (1H,s,H-3),3.76 (3H,s,4＇-OCH3),2.99 (2H,m,H-7＇),2.88 (2H,m,H-8＇)；13C-NMR (125 MHz,CDCl3)δ: 168.4 (C-2),110.1 (C-3),178.1 (C-4),125.5(C-5),124.8 (C-6),133.4 (C-7),117.7 (C-8),156.3(C-9),123.6 (C-10),131.6 (C-1＇),129.1 (C-2＇,6＇),113.9 (C-3＇,5＇),158.1 (C-4＇),32.0 (C-7＇),36.2 (C-8＇),55.1 (4＇-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[12]，確定化合物5 為2-[2-(4-甲氧基苯)乙基]色酮。

化合物6：白色粉末。ESI-MSm/z289.3 [M+Na]+，分子式C17H14O3；1H-NMR (500 MHz,CDCl3)δ: 8.07 (1H,d,J=8.0 Hz,H-5),7.61 (1H,dd,J=8.4,7.0 Hz,H-7),7.40 (1H,d,J=8.4 Hz,H-8),7.32 (1H,dd,J=8.0,7.0 Hz,H-6),6.99 (1H,d,J=8.3 Hz,H-6＇),6.97 (1H,dd,J=8.0,7.4 Hz,H-4＇),6.73 (1H,d,J=8.0 Hz,H-3＇),6.32 (1H,dd,J=8.3,7.4 Hz,H-5＇),6.13 (1H,s,H-3),2.99 (2H,m,H-7＇),2.93 (2H,m,H-8＇)；13C-NMR (125 MHz,CDCl3)δ: 170.4 (C-2),109.5 (C-3),179.3 (C-4),125.2 (C-5),124.9 (C-6),133.6 (C-7),117.8 (C-8),156.5 (C-9),123.1 (C-10),126.0 (C-1＇),154.7 (C-2＇),114.9 (C-3＇),127.6 (C-4＇),119.5 (C-5＇),129.8 (C-6＇),27.8 (C-7＇),34.2 (C-8＇)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[5]，確定化合物6 為2-[2-(2-羥基苯)乙基]色酮。

化合物7：白色無定形固體。ESI-MSm/z267.3[M+H]+，分子式C17H14O3；1H-NMR (500 MHz,CDCl3)δ: 8.18 (1H,d,J=8.0 Hz,H-5),7.66 (1H,dd,J=8.3,7.0 Hz,H-7),7.44 (1H,d,J=8.3 Hz,H-8),7.39 (1H,dd,J=8.0,7.0 Hz,H-6),7.05 (2H,d,J=8.4 Hz,H-2＇,6＇),6.77 (2H,d,J=8.4 Hz,H-3＇,5＇),6.13 (1H,s,H-3),2.99 (2H,m,H-7＇),2.90 (2H,m,H-8＇)；13C-NMR (125 MHz,CDCl3)δ: 168.8 (C-2),110.2 (C-3),178.6 (C-4),125.7 (C-5),125.0 (C-6),133.6 (C-7),117.8 (C-8),156.5 (C-9),123.6 (C-10),131.5 (C-1＇),129.4 (C-2＇),115.5 (C-3＇),154.5 (C-4＇),115.5 (C-5＇),129.4 (C-6＇),32.1 (C-7＇),36.4 (C-8＇)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[5]，確定化合物7 為2-[2-(4-羥基苯)乙基]色酮。

