GEO基因芯片結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)探討人參-茯苓-白術(shù)配伍治療鼻咽癌作用機(jī)制及驗(yàn)證

王斐，朱鎮(zhèn)華

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙410007

鼻咽癌是一種頭頸部惡性腫瘤，具有病情隱匿的特點(diǎn)，70%的患者確診時(shí)已為晚期[1-2]。目前針對(duì)鼻咽癌的治療方案主要為放療與化療聯(lián)合應(yīng)用[3]，但多存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)問(wèn)題[4-6]。放化療常見唾液腺損傷、放射性皮膚損傷、耳鼻損傷等不良反應(yīng)[7]。尋找優(yōu)于現(xiàn)階段治療的方案，提高鼻咽癌治療的安全性及有效性是臨床亟待解決的問(wèn)題。

中醫(yī)耳鼻咽喉科臨床常見慢性疾病皆可追溯到脾虛的病機(jī)基礎(chǔ)。其病機(jī)大體為肺脾氣虛，無(wú)力托邪，外邪入里而為病。參苓白術(shù)散是中醫(yī)耳鼻咽喉科常用方劑，為健脾祛濕的代表方之一，藥理學(xué)研究表明其具有良好的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)及抗炎作用[8-10]。近年來(lái)，課題組在臨床中發(fā)現(xiàn)參苓白術(shù)散對(duì)鼻咽癌防治具有較好效果，但其具體分子機(jī)制尚不明確。目前，參苓白術(shù)散防治鼻咽癌的相關(guān)研究較少。本研究利用GEO基因芯片結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)對(duì)參苓白術(shù)散君藥人參-茯苓-白術(shù)配伍防治鼻咽癌的分子機(jī)制進(jìn)行探討，并通過(guò)CCK-8法及Western blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，以此推測(cè)參苓白術(shù)散在鼻咽癌防治過(guò)程中的作用，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 鼻咽癌靶點(diǎn)獲取

以“Nasopharyngeal carcinoma”為關(guān)鍵詞，檢索GEO數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），獲得正常人群與鼻咽癌患者的高通量測(cè)序數(shù)據(jù)集。通過(guò)R語(yǔ)言軟件進(jìn)行分析篩選，以|logFC|>1且Padj<0.05為條件篩選差異表達(dá)基因，繪制火山圖和熱圖。

1.2 人參-茯苓-白術(shù)配伍化學(xué)成分篩選

利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://tcmspw.com/tcmsp.php）分別檢索人參、茯苓、白術(shù)的化學(xué)成分，以毒藥物動(dòng)力學(xué)（ADME）[11]標(biāo)準(zhǔn)口服利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18為條件，對(duì)3種中藥的化學(xué)成分進(jìn)行篩選，得到人參-茯苓-白術(shù)配伍有效成分。

1.3 有效成分靶點(diǎn)獲取

使用TCMSP檢索人參-茯苓-白術(shù)有效成分相關(guān)靶點(diǎn)基因，并通過(guò)UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.uniprot.org/）對(duì)靶點(diǎn)名稱進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.4 化合物-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)及蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用Perl語(yǔ)言軟件獲得人參-茯苓-白術(shù)有效成分靶點(diǎn)基因與鼻咽癌差異表達(dá)基因的交集靶點(diǎn)，導(dǎo)入Cytoscape3.8.2軟件構(gòu)建化合物-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。并將其導(dǎo)入STRING11.0（https://string-db.org），得到蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，以大于中位值為標(biāo)準(zhǔn)篩選核心作用靶點(diǎn)。

1.5 GO及KEGG通路富集分析

運(yùn)用R 語(yǔ)言軟件ggplot2、clusterProfiler、enrichplot、org.Hs.eg.db 包對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO 和KEGG通路富集分析，得到人參-茯苓-白術(shù)配伍作用于鼻咽癌的主要通路，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

