百香果香氣成分的氣相色譜-嗅覺(jué)-質(zhì)譜分析

顧鈺宸，馮 濤

（上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)香料香精化妝品學(xué)部，上海 201418）

百香果（Passiflora eduliaSims）是一種西番蓮科植物，大量種植于熱帶和亞熱帶地區(qū)，有“果汁之王”的美譽(yù)[1]。百香果的果實(shí)具有獨(dú)特的香氣，是天然濃縮汁和天然香料[2-3]。香氣是評(píng)價(jià)其品質(zhì)的關(guān)鍵特征之一，它混合了番石榴、芒果、蘋(píng)果、香蕉、荔枝、草莓、檸檬和菠蘿的香氣[4]。此外，百香果富含大量多酚、黃酮、類(lèi)胡蘿卜素、維生素C等活性物質(zhì)[5]。

目前對(duì)百香果的研究主要集中在其抗氧化[6-7]、抗炎[7-8]、降血糖[9]等藥理作用上，對(duì)其揮發(fā)性香氣化合物的研究較少。Li 等[4]使用HS-SPME-GC/MS 結(jié)合轉(zhuǎn)錄組分析方法對(duì)百香果成熟過(guò)程中香氣形成機(jī)制進(jìn)行研究，分析了不同成熟階段的百香果果實(shí)揮發(fā)性化合物，發(fā)現(xiàn)隨著百香果的成熟，其香氣會(huì)急劇增加。Md 等[10]采用1H NMR 結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)分析方法，對(duì)不同成熟階段采收的百香果代謝產(chǎn)物進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)所有代謝物都相互關(guān)聯(lián)，最終導(dǎo)致百香果的成熟。

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）和嗅辨儀（olfactometer，O）常被聯(lián)合用于表征并鑒定不同種類(lèi)樣品中的揮發(fā)性香氣化合物[11-13]。固相微萃?。╯olid phase micro-extraction，SPME）與溶劑輔助風(fēng)味蒸發(fā)（solvent-assisted flavor evaporation，SAFE）是較為常用的提取樣品中香氣化合物的前處理方法[14-20]。如今，香氣提取稀釋分析（aroma extract dilution analysis，AEDA）與氣相色譜-嗅覺(jué)-質(zhì)譜儀（gas chromatography-olfactometry-massspectrometry，GC-O-MS）相結(jié)合的應(yīng)用已成為識(shí)別和表征許多食品中香氣活性化合物的有效方法[21-23]。然而，目前這種復(fù)雜的方法尚未應(yīng)用于百香果揮發(fā)性香氣化合物的鑒定。

本研究旨在找到適合百香果香氣的提取方法并測(cè)定百香果中的香氣成分。首先使用AEDA 的方法鑒定不同提取方法得到的百香果香氣化合物，之后定量香氣化合物并計(jì)算OAV，最后進(jìn)行香氣重組與缺失試驗(yàn)，從而為百香果產(chǎn)品質(zhì)量控制和工藝改進(jìn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

百香果，廣西桂平；NaCl、NaOH、葡萄糖和酒石酸，分析純，北京化學(xué)試劑公司；固相萃取柱Cleanert PEP-SPE（1 000 mg 填料），天津博納艾杰爾科技有限公司；D-葡萄糖酸內(nèi)酯、聚乙烯基吡咯烷酮和C6～C30正構(gòu)烷烴，美國(guó)Sigma 公司；香氣標(biāo)準(zhǔn)品，美國(guó)Sigma 公司和瑞士Fluka 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

嗅辨儀（olfactory detection port，ODP），德國(guó)Gerstel 公司；溶劑輔助風(fēng)味蒸發(fā)裝置（SAFE），德國(guó)Glasbl?serei Bahr 公司；Agilent 7890 GC 氣相色譜儀、Agilent 5975B MS 質(zhì)譜儀，美國(guó)安捷倫科技有限公司；DVB/CAR/PDMS頂空固相微萃取頭，美國(guó)Supelco 公司；DB-Wax 氣相色譜柱、HP-INNOWax 氣相色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm），美國(guó)J&W Scientific 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理

