• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    甲狀腺乳頭狀癌中SMOC2的表達與臨床病理意義

    2023-02-04 01:02:48凡龍云王美玲趙雅麗王萬祥
    臨床與實驗病理學(xué)雜志 2023年12期
    關(guān)鍵詞:乳頭狀敏感度孵育

    凡龍云,彭 薇,王美玲,趙雅麗,肖 寒,王萬祥,吳 強,,王 弦,

    甲狀腺癌是甲狀腺最常見的原發(fā)性惡性腫瘤,甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinomas, PTC)是原發(fā)性甲狀腺癌中最常見的類型[1]。雖然PTC預(yù)后良好,但仍有20%~30%的PTC患者出現(xiàn)復(fù)發(fā),約7%患者死亡[2]。有時甲狀腺乳頭狀增生(papillary thyroid hyperplasia, PTH)會表現(xiàn)出與PTC類似的組織學(xué)特征,包括發(fā)育良好的具有纖維血管軸心的乳頭狀結(jié)構(gòu)、核擁擠和核分裂象,給PTC的診斷和鑒別診斷帶來困難[3]。既往研究和臨床診斷實踐發(fā)現(xiàn),PTC診斷常用的免疫組化標志物對PTC的診斷準確性尚未達成統(tǒng)一的共識[4]。因此,有必要探索新的免疫組化標志物或組合以提高PTC的診斷準確率。

    酸性富含半胱氨酸的分泌蛋白相關(guān)的模塊化鈣結(jié)合蛋白-2(secreted modular calcium binding protein-2, SMOC2)屬于SPARC家族,在人體多種實體腫瘤中的作用尚有分歧[5]。本研究在生物信息學(xué)的基礎(chǔ)上,采用免疫組化法檢測SMOC2在PTC組織中的表達情況,分析其與PTC臨床病理特征的關(guān)系及與CK19、Galectin-3、MC和BRAF V600E聯(lián)合輔助診斷的價值。

    1 材料與方法

    1.1 材料選取2021年10月~2022年7月安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院和安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理科具有完整臨床病理資料的75例PTC和45例PTH手術(shù)切除石蠟標本。排除手術(shù)前接受過化療、放療或免疫抑制劑治療以及合并其他惡性腫瘤的患者。所有病例均經(jīng)10%中性福爾馬林固定,石蠟包埋,4 μm厚連續(xù)切片,分別行HE和免疫組化染色。75例PTC中女性50例,男性25例,年齡19~74歲,中位年齡40歲。39例有局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,36例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。AJCC第八版甲狀腺腫瘤TNM分期:Ⅰ期28例,Ⅱ期44例,Ⅲ期3例。

    1.2 試劑SMOC2兔多克隆抗體(GTX85703)購自GeneTex公司;CK19鼠單克隆抗體(UMAB2,即用型)、Galectin-3鼠單克隆抗體(UMAB157,即用型)、MC鼠單克隆抗體(HBME-1,即用型)、DAB顯色試劑盒(PV-6000D)均購于北京中杉金橋公司;BRAF V600E(VE1)抗體、OptiView DAB二抗試劑盒及OptiView AMP擴增試劑盒均購于羅氏公司。

    1.3 方法

    1.3.1生物信息學(xué)分析 從基因表達綜合數(shù)據(jù)庫(Gene Expression Omnibus, GEO)中選取數(shù)據(jù)集GSE3678(包括7例PTC和7例良性甲狀腺組織)和GSE33630(包括49例PTC和46例良性甲狀腺組織),分析SMOC2 mRNA在PTC和良性甲狀腺組織中的表達量差異;從癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas, TCGA)數(shù)據(jù)庫中提取505例甲狀腺癌組織和59例良性甲狀腺組織中SMOC2 mRNA的表達量,分析SMOC2 mRNA在兩者中表達量差異。

    1.3.2免疫組化 SMOC2、CK19、Galectin-3、MC采用免疫組化EnVision兩步法染色,主要步驟:切片脫蠟水化,檸檬酸鈉溶液熱修復(fù),過氧化物酶阻斷劑室溫孵育10 min,滴加一抗4 ℃孵育過夜,二抗室溫孵育20 min,DAB顯色,蘇木精復(fù)染,脫水、透明后光鏡下觀察。BRAF V600E通過BenchMark Ultra全自動免疫組化儀器進行染色,主要步驟:切片75 ℃預(yù)熱4 min脫蠟水化,Ultra CC1堿性修復(fù)液100 ℃修復(fù)72 min,過氧化物酶抑制劑OV PEROX IHBTR孵育4 min,BRAF V600E一抗37 ℃孵育32 min;OV HQ UNIV LINKR孵育8 min;OV HRP MULTIMER孵育8 min;OV AMP H2O2和OV AMPLIFIER共同孵育4 min;OV AMP MULTIMER孵育4 min;OV H2O2和OV DAB共同孵育8 min;OV COPPER 孵育4 min;蘇木精復(fù)染12 min,返藍液孵育4 min,脫水、透明后光鏡下觀察。

