AACO方調(diào)控TGF-β1/Smad3信號通路保護慢性心力衰竭小鼠心肌纖維化的作用機制研究

王新婷，魯成，宋磊，鐘逸航，劉永明

1.上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院，上海 201203；2.國家中醫(yī)心血管臨床醫(yī)學研究中心分中心，上海 201203；3.上海中醫(yī)藥大學附屬第七人民醫(yī)院，上海 200137；4.六安市中醫(yī)院，安徽 六安237000

2021年歐洲心臟病學會指南定義心力衰竭（heart failure，HF）不是單一的病理診斷，是以呼吸困難、踝關(guān)節(jié)腫脹、疲乏等為主要癥狀的復雜臨床綜合征，可能伴有頸靜脈壓升高、外周水腫等體征[1]。全球約6 430萬人患有HF[2]，而25%～40%的患者在HF一年后死于慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）[3-4]。HF是導致全球2 400多萬人死亡的主要原因[5]。我國HF患者人數(shù)約450萬例，患病率為0.9%，病死率為12.3%，住院病死率為4.1%[6-7]。CHF患病率高、再住院率高、病死率高，已成為全球最主要的公共衛(wèi)生問題[8]。

HF伴隨心肌纖維化的病理改變，研究表明，心肌纖維化程度可以預測主要心血管不良事件及死亡，是判斷HF 治療有效性的重要指標[9-10]。TGF-β1/Smad3信號通路是纖維化形成的主要途徑之一，在小鼠主動脈弓縮窄（TAC）誘導心肌肥厚的反應性纖維化和心肌梗死后的修復性纖維化中起主要作用[11]。中藥可通過抑制TGF-β1/Smad3信號通路活性顯著改善CHF心肌纖維化[12]。

CHF病機為心陽受損導致心腎陽氣互資障礙，課題組前期運用均勻設計模型通過體內(nèi)外實驗篩選出附子、麥冬、黃芪、莪術(shù)按照4∶4∶2∶1質(zhì)量配比，命名為AACO方[13]。方中附子、黃芪益氣溫陽，以溫振心腎陽氣，改善陽氣互資；莪術(shù)行氣活血，麥冬滋陰，助陰平陽秘。本研究通過TAC術(shù)建立誘導CHF小鼠模型，觀察AACO 方對CHF 心肌纖維化的影響，基于TGF-β1/Smad3信號通路探討其可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

6 周齡SPF 級雄性C57BL/6J 小鼠40 只，體質(zhì)量（20±2）g，上海靈暢生物科技有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（滬）2018-0003。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心SPF級環(huán)境。本研究經(jīng)上海中醫(yī)藥大學實驗動物福利與倫理委員會審批（PZSHUTCM210730007）。

1.2 藥物

AACO方（附子、麥冬、黃芪、莪術(shù)），免煎顆粒購自上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院中藥房，與飲片換算比例分別為附子1∶6、麥冬3∶10、黃芪3∶10、莪術(shù)1∶20。按中藥飲片4∶4∶2∶1質(zhì)量配比，加入雙蒸水溶解，制備成原藥材濃度為0.113 g/mL混懸液，密封、4 ℃避光保存?？ňS地洛片，齊魯制藥有限公司，10 mg/片，批號2C0094D26，制成濃度為0.2 mg/mL混懸液，密封、4 ℃避光保存。

1.3 主要試劑與儀器

Ⅰ型膠原（ColⅠ，貨號91144S），美國CST 公司；兔抗小鼠轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1，貨號3709）、Smad3（貨號9523）、p-Smad3（貨號9523）、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA，貨號19245）一抗，美國CST公司；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG（貨號A208），上海碧云天；HiScript ⅡQ RT SuperMix for qPCR（貨號R223-01）、AceQTMUniversal SYBR qPCR Master Mix（貨號Q511-02/03），南京諾唯贊。超高分辨率小動物超聲儀（型號Vevo2100，美國Visualsonics 公司），RT-qPCR 儀（型號Quanstudio 6 Flex，美國Applied Biosystems公司），電泳儀（型號LM61-PowerPac Universal，美國Bio-Rad公司），電泳槽（型號DYC-Mini4，北京東方瑞利科技有限公司）。