（1）SPME

醫(yī)院通過(guò)辦公自動(dòng)化,強(qiáng)化對(duì)網(wǎng)絡(luò)安全管理,培養(yǎng)專(zhuān)業(yè)檔案人才,制定檔案管理標(biāo)準(zhǔn),工作效率出現(xiàn)顯著提升,而且整體操作規(guī)范統(tǒng)一。詳情見(jiàn)下表1。

稱(chēng)取5 g 百香果香料和1 g NaCl 快速放入萃取瓶中，將裝有樣品的萃取瓶放入50 ℃的恒溫水浴鍋中平衡20 min，用SPME 萃取頭扎入萃取瓶中同樣溫度下萃取30 min。提取后，將纖維轉(zhuǎn)移到進(jìn)樣口，在250 ℃下解吸5 min，用于GC-MS 分析。

（2）SAFE

準(zhǔn)確稱(chēng)量20 g 百香果香料于500 mL 錐形瓶中，加入200 mL 二氯甲烷，在磁力攪拌器上提取1 h，轉(zhuǎn)置于分液漏斗中，上層液體置于500 mL 圓底燒瓶中，保留下層液體并轉(zhuǎn)移至錐形瓶中，以相同步驟再重復(fù)2 次后將3次上層液體合并于圓底燒瓶，得到的提取液在SAFE 裝置中進(jìn)行提取。餾出物用無(wú)水硫酸鈉干燥，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至5 mL，然后在溫和的氮?dú)饬飨逻M(jìn)一步濃縮至200 μL。在GC-MS 和GC-O 分析前，濃縮于-20 ℃保存。

1.3.2 GC-MS 測(cè)定條件

采用DB-Wax 氣相色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度230 ℃；升溫程序：起始溫度40 ℃，保持5 min；以4 ℃/min 上升至120 ℃，保持6 min；再以10 ℃/min 上升至230 ℃，保持6 min；載氣為氦氣；柱內(nèi)載氣流量1 mL/min；不分流。電子電離（electron ionization，EI）源，電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；接口溫度150 ℃；溶劑延時(shí)5 min；倍增器電壓1 964.7 V，掃描范圍20～400 amu。

1.3.3 GC-O-MS 測(cè)定條件

HP-INNOWax 氣相色譜柱（60 m×0.25 mm,0.25 μm），載氣為氦氣，流速1 mL/min。進(jìn)樣量為1 μL，不分流進(jìn)樣。程序升溫：起始溫度40 ℃，保持2 min，以4 ℃/min 升至230 ℃，保持15 min。進(jìn)樣口和輔助加熱區(qū)的溫度均為250 ℃。樣品經(jīng)色譜柱分離后以1∶1 比例分別進(jìn)入質(zhì)譜和ODP 進(jìn)行檢測(cè)。離子源為EI 源，電子能量為70 eV，質(zhì)量掃描范圍為30～350m/z。質(zhì)譜接口溫度為250 ℃，離子源溫度為230 ℃。

將提取物用二氯甲烷溶劑逐步稀釋?zhuān)?∶2、1∶4、1∶8 直至1∶1 024。在上述GC 條件下，使用DB-Wax色譜柱通過(guò)GC-O 對(duì)每個(gè)稀釋樣（1 μL）進(jìn)行分析，每個(gè)樣品及其每個(gè)稀釋度均由3 名經(jīng)過(guò)半年以上聞香培訓(xùn)的聞香員進(jìn)行嗅辨分析，有兩位及以上聞香員嗅聞到的香味的化合物則計(jì)算其稀釋因子，直到無(wú)法檢測(cè)到任何香氣化合物為止。每種化合物的風(fēng)味稀釋度（flavor dilution，F(xiàn)D）因子表示可以感知到的最大稀釋度。通過(guò)將其氣味、保留指數(shù)（retention index，RI）和質(zhì)譜與真實(shí)化合物的氣味進(jìn)行比較，識(shí)別每種氣味。