    1.4 結(jié)果判讀SMOC2以上皮細胞胞質(zhì)中出現(xiàn)黃色或褐色顆粒為陽性染色,CK19以上皮細胞胞質(zhì)中出現(xiàn)黃色或褐色顆粒為陽性染色,Galectin-3以上皮細胞胞質(zhì)和胞核中出現(xiàn)黃色或褐色顆粒為陽性染色,MC以上皮細胞腔緣頂端細胞膜出現(xiàn)黃色或褐色顆粒為陽性染色[6]。BRAF V600E以上皮細胞胞質(zhì)中出現(xiàn)黃色或褐色顆粒為陽性染色[7]。SMOC2評分標準:按染色強度評分:陰性為0分,弱陽性為1分,中等強度陽性為2分,強陽性為3分。評分≥1分判為陽性[8]。CK19、Galectin-3、MC著色細胞占比>10%定義為陽性。BRAF V600E在細胞質(zhì)中著色即為陽性,無著色為陰性。

    1.5 統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用GraphPad Prism 6.0.1和SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗分析組間蛋白表達差異及與臨床病理特征的關(guān)系,采用傳統(tǒng)診斷試驗公式計算敏感度、特異性和診斷準確性,受試者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲線分析診斷預(yù)測價值,采用Spearman等級相關(guān)檢驗分析相關(guān)性,結(jié)果均以雙側(cè)P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 生物信息學(xué)分析SMOC2在PTC和良性甲狀腺組織中的mRNA表達差異及診斷價值提取GEO數(shù)據(jù)庫GSE3678和GSE33630兩個數(shù)據(jù)集及TCGA數(shù)據(jù)庫中甲狀腺癌和良性甲狀腺組織SMOC2 mRNA的表達量,對兩者表達量進行差異性分析及ROC曲線分析,結(jié)果顯示:SMOC2 mRNA在PTC中的表達量顯著低于良性甲狀腺組織(P<0.05,圖1A~C),ROC曲線下面積(area under the curve, AUC)為0.910(P<0.001,圖1D)。

    圖1 A.GEO數(shù)據(jù)庫GSE3678數(shù)據(jù)集中甲狀腺乳頭狀癌和良性甲狀腺組織中SMOC2 mRNA的表達;B.GSE33630數(shù)據(jù)集中甲狀腺乳頭狀癌和良性甲狀腺組織中SMOC2 mRNA的表達;C.TCGA數(shù)據(jù)庫中甲狀腺癌和良性甲狀腺組織中SMOC2 mRNA的表達;D.GEO數(shù)據(jù)庫預(yù)測SMOC2對甲狀腺乳頭狀癌診斷價值的ROC曲線

    2.2 PTC和PTH中SMOC2蛋白表達及與臨床病理特征的關(guān)系在PTH中,SMOC2蛋白表達于乳頭狀增生的上皮細胞中,定位于靠近腔緣頂端的細胞質(zhì),具有極性,呈非連續(xù)的線狀顆粒性,陽性率為91.1%(41/45);在PTC中,SMOC2在癌組織中呈陰性或弱陽性彌漫分布,陽性染色滿布于癌細胞胞質(zhì),陽性率為10.7%(8/75),明顯低于PTH(P<0.001,圖2)。SMOC2表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負相關(guān)(P<0.05),與患者性別、年齡、腫瘤最大徑、是否甲狀腺外浸潤、TNM分期無相關(guān)性(P>0.05),且與BRAF V600E表達無相關(guān)性(rs=0.142,P>0.05,表1)。