化合物8：白色粉末。ESI-MSm/z335.3 [M+Na]+，分子式C18H16O5；1H-NMR (500 MHz,DMSO-d6)δ: 9.91 (1H,s,6-OH),8.79 (1H,s,3＇-OH),7.44 (1H,d,J=9.0 Hz,H-8),7.22 (1H,d,J=1.8 Hz,H-5),7.15(1H,dd,J=9.0,1.8 Hz,H-7),6.74 (1H,d,J=8.1 Hz,H-5＇),6.62 (1H,d,J=2.2 Hz,H-2＇),6.55 (1H,dd,J=8.1,2.2 Hz,H-6＇),6.06 (1H,s,H-3),3.66 (3H,s,4＇-OCH3),2.85 (2H,m,H-7＇),2.83 (2H,m,H-8＇)；13C-NMR (125 MHz,DMSO-d6)δ: 168.8 (C-2),108.8(C-3),176.9 (C-4),107.6 (C-5),154.7 (C-6),122.9(C-7),119.6 (C-8),149.7 (C-9),124.0 (C-10),132.9(C-1＇),115.7 (C-2＇),146.5 (C-3＇),146.2 (C-4＇),112.4(C-5＇),118.8 (C-6＇),31.9 (C-7＇),35.4 (C-8＇),55.6(4＇-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[13]，確定化合物8 為6-羥基-2-[2-(3-羥基-4-甲氧苯)乙基]色酮。

化合物9：無色油狀物。ESI-MSm/z333.3 [M+Na]+，分子式C19H18O4；1H-NMR (500 MHz,CDCl3)δ: 7.57 (1H,d,J=2.5 Hz,H-5),7.39 (1H,d,J=9.4 Hz,H-8),7.24 (1H,dd,J=9.4,2.5 Hz,H-7),7.13(2H,d,J=8.5 Hz,H-2＇,6＇),6.85 (2H,d,J=8.5 Hz,H-3＇,5＇),6.15 (1H,s,H-3),3.91 (3H,s,6-OCH3),3.80 (3H,s,4＇-OCH3),3.02 (2H,m,H-7＇),2.92 (2H,m,H-8＇)；13C-NMR (125 MHz,CDCl3)δ: 168.3 (C-2),109.5 (C-3),178.3 (C-4),104.9 (C-5),151.4 (C-6),123.6 (C-7),119.3 (C-8),156.8 (C-9),124.3 (C-10),131.8 (C-1＇),129.3 (C-2＇,6＇),114.1 (C-3＇,5＇),158.3(C-4＇),32.2 (C-7＇),36.4 (C-8＇),55.3 (4＇-OCH3),56.0(6-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[14]，確定化合物9 為6-甲氧基-2-[2-(4-甲氧基苯)乙基)]色酮。

化合物10 和11：一對(duì)對(duì)映異構(gòu)體，化合物10的比旋光度為+28.6 (c0.7,MeOH)，化合物11的比旋光度為-27.2 (c0.7,MeOH)?；衔?0和11 都是淺黃色粉末。208 (3.42),221 (3.47),285 (3.01)；ESI-MSm/z283.3 [M+H]+，分子式C17H14O4；1H-NMR (500 MHz,CD3OD)δ:8.09 (1H,dd,J=8.0 Hz,H-5),7.77 (1H,dd,J=8.4,7.2 Hz,H-7),7.56 (1H,d,J=8.4 Hz,H-8),7.46 (1H,dd,J=8.0,7.2 Hz,H-6),7.23 (2H,d,J=8.5 Hz,H-2＇,6＇),6.75 (2H,d,J=8.5 Hz,H-3＇,5＇),6.24 (1H,s,H-3),3.87 (3H,s,6-OCH3),5.08 (1H,dd,J=8.2,5.5 Hz,H-7＇),3.10 (1H,dd,J=14.3,8.2 Hz,H-8＇a),3.04 (1H,dd,J=14.3,5.5 Hz,H-8＇b)；13C-NMR (125 MHz,CD3OD)δ: 169.7 (C-2),112.0 (C-3),180.6(C-4),126.1 (C-5),126.5 (C-6),135.4 (C-7),119.3(C-8),158.1 (C-9),124.4 (C-10),135.6 (C-1＇),128.2(C-2＇,6＇),116.2 (C-3＇,5＇),158.2 (C-4＇),72.4 (C-7＇),45.2 (C-8＇)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[15]，確定化合物10 和11 的平面結(jié)構(gòu)為2-[2-羥基-2-(4-羥基苯)乙基]色酮。由于化合物10 的比旋光度符號(hào)和Cotton效應(yīng) [λmax（Δε）：236（+3.56）、271（+1.09）nm]與(R)-6-甲氧基-2-[2-羥基-2-(3-甲氧基-4-羥基苯)乙基]色酮的{+16.3;λmax（Δε）：241（+2.96）、280（+1.62）nm}一致，確定其結(jié)構(gòu)為 (R)-2-[2-羥基-2-(4-羥基苯)乙基]色酮。同理，化合物11 的比旋光度符號(hào)和Cotton 效應(yīng) [λmax（Δε）：233（-2.56）、266（-1.09）nm]與 (S)-6-甲氧基-2-[2-羥基-2-(3-甲氧基-4-羥基苯)乙基]色酮的{-22.3;λmax（Δε）：241（-2.96）、280（-1.62）nm}一致，確定其結(jié)構(gòu)為(S)-2-[2-羥基-2-(4-羥基苯)乙基]色酮[16]。