1.3.5 香氣重組試驗(yàn)

AV 是香氣物質(zhì)的濃度與閾值之比，表示特定氣味的效力，一般OAV＞1 則被認(rèn)為是主要香氣。將百香果中FD≥8 或OAV≥1 的香氣化合物按其實(shí)際濃度混合在空白基質(zhì)中作為重組模型，將其與未經(jīng)處理的百香果香料香氣進(jìn)行比較。小組人員共同討論得出6 個(gè)不同香氣類(lèi)型用于描述百香果香氣，隨后對(duì)樣品的不同香氣類(lèi)型進(jìn)行了強(qiáng)度評(píng)估，以確定這些香氣化合物對(duì)百香果整體香氣貢獻(xiàn)的影響。

1.3.6 缺失試驗(yàn)

根據(jù)香氣類(lèi)型及化合物類(lèi)別將上述香氣化合物分組，設(shè)計(jì)缺失試驗(yàn)驗(yàn)證單一組分對(duì)百香果的香氣貢獻(xiàn)。試驗(yàn)需要用到缺失某一種香氣組分的缺失模型與2 個(gè)完整的香氣重組模型。所有樣品都標(biāo)有三位數(shù)代碼并以隨機(jī)的順序呈現(xiàn)給專(zhuān)家小組成員進(jìn)行三角測(cè)試，小組成員需要區(qū)分出缺失模型與2 個(gè)完整的香氣重構(gòu)模型，確定缺失模型和重構(gòu)模型差異的顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 百香果揮發(fā)性香氣化合物的識(shí)別

通過(guò)SPME 鑒定共檢測(cè)到71 種揮發(fā)性組分（見(jiàn)下頁(yè)表1），其中酚類(lèi)7 種、脂肪酸乙酯類(lèi)7 種、脂肪酸類(lèi)6種、高級(jí)醇類(lèi)5 種、C6醇類(lèi)5 種、內(nèi)酯5 種、醛酮類(lèi)3 種、硫化物2 種、高級(jí)醇乙酸酯類(lèi)2 種、C13-降異戊二烯1 種以及其他類(lèi)3 種。FD 值大于1 024 的香氣物質(zhì)有β-大馬士酮、己酸、β-苯乙醇和4-乙基苯酚。

表1 利用AEDA-GC-O-MS 鑒定百香果香料關(guān)鍵香氣活性物質(zhì)Table 1 Identification of key aroma active substances in passion fruit spices using AEDA-GC-O-MS

續(xù)表

在SAFE 提取物的香氣化合物中，共嗅聞到39 個(gè)香氣區(qū)域，其中23 個(gè)香氣區(qū)域可實(shí)現(xiàn)化合物的定性，與SPME 中香氣物質(zhì)相似，仍有16 個(gè)香氣區(qū)域未被鑒定。鑒定的23 種香氣物質(zhì)中，包括揮發(fā)性酚類(lèi)8 種、內(nèi)酯4種、脂肪酸類(lèi)3 種、高級(jí)醇類(lèi)2 種、醛酮類(lèi)2 種、C13-降異戊二烯1 種、C6醇類(lèi)1 種、硫化物1 種以及其他類(lèi)1 種。其中，β-苯乙醇（玫瑰、花香）、愈創(chuàng)木酚（甜香、焦糖味）具有最大的FD 值（FD＞1 024），其次為γ-壬內(nèi)酯（甜香、焦糖味、果干），F(xiàn)D 值達(dá)512。另外，4-乙基苯酚、異丁香酚、β-大馬士酮、己酸、對(duì)甲酚、間甲酚、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、紫丁香酚、甲硫基丙醛、γ-丁內(nèi)酯、香草醛、雙乙酰、苯乙醛、異戊酸及14 種未知化合物的FD 值也都不低于8。