1.4 分組與造模

40只小鼠適應性飼養(yǎng)1周后，隨機取10只作為假手術(shù)組，剩余30只小鼠行TAC術(shù)造模。術(shù)前24 h，用脫毛膏對小鼠胸前區(qū)進行脫毛處理，術(shù)前12 h禁食，自由飲水。稱量小鼠體質(zhì)量，3%戊巴比妥鈉3 mL/kg腹腔注射麻醉，仰臥位固定四肢及軀干，胸前手術(shù)區(qū)域碘伏消毒，以正中線第一肋骨位置為中心，縱向剪開皮膚，緊貼胸骨柄左側(cè)緣，連帶肌肉剪斷第一肋骨至第二肋骨上緣，使用自制拉鉤撐開縱膈，分離胸腺，暴露主動脈弓，用顯微鑷夾住7-0絲線，環(huán)繞主動脈弓，將27G胰島素針頭置于主動脈弓和絲線之間進行墊扎，造成TAC。結(jié)扎絲線，抽出針頭，恢復胸腺位置，用4-0針線快速對兩側(cè)縱膈進行“8”字縫合，擠壓胸膈排出氣體，縫合皮膚后用碘伏再次消毒，放于37 ℃恒溫墊上進行保溫。待小鼠恢復自主呼吸后，將其放回籠內(nèi)正常飼養(yǎng)。假手術(shù)組只開胸，不進行主動脈弓結(jié)扎。術(shù)后將30只小鼠隨機分為模型組、AACO方組和卡維地洛組，每組10只。

1.5 給藥

造模后次日開始給藥，根據(jù)人與小鼠體表面積換算等效劑量，AACO方組予AACO方混懸液6.93 g/kg（相當于免煎顆粒1.586 mg/kg）灌胃，卡維地洛組予卡維地洛混懸液1.73 mg/kg灌胃，假手術(shù)組和模型組予等量雙蒸水灌胃，每日1次，連續(xù)8周。

1.6 超聲心動圖檢測

給藥結(jié)束后，使用脫毛膏對小鼠胸前區(qū)域進行脫毛，異氟烷吸入麻醉，仰臥位固定，將超聲探頭置于小鼠左胸部，使用小動物超聲儀行超聲心動圖檢測，選取左心室長軸切面，檢測心率、左室射血分數(shù)（LVEF）、左室短軸縮短率（FS）、左室舒張末期內(nèi)徑（LVIDd）。各指標測量5個心動周期并計算平均值。

1.7 組織形態(tài)學檢測

分離小鼠心臟，置于4%多聚甲醛中固定48 h，取1/3橫截面組織，置入包埋盒，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋，切片（厚度5 μm），脫蠟至水，分別進行HE染色、Masson染色、苦味酸天狼猩紅染色，二甲苯透明，封片。觀察心臟形態(tài)和心肌纖維化情況，Image J軟件計算Masson染色、苦味酸天狼猩紅染色切片膠原面積或纖維化面積占心肌總面積的百分比，計算膠原容積分數(shù)（CVF）和心肌纖維化面積比。CVF（%）=膠原面積/總面積×100%，心肌纖維化面積比（%）=纖維化面積/總面積×100%。

1.8 免疫熒光染色

心臟組織石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，0.01 mol/L檸檬酸鈉（pH 6.0）高壓修復，PBS 洗3 次，每次5 min；3%H2O2室溫避光孵育10 min去除內(nèi)源性酶，PBS洗5 min×3次；10%BSA室溫封閉30 min，加入α-SMA一抗（1∶1 000）、ColⅠ一抗（1∶200），4 ℃孵育過夜；PBS洗3次，滴加熒光二抗（1∶100），室溫避光孵育1 h，PBS 洗3 次，10%BSA 室溫封閉1 h，加入α-SMA一抗（1∶1 000）、ColⅠ一抗（1∶200），室溫孵育2 h，PBS洗3次，滴加熒光二抗（1∶100），室溫避光孵育1 h，PBS 洗3 次，DAPI 染細胞核10 min，PBS洗3次，封片。觀察心臟組織α-SMA和ColⅠ熒光表達情況，Image J軟件計算α-SMA和ColⅠ熒光面積比（熒光面積/總面積×100%）。