化合物12：黃色無定形固體。ESI-MSm/z153.1[M+H]+，分子式C8H8O3；1H-NMR (500 MHz,CDCl3)δ: 8.06 (2H,d,J=8.5 Hz,H-2,6),6.95 (2H,d,J=8.5 Hz,H-3,5),3.88 (3H,s,7-OCH3)；13C-NMR (125 MHz,CDCl3)δ: 122.5 (C-1),131.7(C-2,6),115.7 (C-3,5),161.8 (C-4),160.5 (C-7),53.0(7-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[17]，確定化合物12 為4-羥基苯甲酸甲酯。

化合物13：白色無定形固體。ESI-MSm/z149.1[M+H]+，分子式C10H12O；1H-NMR (500 MHz,CDCl3)δ: 7.26 (2H,d,J=8.6 Hz,H-2,6),6.83 (2H,d,J=8.6 Hz,H-3,5),6.35 (1H,d,J=15.9 Hz,H-1＇),6.09 (1H,dq,J=15.9,6.6 Hz,H-2＇),3.88 (3H,s,4-OCH3),1.86 (3H,d,J=6.6 Hz,H-3＇)；13C-NMR(125 MHz,CDCl3)δ: 130.8 (C-1),126.9 (C-2,6),113.9 (C-3,5),158.6 (C-4),130.4 (C-1＇),123.5 (C-2＇),18.3 (C-3＇),55.3 (4-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[18]，確定化合物13 為4-丙烯基苯甲醚。

化合物17：黃色油狀物。ESI-MSm/z411.7 [M+H]+，分子式C30H50；1H-NMR (500MHz,CDCl3)δ:5.11 (6H,m,H-3,7,11,14,18,22),2.02 (20H,m,H-4,5,8,9,12,13,16,17,20,21),1.68 (6H,s,H-1,24),1.60 (18H,s,H-2＇,6＇,10＇,15＇,19＇,23＇)；13C-NMR (125 MHz,CDCl3)δ: 17.7 (C-1,24),131.3(C-2,23),124.4 (C-3,22),26.8 (C-4,21),39.8 (C-5,20),134.9 (C-6,19),124.2 (C-7,18),26.7 (C-8,17),39.7 (C-9,16),135.1 (C-10,15),124.3 (C-11,14),28.3 (C-12,13),25.7 (C-2＇,23＇),16.0 (C-6＇,19＇),16.1(C-10＇,15＇)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[22]，確定化合物17 為角鯊烯。

4 抗炎活性測(cè)試

4.1 細(xì)胞毒活性

采用MTT 法測(cè)試化合物1～9、12～17 對(duì)小鼠單核巨噬細(xì)胞 RAW264.7 的細(xì)胞毒活性[23]。RAW264.7 細(xì)胞用含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)液于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。細(xì)胞按1×105個(gè)/mL 接種于96 孔板中培養(yǎng)24 h 后，加入100 μL待測(cè)化合物溶液（100 μmol/L），置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中貼壁72 h 后，向每孔細(xì)胞中加入15 μL 質(zhì)量濃度為5 mg/mL 的MTT 溶液，37 ℃條件下反應(yīng)4 h 后吸走上清液，向每孔加入100 μL DMSO 充分溶解，于酶標(biāo)儀490 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定每孔的吸光度（A）值，每組實(shí)驗(yàn)平行3 次。按公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。