總體上，利用AEDA-GC-O-MS 技術(shù)鑒定了由SPME 和SAFE 萃取樣品中的關(guān)鍵香氣物質(zhì)共71 個(gè)香氣區(qū)域，每個(gè)香氣區(qū)域均由兩位及以上的專(zhuān)業(yè)品評(píng)員共同嗅聞確定。其中47 個(gè)香氣區(qū)域能夠?qū)崿F(xiàn)香氣物質(zhì)的鑒定，但仍有24 個(gè)香氣區(qū)域無(wú)法鑒定，這可能與上述化合物為痕量物質(zhì)或存在共流出現(xiàn)象有關(guān)。高級(jí)醇物質(zhì)是百香果重要的風(fēng)味物質(zhì)化合物，在百香果中共檢測(cè)到高級(jí)醇類(lèi)物質(zhì)5 種；其中β-苯乙醇具有最大FD 值（FD＞1 024），其次為異戊醇，F(xiàn)D 值達(dá)512。脂肪酸乙酯類(lèi)物質(zhì)主要表現(xiàn)為果香，其中辛酸乙酯的FD 值達(dá)512，除苯乙酸乙酯外，其他脂肪酸乙酯類(lèi)香氣物質(zhì)的FD 值均在8～128 之間。高級(jí)醇乙酸酯類(lèi)物質(zhì)主要貢獻(xiàn)花香和果香，其中乙酸異戊酯和乙酸苯乙酯的FD 值均不低于8。揮發(fā)性酚類(lèi)物質(zhì)中4-乙基苯酚具有最大FD 值（FD＞1 024），在嗅聞過(guò)程中表現(xiàn)為動(dòng)物味、馬廄味和皮革味；另外，4-乙烯基愈創(chuàng)木酚（李子干、肉桂）、丁香酚（李子干、香料）、愈創(chuàng)木酚（甜香、煙熏）和對(duì)甲酚（動(dòng)物味）也都具有較大的FD 值。脂肪酸類(lèi)物質(zhì)主要表現(xiàn)為脂肪味和酸腐味，其中己酸具有最大FD 值（FD＞1 024），除辛酸外，其他脂肪酸類(lèi)香氣物質(zhì)的FD 值均在16～256 之間。C13-降異戊二烯對(duì)果實(shí)的花香、果香貢獻(xiàn)最大。本試驗(yàn)中嗅聞到的C13-降異戊二烯中FD 值最大的為β-大馬士酮（FD＞1 024），嗅聞過(guò)程中表現(xiàn)為花香、甜香和蜂蜜味。C6醇類(lèi)物質(zhì)對(duì)香氣的貢獻(xiàn)也比較大，嗅聞過(guò)程中主要表現(xiàn)為生青味，1-己醇、順式-3-己烯醇、反式-3-己烯醇、順式-2-己烯醇以及反式-2-己烯醇的FD 值均不低于8。

除上述物質(zhì)外，百香果還鑒定出了內(nèi)酯、硫化物、醛酮類(lèi)物質(zhì)等，也對(duì)香氣有較大貢獻(xiàn)。內(nèi)酯主要為γ-丁內(nèi)酯（烘烤味、烤杏仁）、γ-己內(nèi)酯（黃瓜、植物味）、γ-辛內(nèi)酯（花香、椰子）和γ-壬內(nèi)酯（甜香、焦糖味、果干），它們的FD 值均不低于8。硫化物在嗅聞過(guò)程中表現(xiàn)為煮土豆味，甲硫基丙醇和甲硫基丙醛的FD 值分別為8 和128。醛酮類(lèi)物質(zhì)也稱(chēng)羰基化合物，既可能來(lái)源于果實(shí)，也可來(lái)源于微生物代謝，其中雙乙酰表現(xiàn)為黃油味、酸奶味，F(xiàn)D 值達(dá)512；苯乙醛表現(xiàn)為玫瑰花香，F(xiàn)D 值為128。此外，麥芽酚（甜香、焦糖味）和香草醛（香草味）的FD 均不低于8，對(duì)香氣有一定貢獻(xiàn)。在未知化合物中，未知物1533 和1901 的FD 值為256，而未知物2246 和2257 的FD 值也可達(dá)128，對(duì)百香果整體香氣可能有較大貢獻(xiàn)，但需要提高色譜的分離度或質(zhì)譜的分辨率對(duì)未知嗅聞區(qū)域的物質(zhì)做進(jìn)一步定性分析。

