澤漆化痰方對慢性阻塞性肺疾病氣道黏液高分泌大鼠腸道EGFR-MUC2信號通路相關(guān)因子的影響

沈書揚，高陽，王傳旭，傅慧婷

上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院，上海201203

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是以慢性支氣管炎、肺氣腫為主要病理基礎(chǔ)的慢性疾病，主要表現(xiàn)為持續(xù)的呼吸系統(tǒng)功能異常和通氣受限[1]。氣道黏液高分泌是促進COPD病情發(fā)展的關(guān)鍵因素，有效抑制氣道黏液高分泌是治療氣道炎性病變的關(guān)鍵[2]。氣道黏液高分泌與表皮生長因子受體（EGFR）信號通路密切相關(guān)，EGFRSP1通路和EGFR-ERK1/2通路可同時調(diào)控氣道黏蛋白（MUC）5AC和腸道MUC2表達，通過豆蔻酰化富丙氨酸激酶C底物（MARCKS）介導的胞吐作用引起氣道黏液高分泌[3-6]。

大腸與肺都源于原腸胚的內(nèi)胚層，結(jié)構(gòu)上具有相似性，且兩者在生理病理上相互影響，由此產(chǎn)生“腸-肺軸”的概念[7]，與“肺與大腸相表里”的中醫(yī)理論吻合。澤漆化痰方是上海中醫(yī)藥大學黃吉賡教授治療痰飲經(jīng)驗方，全方升降并舉，調(diào)理氣機，外透內(nèi)散，使肺氣宣降，水道通調(diào)，而痰飲自消[8]。前期研究發(fā)現(xiàn)，澤漆化痰方可通過調(diào)控肺部EGFR介導的炎癥信號通路抑制氣道黏液分泌[9-11]?；诖?，本研究通過建立COPD氣道黏液高分泌大鼠模型，觀察澤漆化痰方對模型大鼠腸道炎癥反應的影響，從調(diào)控腸道炎癥角度探討其治療COPD的作用機制，為COPD的中醫(yī)治療提供依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級雄性Wistar大鼠48只，6～8周齡，體質(zhì)量200～220 g，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（滬）2017-0005。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心，溫度22～23 ℃，濕度55%～60%，12 h光照。實驗操作嚴格遵守《中華人民共和國實驗動物管理條例》相關(guān)規(guī)定，并經(jīng)上海中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會審查批準（PZSHUTCM210903016）。

1.2 藥物及制備

澤漆化痰方（澤漆30 g，柴胡15 g，竹瀝半夏15 g，紫菀15 g，款冬花15 g，白前12 g，前胡12 g，桔梗9 g，枳殼9 g，陳皮9 g，甘草9 g），飲片由上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院提供，常規(guī)煎煮，濃縮至原藥材濃度為3.2 g/mL。AG1478，美國Calbiochem公司，貨號ICG1024，加入適量DMSO助溶，超聲振蕩混勻，配制成濃度為1 mg/mL溶液。

1.3 主要試劑與儀器

EGFR 抗體，英國Abcam 公司，貨號ab52894；p-EGFR抗體，美國CST公司，貨號3777；MUC2抗體（分別用于Western blot和免疫熒光），英國Abcam公司、美國Thermo Fisher Scientific公司，貨號分別為ab272692、PA5- 103083；腫瘤壞死因子（TNF）-α ELISA試劑盒、白細胞介素（IL）-10 ELISA試劑盒、IL-13 ELISA試劑盒，上海酶聯(lián)生物科技有限公司，貨號分別為ml002859、ml002813、ml 003012；脂多糖（LPS），英國Sigma 公司，貨號L2880。冷凍離心機（德國Eppendorf公司，型號5415R），攤片機（浙江科迪儀器有限公司，型號KD-H），切片機（上海徠卡儀器有限公司，型號RM2016），包埋機（浙江科迪儀器有限公司，型號KD-BL），電泳及轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad 公司，型號170-4070），全功能酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司，型號MK3），紫外分光光度計（上海美析儀器有限公司，型號UV-1800PC）。

2 實驗方法

2.1 分組、造模及給藥

48只大鼠隨機分為空白組、模型組、AG1478組和澤漆化痰方低、中、高劑量組，每組8只。除空白組外，其余各組進行造模，造模周期28 d。第1、14日，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉大鼠，用5 g/L LPS進行氣道滴注，滴注量50 μL；剩余時間將大前門牌香煙點燃后放入裝有大鼠的煙熏箱內(nèi)煙熏1 h，每日2 次（上午8:30、下午1:30），每次15支。造模第14日開始，澤漆化痰方低、中、高劑量組分別予澤漆化痰方湯劑16、32、64 g/kg灌胃，AG1478組予AG1478溶液10 mg/kg灌胃，給藥時間每日上午8:00，空白組及模型組予等量生理鹽水灌胃，連續(xù)14 d。

