致死中濃度阿維菌素對(duì)中國梨木虱短期內(nèi)對(duì)阿維菌素的抗性發(fā)展的影響

張 蕊, 張博晨, 許雙葉, 吳梓情, 馬瑞燕,李 婭, 張東霞, 庾 琴,*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 太原 030031; 2. 山西省植物保護(hù)檢疫總站,太原 030801)

中國梨木虱Psyllachinensis屬半翅目(Hemiptera)木虱科(Psyllidae),在我國各梨園產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生,且頻繁出現(xiàn)暴發(fā)危害(楊集昆等, 1981; 張翠疃等, 2003)。中國梨木虱一般采用化學(xué)藥劑進(jìn)行防控,藥劑主要包括阿維菌素、毒死蜱、吡蟲啉和螺蟲乙酯等,由于長(zhǎng)期頻繁不規(guī)范使用導(dǎo)致多種殺蟲劑防治中國梨木虱效果下降(曹子剛和張?zhí)N華, 1989; 孟昭禮等, 1994; 仇貴生等, 2007; 祝小祥等, 2009; 魏明峰等, 2018)。

阿維菌素為生物源類殺蟲劑,殺蟲活性強(qiáng)、殺蟲譜廣,可防治梨園中國梨木虱、多種螨類和蚜蟲等多種害蟲,在梨園中被頻繁使用(仇貴生等, 2007; 李結(jié)平等, 2011; 任學(xué)祥等, 2013),年使用次數(shù)達(dá)5～7次。由于不規(guī)范使用,阿維菌素施用濃度從21世紀(jì)初的0.2%的2 000倍增加至3%的1 000～2 000倍,仍無法有效防控中國梨木虱危害。而在意大利北部的梨園中長(zhǎng)期施用阿維菌素防治梨木虱,梨園種群仍對(duì)阿維菌素?zé)o抗性發(fā)生,主要原因與其使用方法和劑量相關(guān)(Civolanietal., 2007)。作為梨園中國梨木虱重要防治藥劑,當(dāng)前及今后較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)阿維菌素仍將在梨園中頻繁使用,因而,如何合理科學(xué)使用該藥劑成為生產(chǎn)上迫切問題。目前農(nóng)藥對(duì)中國梨木虱作用多集中于其毒力或防效等方面,而農(nóng)藥包括阿維菌素對(duì)中國梨木虱對(duì)農(nóng)藥的抗性發(fā)展規(guī)律、敏感性變化規(guī)律,以及對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖的影響等均無報(bào)道。

本研究以田間種群為基礎(chǔ),研究中國梨木虱種群在阿維菌素致死中濃度(medium lethal concentration, LC50)下對(duì)阿維菌素的抗性發(fā)展和無藥劑處理下的敏感性變化規(guī)律,及阿維菌素對(duì)該蟲種群生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖的影響,為阿維菌素的科學(xué)合理使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

供試中國梨木虱Psyllachinensis田間種群采于2022年5月山西省原平市神山村酥梨園,梨樹品種為碭山酥梨Pyrusbretschneideri,以田間采集的當(dāng)代種群成蟲為田間種群(F);相對(duì)敏感品系(SS)為室內(nèi)繼代飼養(yǎng)20代以上的中國梨木虱種群,室內(nèi)飼養(yǎng)使用酥梨幼苗,飼養(yǎng)條件為:溫度(25±3) ℃、相對(duì)濕度65%±10%和光周期15L∶9D。