2.2 百香果揮發(fā)性香氣成分的定量及OAV 的計(jì)算

對(duì)百香果中的揮發(fā)性香氣成分進(jìn)行OAV 的計(jì)算，篩選出OAV＞1 對(duì)香氣有貢獻(xiàn)的成分。

由表2 可知，由SPME 方式萃取的百香果香料中香氣化合物含量最高的為乙酸，其次為異戊醇，含量分別為676.44 mg/L 和177.11 mg/L，分別占香氣物質(zhì)總量的55.58%和14.55%。另外，乳酸乙酯、2,3-丁二醇、異丁醇、γ-丁內(nèi)酯、乙酸乙酯、β-苯乙醇、1-己醇、異丁酸、辛酸、己酸、癸酸、辛酸乙酯和丁酸的含量均超過(guò)1 mg/L。

對(duì)定量的香氣化合物進(jìn)行OAV 分析，具體結(jié)果見(jiàn)表2。OAV 大于1 的游離態(tài)香氣化合物共有23 種，包括脂肪酸乙酯7 種、脂肪酸類(lèi)6 種、高級(jí)醇類(lèi)3 種、醛酮類(lèi)2種、高級(jí)醇乙酸酯1 種、其他酯類(lèi)1 種、C13-降異戊二烯類(lèi)1 種、C6醇類(lèi)物質(zhì)1 種和硫化物1 種。根據(jù)OAV 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，β-大馬士酮（OAV=707.80）、苯乙醛（OAV=164.10）和己酸乙酯（OAV=112.20）的OAV 較高，可能對(duì)百香果的香氣特征有較大貢獻(xiàn)。高級(jí)醇類(lèi)物質(zhì)中的異戊醇、β-苯乙醇、異丁醇和脂肪酸類(lèi)物質(zhì)中的辛酸、己酸、乙酸的OAV 均大于1。雖然乙酸和異戊醇的含量最高，但其OAV 并不高，僅為3.38 和2.72。這說(shuō)明香氣化合物的含量并不能完全反映其對(duì)百香果香氣的貢獻(xiàn)。

表2 基于SPME、SAFE 前處理后樣品中香氣物質(zhì)的OAV 計(jì)算Table 2 OAV calculation based on aroma substances in samples after SPME and SAFE pretreatment

百香果中的酯類(lèi)物質(zhì)的含量常超過(guò)其感官閾值，可以賦予百香果濃郁的果香和甜香。本試驗(yàn)中鑒定出的酯類(lèi)物質(zhì)主要為脂肪酸乙酯類(lèi)，含量在0.003～115.39 mg/L之間，其中己酸乙酯具有最大的OAV，達(dá)112.20；另外，乙酸異戊酯、乙酸乙酯以及乳酸乙酯的OAV 均大于1。醛酮類(lèi)物質(zhì)苯乙醛的OAV 僅次于β-大馬士酮（OAV=161.40），而該物質(zhì)在GC-O 分析中也具有較大的FD 值。另外，辛酸、癸醛、乳酸乙酯、癸酸乙酯的FD 值均小于8，但它們的OAV 值均超過(guò)1。由此可見(jiàn)，在GC-O稀釋分析與OAV 分析鑒定重要化合物時(shí)存在一定差異。百香果中OAV 大于1 的結(jié)合態(tài)香氣化合物共有10 種，包括揮發(fā)性酚類(lèi)4 種、脂肪酸類(lèi)2 種、醛酮類(lèi)2 種、硫化物1 種和C13-降異戊二烯類(lèi)1 種。

2.3 香氣重組與缺失實(shí)驗(yàn)