2.2 取材

給藥結(jié)束后次日取材，取材前大鼠禁食12 h，腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉，仰臥位固定，剪去腹部毛發(fā)，切開腹部，取大腸組織橫結(jié)腸段，一部分用4%甲醛溶液固定，用于免疫熒光染色，另一部分置于-80 ℃冷凍保存，用于蛋白檢測。取降結(jié)腸段，分3次注入10 mL PBS，反復吹打后將腸黏液轉(zhuǎn)移至15 mL離心管，用于ELISA檢測。打開胸部，取右肺組織，4%甲醛溶液固定，用于病理觀察。

2.3 病理觀察

取大鼠右肺組織，4%甲醛固定，梯度乙醇脫水，浸蠟，包埋，切片，烤片，脫蠟后行PAS染色，中性樹脂封片，光鏡下觀察大鼠肺組織病理形態(tài)。

2.4 ELISA檢測

腸黏液4 ℃、5 000 r/min離心15 min，取上清液，按ELISA試劑盒說明書步驟操作，酶標儀波長450 nm處測量OD值，根據(jù)標準曲線計算樣品TNF-α、IL-13、IL-10含量。

2.5 Western blot檢測

RIPA法裂解結(jié)腸組織提取總蛋白，BCA法蛋白定量，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入EGFR一抗（1∶1 000）、p-EGFR 一抗（1∶500）、MUC2 一抗（1∶1 000）、GAPDH一抗（1∶1 000），4 ℃孵育過夜。1×TBST漂洗，加入HRP標記山羊抗兔IgG（1∶1 000），室溫振搖孵育1 h，1×TBST漂洗，ECL化學發(fā)光法顯影，計算目的蛋白相對表達量。

2.6 免疫熒光檢測

結(jié)腸組織石蠟切片脫蠟，抗原修復，1%BSA封閉，加入1%BSA 稀釋的p-EGFR 一抗（1∶800）、MUC2一抗（1∶500），4 ℃孵育過夜，加入熒光二抗（1∶500），避光孵育1 h，DAPI復染，中性樹脂封片，計算陽性表達面積比。

3 統(tǒng)計學方法

4 結(jié)果

4.1 澤漆化痰方對模型大鼠肺組織病理形態(tài)的影響

空白組大鼠氣道黏膜上皮完整，杯狀細胞少見，黏膜下腺體無異常增生，氣道壁厚度正常，氣道通暢，腔內(nèi)無分泌物阻塞；模型組大鼠可見氣道上皮纖毛脫落，杯狀細胞數(shù)目顯著增多，黏膜下腺體肥大增生，表明模型制備成功；澤漆化痰方各劑量組和AG1478組大鼠杯狀細胞數(shù)目減少，黏膜下腺體增生減輕，上皮脫落壞死程度改善，其中澤漆化痰高劑量組最顯著。見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織形態(tài)（PAS染色，×400）

4.2 澤漆化痰方對模型大鼠腸黏液炎癥因子含量的影響

與空白組比較，模型組大鼠腸黏液TNF-α、IL-13含量顯著增加（P<0.05），IL-10 含量顯著減少（P<0.05）；與模型組比較，澤漆化痰方低、中、高劑量組和AG1478組大鼠腸黏液TNF-α、IL-13含量顯著減少（P<0.05），IL-10含量顯著增加（P<0.05）；與AG1478組比較，澤漆化痰方中、高劑量組大鼠腸黏液IL-13含量顯著減少（P<0.05），IL-10 含量顯著增加（P<0.05）；與澤漆化痰方低劑量組比較，澤漆化痰方中、高劑量組大鼠腸黏液TNF-α、IL-13含量顯著降低（P<0.05），IL-10含量顯著增加（P<0.05）。見表1。

表1 各組大鼠腸黏液TNF-α、IL-13、IL-10含量比較（，pg/mL）

表1 各組大鼠腸黏液TNF-α、IL-13、IL-10含量比較（，pg/mL）

注：與空白組比較，*P<0.05；模型組比較，#P<0.05；與AG1478組比較，△P<0.05；與澤漆化痰方低劑量組比較，▲P<0.05；與澤漆化痰方中劑量組比較，□P<0.05

4.3 澤漆化痰方對模型大鼠結(jié)腸組織表皮生長因子受體、黏蛋白2蛋白表達的影響

Western blot結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織p-EGFR、MUC2蛋白表達顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，澤漆化痰方各劑量組大鼠結(jié)腸組織p-EGFR、MUC2 蛋白表達顯著降低（P<0.05），AG1478組p-EGFR蛋白表達顯著降低（P<0.05）；與AG1478組比較，澤漆化痰方各劑量組大鼠結(jié)腸組織MUC2蛋白表達顯著降低（P<0.05）；與澤漆化痰方低劑量組比較，澤漆化痰方中、高劑量組大鼠結(jié)腸組織MUC2蛋白表達顯著降低（P<0.05）。見圖2、表2。