1.9 RT-qPCR檢測

取心尖組織，加入Trizol 試劑提取總RNA，將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，參照AceQTMUniversal SYBR qPCR Master Mix試劑盒說明書配制10 μL反應體系，反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃、5 min，共40個循環(huán)；95 ℃、15 s，60 ℃、60 s，95 ℃、15 s。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算各基因相對表達量。引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

1.10 Western blot檢測

取心尖組織，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，加入loading buffer，蛋白變性后，20 μg蛋白上樣，凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入α-SMA、TGF-β1、Smad3、p-Smad3一抗（均為1∶1 000），4 ℃孵育過夜，PBST洗滌3次，加入二抗孵育1 h，PBST 洗滌3 次，增強ECL 發(fā)光液顯影，Image J軟件分析蛋白灰度值。

1.11 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 AACO方對模型小鼠超聲心動圖指標的影響

與假手術(shù)組比較，模型組小鼠LVEF、FS顯著減少（P<0.01），LVIDd顯著增加（P<0.01）；與模型組比較，AACO方組和卡維地洛組小鼠LVEF、FS顯著增加（P<0.01），LVIDd顯著減少（P<0.01）。各組小鼠心率差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見圖1、表2。

圖1 各組小鼠超聲心動圖

表2 各組小鼠超聲心動圖指標比較（）

表2 各組小鼠超聲心動圖指標比較（）

注：與假手術(shù)組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01

2.2 AACO方對模型小鼠心臟病理變化的影響

HE染色顯示，假手術(shù)組小鼠心臟形態(tài)正常，心肌呈束狀分布，心肌細胞排列有序、間質(zhì)緊密；模型組小鼠心臟、心肌細胞明顯增大，心肌細胞排列紊亂，心肌間質(zhì)疏松；AACO方組和卡維地洛組小鼠心臟、心肌細胞無明顯增大，心肌細胞排列較為規(guī)則。見圖2。

圖2 各組小鼠心臟組織形態(tài)（HE染色）

與假手術(shù)組比較，模型組小鼠心臟組織CVF和心肌纖維化面積比顯著增加（P<0.01）；與模型組比較，AACO方組和卡維地洛組小鼠心臟組織CVF和心肌纖維化面積比顯著減少（P<0.05，P<0.01）。見圖3、圖4、表3。

圖3 各組小鼠心臟組織形態(tài)（Masson染色，標尺=50 μm）

圖4 各組小鼠心臟組織形態(tài)（苦味酸天狼猩紅染色，標尺=50 μm）

表3 各組小鼠心臟組織CVF和心肌纖維化面積比比較（，%）

表3 各組小鼠心臟組織CVF和心肌纖維化面積比比較（，%）

注：與假手術(shù)組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

2.3 AACO 方對模型小鼠心臟組織α-平滑肌肌動蛋白和Ⅰ型膠原表達的影響

與假手術(shù)組比較，模型組小鼠心臟組織α-SMA和Col Ⅰ表達顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，AACO 方組和卡維地洛組小鼠心臟組織α-SMA 和ColⅠ表達顯著降低（P<0.01）。見圖5、圖6、表4。

表4 各組小鼠心臟組織α-SMA和ColⅠ表達比較（，熒光面積比，%）

表4 各組小鼠心臟組織α-SMA和ColⅠ表達比較（，熒光面積比，%）

注：與假手術(shù)組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01

圖5 各組小鼠心臟組織α-SMA表達（免疫熒光染色，標尺=50 μm）

圖6 各組小鼠心臟組織ColⅠ表達（免疫熒光染色，標尺=50 μm）

2.4 AACO 方對模型小鼠心尖組織Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原mRNA表達的影響

與假手術(shù)組比較，模型組小鼠心尖組織ColⅠ和ColⅢmRNA表達顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，AACO方組和卡維地洛組小鼠心尖組織ColⅠ、ColⅢmRNA表達顯著降低（P<0.01）。見表5。