1.6 交集靶點(diǎn)-KEGG關(guān)系網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將人參-茯苓-白術(shù)配伍作用于鼻咽癌的主要通路與對(duì)應(yīng)交集靶點(diǎn)文件導(dǎo)入Cytoscape3.8.2軟件構(gòu)建交集靶點(diǎn)-KEGG關(guān)系網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行分析。

1.7 分子對(duì)接驗(yàn)證

通過(guò)UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)搜索鼻咽癌靶點(diǎn)蛋白，在RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(kù)下載蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)，在PubChem資源庫(kù)下載中藥有效成分2D結(jié)構(gòu)，利用Chem3D軟件進(jìn)行能量最小化處理，使用Sybyl軟件進(jìn)行分子對(duì)接。

1.8 體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.8.1 細(xì)胞株

人鼻咽癌細(xì)胞5-8F（低分化，北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院），經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)。

1.8.2 試劑與儀器

PLAU，武漢三鷹公司，批號(hào)17968-1-AP；環(huán)加氧酶2（COX2），美國(guó)CST公司，批號(hào)12282T；c-JUN，CST公司，批號(hào)9165T；β-谷甾醇、蘇齊內(nèi)酯、豆甾醇、花生四烯酸，上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)分別為B21972-20mg、B51017-5mg、B20314-20mg、B20540-20mg。NU-5810E型CO2培養(yǎng)箱，美國(guó)Forma公司；JY-600HE電泳儀、JY-ZY5電泳槽、JY-SCZ2+轉(zhuǎn)印槽，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；Microfuge 20R 高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf 公司；MS105 DU電子天平，瑞士Mettler-Toledo公司；BWS-27恒溫水浴箱，美國(guó)Pharmacia公司；AE2000倒置顯微鏡，日本Olympus公司；ELX800酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio-Tek公司；DW-HL388超低溫冰箱，美國(guó)Fisher公司；SJ-CJ-2FD單面凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；select渦旋振蕩器，美國(guó)SBP公司。

1.8.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的5-8F人鼻咽癌細(xì)胞，種入96孔板（每100 μL培養(yǎng)液中5×103個(gè)細(xì)胞），待細(xì)胞貼壁，每孔分別加入不同濃度的200 μL含藥培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組分別使用5、10、20、40、80 μmol/L花生四烯酸、蘇齊內(nèi)酯、豆甾醇及β-谷甾醇。設(shè)定空白孔（只加細(xì)胞培養(yǎng)液、不加5-8F細(xì)胞）用于吸光度（A值）校正。待藥物作用24、36、48 h后，將現(xiàn)配的CCK-8溶液100 μL分別加入包括空白孔的所有孔內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。于酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450 nm處檢測(cè)A值，計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增殖率[（實(shí)驗(yàn)組A值-空白組A值）÷（對(duì)照組A值-空白組A值）×100%]。

1.8.4 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期5-8F人鼻咽癌細(xì)胞，接種至培養(yǎng)皿，待細(xì)胞貼壁，設(shè)置溶劑對(duì)照組，并加入不同濃度含藥培養(yǎng)基（20、40 μmol/L花生四烯酸、蘇齊內(nèi)酯、豆甾醇及β-谷甾醇）藥物干預(yù)36 h后，提取總蛋白，參考胡晶等[12]方法進(jìn)行蛋白定量、電泳、轉(zhuǎn)膜、掃膜，并分析信號(hào)值，分別監(jiān)測(cè)分子對(duì)接所對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)蛋白（PTGS2、PLAU、JUN）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)均服從正態(tài)分布，以表示，多組間比較和單因素設(shè)計(jì)采用單因素方差分析，多重比較采用LSD法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鼻咽癌差異表達(dá)基因