1.2 供試藥劑

阿維菌素(avermectin)原藥,純度92.00%,山東齊發(fā)藥業(yè)有限公司出品。

1.3 毒力測(cè)定

毒力測(cè)定采用浸葉法,參考韓曉莉等(2007)方法,加以改進(jìn)。將92%阿維菌素原藥0.5 g用丙酮溶解并用0.1% Triton X-100的水溶液稀釋配制成一定濃度母液,根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,用含有0.1% Triton X-100的水溶液將阿維菌素母液依次稀釋為12個(gè)濃度梯度(0.01, 0.05, 1.00, 2.00, 4.00, 8.00, 10.00, 12.00, 14.00, 16.00, 18.00和20.00 mg/mL)。挑選長(zhǎng)勢(shì)良好的酥梨樹葉片,洗凈晾干,放入藥液中浸泡10 s,用濾紙吸收多余藥液,放入鋪有濕濾紙的培養(yǎng)皿(Φ=90 mm),用濕潤(rùn)脫脂棉包住葉柄保濕,蓋上皿蓋。每皿中接入30頭中國梨木虱3齡若蟲,以含有0.1% Triton X-100的水溶液為對(duì)照,每處理重復(fù)3次。24 h后統(tǒng)計(jì)死亡率,根據(jù)死亡率計(jì)算LC50值?？剐员稊?shù)(resistance ratio, RR)=阿維菌素對(duì)待測(cè)中國梨木虱種群的LC50值/阿維菌素對(duì)相對(duì)敏感種群的LC50值。參考黃彥娜(2018)的抗性倍數(shù)劃分標(biāo)準(zhǔn):敏感:RR≤3;敏感性降低:3160。

1.4 中國梨木虱田間抗性品系篩選

利用1.3節(jié)計(jì)算的LC50濃度阿維菌素對(duì)室內(nèi)飼養(yǎng)的中國梨木虱田間種群(F)進(jìn)行汰選,每代用阿維菌素噴霧處理1次,以藥液完全濕潤(rùn)植株且不流失為度,此后每代都用上一代LC50濃度阿維菌素進(jìn)行汰選處理,連續(xù)施藥6代后的種群為田間抗性品系(FR);連續(xù)6代未施藥的田間種群為田間對(duì)照品系(FS)。室內(nèi)飼養(yǎng)使用酥梨幼苗,飼養(yǎng)條件為:溫度(25±3) ℃、相對(duì)濕度65%±10%、光周期15L∶9D。

1.5 抗性和敏感中國梨木虱兩性生命表構(gòu)建

根據(jù)1.4節(jié)品系篩選后,分別挑選中國梨木虱FR, FS及SS品系成蟲100頭(雌∶雄=1∶1)放入有酥梨幼苗(高約10～15 cm)的養(yǎng)蟲籠(長(zhǎng)×寬×高=50 cm×50 cm×50 cm)中,24 h后將成蟲全部移出,每隔24 h定時(shí)調(diào)查并記錄卵孵化數(shù)。將孵化的初孵若蟲接種到酥梨幼苗上,每個(gè)葉片接種1頭,用培養(yǎng)盒(帶有透氣小孔)完全封住葉片,防止若蟲逃逸。每天定時(shí)定點(diǎn)記錄若蟲存活數(shù)和蟲齡。待成蟲羽化后,將中國梨木虱同天羽化的雌、雄成蟲進(jìn)行1∶1配對(duì),放于昆蟲行為觀察儀中進(jìn)行觀察,行為觀察儀和方法參考鄭麗霞等(2021)。接入成蟲后第2天開始觀察記錄塑料杯中各階段發(fā)育歷期和存活率及成蟲壽命和單雌產(chǎn)卵量,直至雌雄成蟲全部死亡為止。

1.6 數(shù)據(jù)分析

生命表數(shù)據(jù)根據(jù)兩性生命表理論(Chi and Liu, 1985; Chi, 1988; Chi and Su, 2006)建立試驗(yàn)種群生命表,對(duì)基礎(chǔ)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。包括種群年齡-特征存活率(lx)、種群年齡-特征繁殖力(mx)、年齡-齡期-特征存活率(sxj)、雌成蟲年齡-齡期-特征繁殖力(fxj)、種群年齡-特征凈繁殖率(lxmx)、年齡-齡期-特征壽命期望值(exj)(Chi and Su, 2006)、年齡-齡期-特征繁殖值(vxj)等分析數(shù)據(jù)進(jìn)行處理后繪制曲線(Tuanetal., 2014)。各參數(shù)采用以下公式計(jì)算(x為年齡,j為發(fā)育階段):

凈增殖率(R0):

內(nèi)稟增長(zhǎng)率(r):