表5 各組小鼠心尖組織ColⅠ、ColⅢmRNA表達比較（）

表5 各組小鼠心尖組織ColⅠ、ColⅢmRNA表達比較（）

注：與假手術(shù)組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01

2.5 AACO方對模型小鼠心尖組織TGF-β1/Smad3信號通路相關(guān)蛋白表達的影響

與假手術(shù)組比較，模型組小鼠心尖組織α-SMA、p-Smad3、TGF-β1 蛋白表達顯著升高（P<0.05，P<0.01）；與模型組比較，AACO方組和卡維地洛組小鼠心尖組織α-SMA、p-Smad3、TGF-β1蛋白表達顯著降低（P<0.05，P<0.01）。見表6、圖7。

表6 各組小鼠心尖組織α-SMA、Smad3、p-Smad3、TGF-β1蛋白表達比較（）

表6 各組小鼠心尖組織α-SMA、Smad3、p-Smad3、TGF-β1蛋白表達比較（）

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

圖7 各組小鼠心尖組織α-SMA、Smad3、p-Smad3、TGF-β1蛋白免疫印跡

3 討論

心肌纖維化是CHF的主要病理變化之一，是不良心肌重構(gòu)的主要表現(xiàn)，而心肌重構(gòu)又可降低組織順應性，損傷心臟功能，促進心律失常發(fā)生，加速HF進展[14]。膠原是細胞外基質(zhì)的主要成分，其中ColⅠ約占85%，ColⅢ約占11%[15]。TGF-β1是多效性細胞因子，參與多種細胞功能，對炎癥、細胞外基質(zhì)沉積、細胞增殖、分化具有重要調(diào)節(jié)作用。過表達TGF-β1能加速心肌肥厚和心肌纖維化發(fā)展[16]，TAC所致心臟重構(gòu)動物模型中，TGF-β1水平顯著升高[17]，TGF-β1/Smad3信號通路激活，p-Smad3表達增加，誘導肌成纖維細胞標志物α-SMA 表達升高，加速心肌纖維化發(fā)展[18]，Smad3敲除小鼠心肌梗死后擴張性心肌重構(gòu)減少，舒張功能障礙減輕[19]。本研究選取β受體阻滯劑卡維地洛作為陽性對照，研究顯示，卡維地洛可通過抑制TGF-β1表達改善心肌纖維化，保護心臟功能[20-21]，且卡維地洛可通過抑制TGF-β1/Smad3信號通路減少膠原合成，改善大鼠肝硬化[22]。

CHF屬中醫(yī)學“心痹”“心水”范疇，為本虛標實之證，其病機可概括為“瘀”“虛”“水”[23]。AACO方源于坎離顆粒，原方以溫振心腎陽氣、利水活血為治法而創(chuàng)，對CHF療效確切[24-25]。課題組前期通過均勻設計篩選出坎離顆粒防治CHF的最佳中藥及配比，命名為AACO方。本研究結(jié)果顯示，AACO方可提高CHF小鼠LVEF和FS，降低LVIDd，改善心肌纖維化。

為進一步研究AACO方防治CHF心肌纖維化的作用機制，本研究檢測TGF-β1/Smad3信號通路關(guān)鍵靶點TGF-β1、Smad3、p-Smad3、α-SMA、ColⅠ、ColⅢ表達。結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組小鼠心尖組織TGF-β1、p-Smad3、α-SMA、ColⅠ、ColⅢ表達均顯著升高；與模型組比較，AACO方組和卡維地洛組小鼠心尖組織TGF-β1、p-Smad3、α-SMA、ColⅠ、ColⅢ表達均顯著降低，且AACO方與卡維地洛作用相當，提示AACO 方抑制CHF 心肌纖維化可能與抑制TGF-β1表達及下游Smad3磷酸化有關(guān)。

綜上所述，AACO方可顯著抑制CHF小鼠心肌纖維化，其機制可能與抑制TGF-β1/Smad3 信號通路有關(guān)。