通過(guò)檢索GEO數(shù)據(jù)庫(kù)，確定GPL6480數(shù)據(jù)集，該芯片數(shù)據(jù)集收集了18個(gè)正常人群鼻咽組織和18個(gè)原發(fā)鼻咽癌原發(fā)組織的基因表達(dá)譜。使用R語(yǔ)言軟件下載并分析原始數(shù)據(jù)，以Padj<0.05且|logFC|>1為條件進(jìn)行差異分析后獲得2 078個(gè)鼻咽癌差異表達(dá)基因，其中包含1 214個(gè)下調(diào)基因和864個(gè)上調(diào)基因，利用R語(yǔ)言繪制火山圖，見圖1。選取20個(gè)上調(diào)基因及20個(gè)下調(diào)基因繪制熱圖，見圖2。

圖1 鼻咽癌GPL6480數(shù)據(jù)集差異表達(dá)基因火山圖

圖2 鼻咽癌GPL6480數(shù)據(jù)集差異表達(dá)基因FC分析熱圖

2.2 人參-茯苓-白術(shù)有效成分

利用TCMSP平臺(tái)檢索人參、茯苓、白術(shù)的主要化學(xué)成分，以O(shè)B≥30%和DL≥0.18為條件篩選出有效化學(xué)成分共44種，其中人參22種、白術(shù)7種、茯苓15種，見表1。

表1 人參-茯苓-白術(shù)有效成分信息

2.3 化合物-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

應(yīng)用Perl語(yǔ)言分析獲得鼻咽癌差異表達(dá)基因與人參-茯苓-白術(shù)對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)基因的交集靶點(diǎn)共21個(gè)，與交集靶點(diǎn)相互作用的有效化合物共23個(gè)。以交集靶點(diǎn)與有效化合物數(shù)據(jù)構(gòu)建化合物-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，見圖3。該網(wǎng)絡(luò)共有44個(gè)節(jié)點(diǎn)和50條邊。人參、茯苓、白術(shù)中多個(gè)有效化合物可對(duì)應(yīng)相同的靶點(diǎn)，而不同靶點(diǎn)也可對(duì)應(yīng)同一有效化合物，表明人參-茯苓-白術(shù)配伍多成分、多靶點(diǎn)作用于鼻咽癌的特點(diǎn)。

圖3 人參-茯苓-白術(shù)治療鼻咽癌化合物-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.4 交集靶點(diǎn)蛋白相互作用分析

將21個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING平臺(tái)，設(shè)置置信度>0.150，剔除沒有相互關(guān)系的靶點(diǎn)，得到圖4A。設(shè)置置信度>0.400，提取圖4A 中關(guān)聯(lián)更緊密的網(wǎng)絡(luò)，得到圖4B。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.8.2，利用cytoNCA插件及R語(yǔ)言，以大于中位值為條件篩選核心基因，得到圖4C，提取核心基因，生成網(wǎng)絡(luò)，見圖4D。分析得到JUN、IL1B、PLAU、STAT1、PTGS2 共5 個(gè)核心靶點(diǎn)，可認(rèn)為這些靶點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中起重要作用。

圖4 人參-茯苓-白術(shù)治療鼻咽癌交集靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

2.5 GO及KEGG通路富集分析

對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG通路富集分析。以Padj<0.05為標(biāo)準(zhǔn)分別確定前15個(gè)生物過(guò)程（BP）、分子功能（CC）、細(xì)胞成分（MF）的GO條目，見圖5?？梢钥闯?，相關(guān)性最大的生物過(guò)程有活性氧生物合成過(guò)程、一氧化氮生物合成過(guò)程、一氧化氮代謝過(guò)程、活性氮類代謝過(guò)程等，分子功能有類固醇結(jié)合、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性、絲氨酸型肽酶活性、絲氨酸水解酶活性等，細(xì)胞成分有細(xì)胞器外膜等。交集靶點(diǎn)KEGG通路富集分析見圖6，主要涉及腫瘤、代謝、免疫、炎癥等方面信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。