周限增長(zhǎng)率(λ):

λ=er;

世代平均周期(T):

年齡-特征存活率(lx):

年齡-特征繁殖力(mx):

年齡-齡期-特征壽命期望值(exj):

年齡-齡期-特征繁殖值(vxj):

各參數(shù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤均使用TWOSEX-MS Chart軟件支持的Bootstrap方法(bootstrap次數(shù)為100 000次),進(jìn)行計(jì)算,再利用paired bootstrap test對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析(Johnson, 2001; Rousseletetal., 2019)。相對(duì)適合度I=待測(cè)中國梨木虱品系r/敏感品系r(何林等, 2008; 王爭(zhēng)艷等, 2021)。除兩性生命表外,文中其余實(shí)驗(yàn)的原始數(shù)據(jù)使用Excel 2022進(jìn)行分析,使用Origin 2022進(jìn)行繪圖。利用SPSS 24.0軟件對(duì)統(tǒng)計(jì)的數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析,采用Tukey氏多重比較進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 中國梨木虱3齡若蟲對(duì)阿維菌素的抗性倍數(shù)

結(jié)果表明(表1),處理24 h時(shí)阿維菌素對(duì)中國梨木虱F種群3齡若蟲的LC50值為2.458 mg/L, F種群的抗性倍數(shù)為3.458倍,屬于敏感性降低;對(duì)SS品系3齡若蟲的LC50值為0.706 mg/L; LC50濃度阿維菌素汰選6代后建立的FR品系的LC50值為8.447 mg/L, FR品系的抗性倍數(shù)為11.965倍,屬于中等水平抗性;梨園田間種群6代未接觸阿維菌素建立的FS品系的LC50值為1.258 mg/L, FS品系的抗性倍數(shù)為1.782倍,屬于敏感。結(jié)果說明,LC50阿維菌素連續(xù)處理6代使中國梨木虱對(duì)阿維菌素的抗性水平升高;連續(xù)6代未施藥,中國梨木虱對(duì)阿維菌素的敏感性提高。

表1 中國梨木虱3齡若蟲對(duì)阿維菌素的抗性倍數(shù)Table 1 Resistance ratio of the 3rd instar nymphs of Psylla chinensis to averamectin

2.2 LC50濃度阿維菌素對(duì)中國梨木虱的生長(zhǎng)發(fā)育的影響

表2結(jié)果表明,LC50濃度阿維菌素處理6代后建立的FR品系與阿維菌素敏感品系SS品系和連續(xù)6代未接觸阿維菌素的田間對(duì)照品系FS品系相比,FR品系各發(fā)育階段歷期和存活率及成蟲壽命、單雌產(chǎn)卵量和世代周期均發(fā)生變化。FR品系卵歷期和若蟲歷期均顯著長(zhǎng)于FS品系和SS品系的(P<0.05),其中,卵歷期較FS品系延長(zhǎng)了2.263 d,較SS品系延長(zhǎng)了2.240 d;FR品系若蟲歷期較FS品系延長(zhǎng)了2.245 d,較SS品系延長(zhǎng)了2.791 d,FS品系與SS品系若蟲歷期差異不顯著(P>0.05)。FR品系的成蟲壽命均短于FS品系和SS品系的。FR品系成蟲產(chǎn)卵前期和總產(chǎn)卵前期均顯著長(zhǎng)于FS品系和SS品系的(P<0.05),FS品系產(chǎn)卵前期和總產(chǎn)卵前期顯著長(zhǎng)于SS品系的(P<0.05)。FR品系單雌產(chǎn)卵量較SS品系和FS品系分別顯著減少74.300和57.000粒(P<0.05)。FR品系世代周期均長(zhǎng)于FS品系和SS品系的。結(jié)果說明,LC50濃度阿維菌素連續(xù)處理6代使中國梨木虱的卵歷期和若蟲歷期、產(chǎn)卵前期、總產(chǎn)卵前期和世代周期延長(zhǎng),成蟲壽命縮短,產(chǎn)卵量下降。