FD 值和OAV 的分析結(jié)果確定了影響百香果香氣的關(guān)鍵香氣物質(zhì)。然而，揮發(fā)性化合物之間的相互作用沒(méi)有考慮在內(nèi)。為了驗(yàn)證上述主要香氣化合物對(duì)百香果整體香氣的貢獻(xiàn)，對(duì)百香果香料及香氣重構(gòu)模型進(jìn)行定量描述分析。采用FD≥8 或OAV≥1 的42 種香氣物質(zhì)進(jìn)行香氣重構(gòu)分析，重構(gòu)模型由模擬溶液與42 種化合物組成，見(jiàn)圖1。

圖1 百香果香料與重構(gòu)香料香氣輪廓分析Fig.1 Aroma profile analysis of passion fruit spices and reconstituted spices

百香果香料及重構(gòu)模型的得分情況如圖1 所示，在6 種香氣中，果香、甜香和花香有較強(qiáng)的香氣強(qiáng)度，而酸香、柑橘香和青草香不太明顯。另外，通過(guò)重構(gòu)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)重構(gòu)模型與原樣相比，香氣輪廓基本一致，但是重構(gòu)模型的香氣強(qiáng)度均低于原樣，可能是由于在GC-O 分析實(shí)驗(yàn)中，存在許多未被鑒定的FD 值較大的嗅聞區(qū)域，而這些化合物未被添加進(jìn)重構(gòu)模型所造成的。

為了驗(yàn)證上述香氣化合物對(duì)百香果香氣輪廓的影響，根據(jù)香氣類(lèi)別及化合物類(lèi)型將上述香氣化合物分成5 組，建立5 組缺失模型，缺失物質(zhì)分為酯類(lèi)物質(zhì)、β-大馬士酮、揮發(fā)性酚類(lèi)物質(zhì)、C6醇類(lèi)物質(zhì)和脂肪酸類(lèi)物質(zhì)。分別缺失這5 組香氣化合物，通過(guò)三角檢驗(yàn)對(duì)比缺失香氣與未缺失香氣的重構(gòu)模型之間是否存在差異，來(lái)確定其對(duì)整體香氣的貢獻(xiàn)，缺失試驗(yàn)結(jié)果如表3（見(jiàn)下頁(yè)）所示。

表3 百香果香料缺失試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of passion fruit spice deficiency experiment

由表3 可知，酯類(lèi)物質(zhì)、β-大馬士酮及C6醇類(lèi)物質(zhì)的缺失組與未缺失組之間存在極顯著的差異（P＜0.001）。揮發(fā)性酚類(lèi)物質(zhì)很顯著影響百香果香料的香氣感知（P＜0.01），這些物質(zhì)主要賦予百香果水果味、香料味及甜味，這類(lèi)香氣在重構(gòu)時(shí)也與百香果輪廓較為相似，進(jìn)一步說(shuō)明揮發(fā)性酚類(lèi)物質(zhì)是百香果香料的特征香氣物質(zhì)。脂肪酸類(lèi)物質(zhì)對(duì)其的香氣感知也有顯著影響（P＜0.05），在嗅聞過(guò)程中主要表現(xiàn)為脂肪味、酸腐味，雖然不是百香果香料主要的香氣輪廓，但缺失檢驗(yàn)顯示其對(duì)百香果香料的香氣存在影響。

3 結(jié)論

本研究證明了固相微萃取和溶劑輔助風(fēng)味蒸發(fā)是提取百香果香氣化合物較好的方法。通過(guò)香氣提取物稀釋分析共識(shí)別出71 種百香果香氣化合物，對(duì)它們進(jìn)行定量，并計(jì)算氣味活性值。其中β-大馬士酮的FD 因子與OAV 值最高，可被認(rèn)為是百香果香氣最重要的貢獻(xiàn)物。把FD≥8 或OAV≥1 的化合物進(jìn)行香氣重組與香氣缺失試驗(yàn)，結(jié)果表明重組模型與百香果香氣沒(méi)有明顯差異且5 組香氣化合物對(duì)百香果香氣存在影響。本研究彌補(bǔ)了百香果香氣化合物研究方向的空白，為百香果的產(chǎn)品質(zhì)量控制和工藝改進(jìn)提供了參考。