表2 各組大鼠結(jié)腸組織p-EGFR、MUC2蛋白表達比較（，相對灰度值）

表2 各組大鼠結(jié)腸組織p-EGFR、MUC2蛋白表達比較（，相對灰度值）

注：與空白組比較，*P<0.05；模型組比較，#P<0.05；與AG1478組比較，△P<0.05；與澤漆化痰方低劑量組比較，▲P<0.05

圖2 各組大鼠結(jié)腸組織p-EGFR、EGFR、MUC2蛋白免疫印跡

免疫熒光染色結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織p-EGFR、MUC2陽性表達顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，澤漆化痰方各劑量組和AG1478 組大鼠結(jié)腸組織p-EGFR 陽性表達顯著降低（P<0.05），澤漆化痰方中、高劑量組大鼠結(jié)腸組織MUC2陽性表達顯著降低（P<0.05）；與AG1478組比較，澤漆化痰方高劑量組大鼠結(jié)腸組織MUC2陽性表達顯著降低（P<0.05）；與澤漆化痰方低劑量組比較，澤漆化痰方中、高劑量組大鼠結(jié)腸組織MUC2陽性表達顯著降低（P<0.05）。見圖3、圖4、表3。

表3 各組大鼠結(jié)腸組織p-EGFR、MUC2蛋白表達比較（，陽性面積比）

表3 各組大鼠結(jié)腸組織p-EGFR、MUC2蛋白表達比較（，陽性面積比）

注：與空白組比較，*P<0.05；模型組比較，#P<0.05；與AG1478組比較，△P<0.05；與澤漆化痰方低劑量組比較，▲P<0.05

圖3 各組大鼠結(jié)腸組織p-EGFR陽性表達（免疫熒光染色，×200）

圖4 各組大鼠結(jié)腸組織MUC2蛋白陽性表達（免疫熒光染色，×200）

5 討論

氣道黏液高分泌表現(xiàn)為慢性咳嗽、咳痰，大量分泌的黏液聚集于氣道管腔造成持續(xù)性氣流受限，導致COPD患者呼吸道反復炎癥，且其引發(fā)的陣發(fā)性咳嗽是COPD重要且獨立的危險因素[12]。COPD動物模型建立包括單純煙熏法、蛋白水解酶誘導法、內(nèi)毒素誘導法、基因敲除等[13]，本研究最終確定以煙熏合并LPS氣道內(nèi)滴入的方法造模，因其病理改變與人類COPD特征更為接近，且所需時間較短。第28 日造模結(jié)束后，PAS染色可見大鼠肺部上皮纖毛脫落、杯狀細胞增生、黏膜下腺體肥大，提示模型制備成功。給予澤漆化痰方治療后，大鼠杯狀細胞增生程度減輕、黏膜下腺體肥大改善、上皮脫落壞死程度改善，提示澤漆化痰方可通過抑制氣道黏液分泌改善COPD癥狀。

模型組大鼠腸黏液TNF-α、IL-13含量增加，IL-10含量減少，結(jié)腸組織p-EGFR、MUC2 蛋白表達升高，提示腸道炎癥水平加劇，EGFR 信號通路被激活。經(jīng)澤漆化痰方治療后，模型大鼠腸道炎癥水平降低，EGFR信號通路激活減弱，且作用優(yōu)于EGFR抑制劑AG1478。

根據(jù)癥狀，COPD 可歸屬中醫(yī)學“肺脹”范疇，以痰濁為主要病因，呼吸道黏液過度分泌可歸于“痰飲”，故COPD氣道黏液高分泌與“肺脹”“痰飲”機制相合，因此應從“痰”論治[14]。澤漆化痰方選用苦寒之澤漆，因其善于泄水，以消痰飲；本病多為痰郁化熱之證，故選用柴胡、竹瀝半夏以清熱透表、解郁散結(jié)、消痰除痞；因其多伴久嗽，故選用紫菀、款冬花祛痰止咳；前胡、白前均為治痰飲咳喘之要藥，兩藥合用，以治新舊喘咳；桔梗、枳殼合用，行氣解郁，使全身之氣得順，而水液得調(diào)。全方升降并施，以調(diào)理氣機，使肺主宣降，水道得調(diào)，頑疾自愈。

綜上所述，澤漆化痰方可抑制COPD大鼠氣道黏液高分泌癥狀，抑制腸道炎癥因子TNF-α、IL-13，促進IL-10分泌，其機制可能與調(diào)節(jié)腸道EGFR-MUC2信號通路有關(guān)。