2.3 LC50濃度阿維菌素對(duì)中國梨木虱生命表參數(shù)的影響

表3表明,LC50濃度阿維菌素處理后建立的FR品系的內(nèi)稟增長(zhǎng)率、周限增長(zhǎng)率和凈增殖率較阿維菌素敏感品系SS品系均降低。FR品系周限增長(zhǎng)率顯著低于連續(xù)6代未接觸阿維菌素的田間對(duì)照品系FS和SS品系的(P<0.05),分別減少了0.022和0.036 d-1;內(nèi)稟增長(zhǎng)率較FS和SS品系分別減少了0.019和0.031 d-1。FR品系平均世代周期和種群加倍時(shí)間顯著長(zhǎng)于FS品系和SS品系的(P<0.05),FS品系平均世代周期顯著長(zhǎng)于SS的(P<0.05)。FS品系相對(duì)適合度為0.921,FR品系相對(duì)適合度為0.743。結(jié)果說明, LC50濃度阿維菌素連續(xù)處理6代后,中國梨木虱內(nèi)稟增長(zhǎng)率、周限增長(zhǎng)率和凈增殖率下降,適合度下降。

表3 中國梨木虱不同品系的生命表參數(shù)Table 3 Life table parameters of different strains of Psylla chinensis

圖1(A-C)表明,LC50濃度阿維菌素連續(xù)處理6代后建立的FR品系若蟲sxj曲線比FS和SS品系結(jié)束得更遲,SS品系若蟲期在第28天時(shí)結(jié)束,FS品系若蟲期在第30天時(shí)結(jié)束,FR品系若蟲期在第40天時(shí)結(jié)束。結(jié)果說明, LC50濃度阿維菌素處理延長(zhǎng)了中國梨木虱若蟲存活時(shí)間。

圖1 中國梨木虱SS (A), FS (B)和FR (C) 品系的年齡-齡期-特征存活率(sxj)Fig. 1 Age-stage-specific survival rates (sxj) of SS (A),FS (B) and FR (C) strains of Psylla chinensis

由圖2(A-C)可知, 中國梨木虱3種品系存活率曲線變化趨勢(shì)基本一致,曲線坡度前期下降緩慢,FS, FR和SS品系在38 d左右前l(fā)x變化趨勢(shì)不大,說明低齡若蟲存活率較高,lx在成蟲發(fā)育期急速下降。fxj顯示LC50濃度阿維菌素延緩了中國梨木虱的產(chǎn)卵高峰期,3個(gè)品系產(chǎn)卵高峰日和及其高峰日產(chǎn)卵量分別為: SS品系第33天(34.10), FS品系第33天(23.60)和FR品系的第38天(14.55)(圖2: A-C)。fx,mx和lxmx曲線均說明LC50濃度阿維菌素處理降低了中國梨木虱的繁殖能力(圖2: A-C)。

圖2 中國梨木虱SS (A), FS (B)和FR (C)品系的年齡-特征存活率(lx)、雌成蟲年齡-齡期-特征繁殖力(fxj)、年齡-特征繁殖力(mx)和年齡-特征凈繁殖率(lxmx)Fig. 2 Age-specific survival rates (lx), age-stage-specific fecundity of female adult (fxj), age-specific fecundity (mx) and age-specific net reproductive rates (lxmx) of SS (A),FS (B) and FR (C) strains of Psylla chinensis

由圖3(A-C)可知,中國梨木虱SS, FS和FR 3個(gè)品系各齡期繁殖值均隨年齡x的增加而增大,且在成蟲期貢獻(xiàn)度到達(dá)最大值,表明成蟲期對(duì)未來種群的貢獻(xiàn)值最大。SS品系種群繁殖高峰出現(xiàn)時(shí)間最早在第22天,雌成蟲繁殖值為120.749; FS品系雌成蟲在第32天達(dá)到最高繁殖值,為118.276; FR品系種群繁殖高峰出現(xiàn)時(shí)間最晚,雌成蟲在第36天達(dá)到最高繁殖值,為88.210。結(jié)果說明,LC50濃度阿維菌素處理降低了中國梨木虱種群繁殖值。