圖5 人參-茯苓-白術(shù)治療鼻咽癌交集靶點(diǎn)GO功能富集分析

圖6 人參-茯苓-白術(shù)治療鼻咽癌交集靶點(diǎn)KEGG通路富集分析

2.6 交集靶點(diǎn)-KEGG關(guān)系網(wǎng)絡(luò)

將人參-茯苓-白術(shù)配伍治療鼻咽癌涉及的主要通路與對(duì)應(yīng)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape3.8.2軟件構(gòu)建交集靶點(diǎn)-KEGG關(guān)系網(wǎng)絡(luò)（見圖7）。該網(wǎng)絡(luò)有41個(gè)節(jié)點(diǎn)（21個(gè)交集靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)和20個(gè)通路節(jié)點(diǎn)）和77條邊?？梢钥闯?，IL1B、JUN 基因及Leishmaniasis 信號(hào)通路（hsa05140）、Rheumatoid arthritis 信號(hào)通路（hsa05323）、IL-17信號(hào)通路（hsa04657）、Fluid shear stress and atherosclerosis信號(hào)通路（hsa05418）在該網(wǎng)絡(luò)中起到核心調(diào)控作用。

圖7 人參-茯苓-白術(shù)治療鼻咽癌交集靶點(diǎn)-KEGG關(guān)系網(wǎng)絡(luò)

2.7 分子對(duì)接

將鼻咽癌靶點(diǎn)蛋白導(dǎo)入Sybyl軟件，加氫并修復(fù)側(cè)鏈后基于Ligand（配體）模式（未發(fā)現(xiàn)配體的使用automatic 模式）產(chǎn)生活性口袋，以SFXC 格式保存，其他參數(shù)均設(shè)為默認(rèn)值。將已進(jìn)行能量?jī)?yōu)化的人參-茯苓-白術(shù)有效化合物導(dǎo)入軟件，依次與相應(yīng)的靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行對(duì)接，對(duì)接結(jié)果根據(jù)Total-Score 進(jìn)行評(píng)價(jià)，以Total-Score>5為閾值，該值越大，表明配合作用越好。對(duì)接結(jié)果見表2，對(duì)接模式見圖8。

表2 人參-茯苓-白術(shù)有效成分與靶點(diǎn)蛋白分子對(duì)接結(jié)果

圖8 人參-茯苓-白術(shù)有效成分與靶點(diǎn)蛋白分子對(duì)接模式

2.8 體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.8.1 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖

藥物干預(yù)24、36、48 h，與對(duì)照組比較，不同濃度花生四烯酸、蘇齊內(nèi)酯、豆甾醇、β-谷甾醇均可抑制鼻咽癌5-8F細(xì)胞增殖（P<0.05，P<0.01），見圖9。

圖9 人參-茯苓-白術(shù)有效成分對(duì)5-8F細(xì)胞增殖的抑制作用

2.8.2 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)

根據(jù)分子對(duì)接結(jié)果，花生四烯酸與PTGS2、蘇齊內(nèi)酯與PTGS2、豆甾醇與PLAU、β-谷甾醇與JUN配合效果好。Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，花生四烯酸組和蘇齊內(nèi)酯組PTGS2表達(dá)降低（P<0.05，P<0.01），豆甾醇組PLAU表達(dá)降低（P<0.01），β-谷甾醇組c-JUN表達(dá)降低（P<0.01）。見圖10。

圖10 人參-茯苓-白術(shù)治療鼻咽癌有效化合物對(duì)靶點(diǎn)蛋白表達(dá)的影響

3 討論

鼻咽癌屬中醫(yī)學(xué)“上石疽”“失榮”“真頭痛”等范疇，現(xiàn)代亦稱為“頏顙巖”，多為正氣虧虛，氣虛染毒所致。脾為氣血生化之源，脾氣健則氣血生化有源，正氣足則外毒無(wú)以入侵。參苓白術(shù)散以人參、茯苓、白術(shù)為君藥，方中人參大補(bǔ)脾胃之氣，并鼓動(dòng)全身正氣，白術(shù)、茯苓健脾滲濕，脾氣健而氣血生化有源。