抑制率=1-A實(shí)驗(yàn)/A0

A0為空白組（100 μL 培養(yǎng)液）的吸光度，A實(shí)驗(yàn)為實(shí)驗(yàn)組（100 μL 化合物/藥物）的吸光度

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，以上化合物在100 μmol/L 濃度下不具有細(xì)胞毒活性。

4.2 抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7 產(chǎn)生NO 的活性

建立LPS 誘導(dǎo)小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7 模型，采用Griess 法測(cè)試化合物1～9、12～17 的抗炎活性[24-25]。RAW264.7 細(xì)胞用含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)液于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。細(xì)胞按1×105個(gè)/mL 接種于96 孔板中培養(yǎng)24 h后，加入50 μL 待測(cè)化合物溶液（化合物濃度為100、50、25、12.5、6.25 μmol/L），繼續(xù)培養(yǎng)1 h 后，加入50 μL LPS，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中貼壁24 h 后，取100 μL 于新的96 孔板中，之后向每孔加入100 μL（40 mg/mL）Griess 試劑，混勻后于酶標(biāo)儀540 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定各孔的A，每組實(shí)驗(yàn)平行3 次。按公式計(jì)算NO 抑制率。最后利用GraphPad Prism 軟件處理數(shù)據(jù)，求得化合物對(duì)LPS 誘導(dǎo)RAW264.7產(chǎn)生NO 的半抑制濃度（median inhibition concentration，IC50）。

抑制率=(A2-A1)/(A2-A0)

A0為空白對(duì)照組（50 μL 培養(yǎng)液+50 μL 培養(yǎng)液）的吸光度，A1為藥物組（50 μL 化合物/藥物+50 μL 脂多糖）的吸光度，A2為L(zhǎng)PS 誘導(dǎo)組（50 μL 培養(yǎng)液+50 μL 脂多糖）的吸光度

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，化合物8 具有抑制LPS 誘導(dǎo)小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7 產(chǎn)生NO 的活性，IC50值為（27.81±2.34）μmol/L。陽性對(duì)照槲皮素和吲哚美辛的IC50值分別為（12.46±0.24）、（35.40±1.34）μmol/L。其他化合物無明顯抗炎活性。

5 討論

本研究從栽培奇楠沉香中分離鑒定了17 個(gè)化合物，化合物1 為新化合物，欖香烷倍半萜16 首次在沉香屬植物中發(fā)現(xiàn)?；衔? 具有一定的抗炎活性，IC50值為（27.81±2.34）μmol/L。研究組前期研究發(fā)現(xiàn)國產(chǎn)野生綠奇楠中色酮母核無取代的2-(2-苯乙基)色酮衍生物約占2-(2-苯乙基)色酮類化合物總數(shù)1/2，是野生奇楠沉香中主要的化合物類型[2]，而普通沉香中2-(2-苯乙基)色酮的色酮母核絕大多數(shù)被羥基或甲氧基取代。與野生奇楠沉香類似，本研究從栽培奇楠沉香中鑒定的化合物1～7 和10～11 為色酮母核無取代的2-(2-苯乙基)色酮衍生物，進(jìn)一步揭示了栽培奇楠沉香與野生奇楠沉香具有相似性，但前期對(duì)奇楠沉香致香成分的分析結(jié)果和本研究所分離化合物的香氣分析結(jié)果表明，二者在沉香香氣成分組成上有一定差異，形成了各自不同的香氣特征[4,8-9]。GC-MS 分析結(jié)果表明化合物2和5 是奇楠沉香的主要成分[8]，本研究發(fā)現(xiàn)化合物3 和8 也是栽培奇楠沉香的主要成分，下一步可綜合利用GC-MS 和LC-MS 分析并挖掘沉香的特征性成分，完善栽培奇楠沉香與野生奇楠沉香的標(biāo)準(zhǔn)，為奇楠沉香的合理利用提供科學(xué)依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突