圖3 中國梨木虱SS (A), FS (B)和FR (C) 品系的年齡-齡期-特征繁殖值(vxj)Fig. 3 Age-stage-specific reproductive values (vxj) of SS (A), FS (B) and FR (C) strains of Psylla chinensis

由圖4(A-C)可知,SS, FS和FR 3個(gè)品系的exj在卵期最高,隨著幼蟲齡期增長(zhǎng)而下降;雌成蟲的exj分別為30.00, 28.90和28.40 d;雄成蟲的exj分別為23.10, 21.50和20.55 d。各品系雌雄成蟲的exj均呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢(shì),FR品系較為明顯,表明該齡期死亡率較高。結(jié)果說明,LC50濃度阿維菌素處理延長(zhǎng)了中國梨木虱的期望壽命。

圖4 中國梨木虱SS (A), FS (B)和FR (C)品系的年齡-齡期-特征壽命期望值(exj)Fig. 4 Age-stage-specific life expectancy (exj) of SS (A), FS (B) and FR (C) strains of Psylla chinensis

3 討論

阿維菌素作為廣譜性的生物源類殺蟲劑,果園應(yīng)用廣泛(仇貴生等, 2007; 李結(jié)平等, 2011; 任學(xué)祥等, 2013)。隨著阿維菌素使用年限增加,其田間使用濃度逐年增加,防治效果不斷下降,無法有效防控夏秋季節(jié)梨園的中國梨木虱。本研究中阿維菌素處理對(duì)使用的未施藥第一代中國梨木虱F種群3齡若蟲的LC50值是對(duì)室內(nèi)相對(duì)敏感品系SS品系LC50值的3.482倍(表1),中國梨木虱對(duì)阿維菌素已為低敏感,該結(jié)果說明現(xiàn)有施藥技術(shù)使中國梨木虱對(duì)阿維菌素敏感性降低。當(dāng)LC50濃度阿維菌素連續(xù)處理6代后,中國梨木虱對(duì)阿維菌素由低敏感快速上升至中抗水平,這可能是梨園夏秋季節(jié)頻繁使用阿維菌素使該藥劑難以有效防控中國梨木虱的原因之一。

研究表明,一些害蟲對(duì)殺蟲劑產(chǎn)生抗性后,停止用藥或輪換用其他藥劑,害蟲適合度上升,敏感性恢復(fù)(Georghiouetal., 1983; 劉澤文, 2004; Coetzee and Koekemoer, 2013; Sparks and Nauen, 2015; van Leeuwenetal., 2015; Zhangetal., 2015),而有些害蟲敏感性則很難恢復(fù)(吳孔明和劉芹軒, 1994)。本研究結(jié)果表明,停止使用阿維菌素后,中國梨木虱對(duì)其敏感性上升,適合度增加(表3)。因而,在田間使用時(shí),盡量間隔使用阿維菌素,使中國梨木虱等害蟲處于低敏感性。

害蟲抗藥性產(chǎn)生是其對(duì)殺蟲劑選擇壓力適應(yīng)的結(jié)果,抗性品系存在適合度代價(jià),主要表現(xiàn)為繁殖力、孵化率等下降,總產(chǎn)卵前期延長(zhǎng),成蟲壽命和產(chǎn)卵期縮短等(Liuetal., 2006; Lingetal., 2009; Yangetal., 2018)。本研究結(jié)果表明,LC50濃度阿維菌素連續(xù)處理后,中國梨木虱敏感性下降、抗性水平升高,抗性品系適合度明顯下降,存在生存競(jìng)爭(zhēng)劣勢(shì),且可推測(cè),隨著抗性水平的不斷增加,抗性品系的適合度可能會(huì)繼續(xù)下降。因此,使用阿維菌素防治中國梨木虱時(shí),除了采取各種延緩抗性產(chǎn)生和發(fā)展的措施外,還可利用抗性品系適合度不利性,與其他防控技術(shù)配合,減少阿維菌素使用次數(shù)和劑量,延緩抗藥性的產(chǎn)生,延長(zhǎng)阿維菌素的田間使用壽命。