本研究利用GEO數(shù)據(jù)庫(kù)得到2 078個(gè)鼻咽癌差異表達(dá)基因。利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)獲得人參-茯苓-白術(shù)44種有效化學(xué)成分，二者交集靶點(diǎn)21個(gè)，包括PTGS2等5 個(gè)核心靶點(diǎn)。對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行蛋白相互作用分析、GO和KEGG通路富集分析，發(fā)現(xiàn)主要通過(guò)活性氧及一氧化氮生物合成過(guò)程、類固醇結(jié)合等生物過(guò)程，及代謝、炎癥等通路發(fā)揮作用。

研究發(fā)現(xiàn)，花生四烯酸可通過(guò)抑制代謝產(chǎn)物的生成途徑抑制促炎癥因子的表達(dá)，起到保護(hù)血管內(nèi)皮和抗炎的作用[13]；另外，花生四烯酸及其代謝產(chǎn)物在腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移、凋亡、血管新生和炎癥反應(yīng)及其治療和預(yù)后方面具有重要作用[14]。體外實(shí)驗(yàn)表明，豆甾醇能抑制肝癌、胃癌、皮膚癌等多種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，其機(jī)制主要涉及上調(diào)凋亡基因表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、破壞腫瘤血管的生成等[15]。β-谷甾醇能通過(guò)多種細(xì)胞信號(hào)途徑抑制多種癌癥如乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、胃癌等的發(fā)生與發(fā)展[16]。

PTGS2是合成前列腺素的關(guān)鍵酶，即COX-2，可將花生四烯酸轉(zhuǎn)化為PGH2進(jìn)而導(dǎo)致炎癥[17]。COX-2高表達(dá)可見于許多腫瘤，能誘導(dǎo)致癌物的活化，促進(jìn)腫瘤血管生成、腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，影響細(xì)胞周期變化，促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制凋亡，并可能降低腫瘤細(xì)胞對(duì)放療及化療的敏感性[18-23]。朱德為等[24]對(duì)79例鼻咽癌患者的鼻咽組織進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)COX-2總陽(yáng)性率達(dá)63.3%。朱洪海等[25]研究104例鼻咽癌患者，發(fā)現(xiàn)COX-2在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者比例更高，提示COX-2可能與鼻咽癌的復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)。

綜上所述，人參-茯苓-白術(shù)治療鼻咽癌可從多成分、多靶點(diǎn)、多通路對(duì)疾病發(fā)展進(jìn)行調(diào)控。本研究以參苓白術(shù)散的臨床功效為基礎(chǔ)，選取其君藥進(jìn)行分析?；谏鲜鼋Y(jié)果，后續(xù)可從以下幾方面進(jìn)行探索：圍繞參苓白術(shù)散復(fù)方開展“病-證-方”關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)研究，在臨床實(shí)踐基礎(chǔ)上構(gòu)建“鼻咽癌-脾虛濕盛證-參苓白術(shù)散”模型，開展更廣泛的臨床及基礎(chǔ)研究，為鼻咽癌的臨床治療提供新思路；對(duì)參苓白術(shù)散的核心成分如花生四烯酸、豆甾醇和β-谷甾醇等展開更多基礎(chǔ)研究，如拆方驗(yàn)證、血清藥理學(xué)和動(dòng)物細(xì)胞模型驗(yàn)證等；進(jìn)一步探索PTGS2與鼻咽癌的相關(guān)性。本研究尚存在一定局限性：研究局限于參苓白術(shù)散君藥，未納入其他藥物；中藥復(fù)方成分復(fù)雜，活性成分之間的相互作用、各靶點(diǎn)的調(diào)控強(qiáng)度等因素未能納入計(jì)算。