    表1 甲狀腺乳頭狀癌中SMOC2表達與臨床病理特征的關(guān)系

    2.3 SMOC2、CK19、Galectin-3、MC和BRAF V600E對PTC的診斷價值及比較SMOC2對PTC診斷的敏感度為91.1%,特異性為89.3%,診斷準確性為90.0%,陽性似然比(positive likelihood ratio, PLR)為8.514,陰性似然比(negative likelihood ratio, NLR)為0.099。ROC曲線分析結(jié)果顯示AUC值為0.898(P<0.001,圖3)。在PTC組織中,CK19蛋白定位于細胞質(zhì),呈彌漫分布,診斷的敏感度為100.0%,特異性為84.4%;Galectin-3蛋白定位于細胞核和細胞質(zhì),呈彌漫分布,診斷的敏感度為92.0%,特異性為80.0%;MC蛋白定位于腔緣頂端細胞膜,呈完整連續(xù)著色,診斷的敏感度為94.7%,特異性為64.4%;BRAF V600E蛋白定位于細胞質(zhì),呈彌漫分布,診斷的敏感度為94.7%,特異性為88.9%。在PTH組織中,CK19、Galectin-3、MC和BRAF V600E均呈陰性(表2,圖4)。單獨診斷時,CK19的敏感度最高,但其特異性差;SMOC2診斷的敏感度雖然低于CK19、Galectin-3、MC和BRAF V600E,但特異性最高(89.3%)。

    圖3 SMOC2對甲狀腺乳頭狀癌診斷價值的ROC曲線

    圖4 PTC和PTH的HE染色及CK19、Galectin-3、MC和BRAF V600E免疫組化染色,EnVision兩步法:PTC.甲狀腺乳頭狀癌;PTH.甲狀腺乳頭狀增生

    2.4 SMOC2聯(lián)合CK19、Galectin-3、MC和BRAF V600E在PTC和PTH鑒別診斷中的價值在鑒別PTC和PTH時,SMOC2、CK19、Galectin-3、MC和BRAF V600E的診斷價值以敏感度和特異性的形式表現(xiàn)。SMOC2、CK19、Galectin-3、MC和BRAF V600E相互組合進行PTC聯(lián)合輔助診斷(圖5),SMOC2、CK19、Galectin-3、MC和BRAF V600E五者聯(lián)合輔助診斷的AUC值為1.000(P<0.001),在一定程度優(yōu)于其他標志物組合,當(dāng)Cut-off值為0.500時,診斷的敏感度和特異性均高達100.0%。

    圖5 SMOC2、CK19、Galectin-3、MC和BRAF V600E聯(lián)合輔助診斷的ROC曲線

    3 討論

    SMOC2作為一種分泌型基質(zhì)細胞蛋白,在許多組織中廣泛表達,參與多種細胞功能,包括細胞黏附和遷移[9]、血管生成[10]、纖維增生[11]和細胞增殖[12]等,在多種實體腫瘤中起促癌或抑癌基因的作用。既往研究顯示,其生物學(xué)功能主要多與促癌特性有關(guān),但在結(jié)直腸癌、胰腺癌、膽囊癌和晚期乳腺癌中起抑癌基因的作用[13],而在PTC中SMOC2蛋白表達情況及作用機制尚不明確。

    本研究采用生物信息技術(shù)學(xué)在數(shù)據(jù)庫中提取SMOC2 mRNA的表達量,分析其在PTC和良性甲狀腺組織中的差異量表達,并在生信分析基礎(chǔ)上對PTC和PTH石蠟切片進行SMOC2免疫組化檢測。生物信息技術(shù)學(xué)結(jié)果顯示SMOC2在PTC中的表達較良性甲狀腺組織顯著降低;免疫組化結(jié)果顯示SMOC2在PTC組織中呈陰性或弱陽性彌漫著色,在PTH組織增生的乳頭狀結(jié)構(gòu)中可見明顯的陽性染色,呈線狀顆粒性表達,其分布具有極性。可見,SMOC2在PTC組織中的陽性率降低和在細胞質(zhì)中表達的極性消失可在一定程度上提示其惡性特征,對PTC診斷和鑒別診斷具有重要的輔助作用。

    Jang等[14]的研究顯示,SMOC2在正常結(jié)腸黏膜基底隱窩中呈陽性,在結(jié)腸癌組織中呈陰性或弱陽性彌漫表達,定位于細胞質(zhì),陽性率明顯下降,在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例中SMOC2表達進一步下降,且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負相關(guān)。本組SMOC2在PTC中的表達情況在一定程度上與SMOC2在結(jié)腸癌中的表達及與臨床病理特征的關(guān)系一致,但其是否在PTC中發(fā)揮抑癌基因的作用有待進一步研究。

    分析SMOC2與PTC臨床病理特征關(guān)系發(fā)現(xiàn),SOMC2表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負相關(guān),與患者性別、年齡、腫瘤最大徑、是否甲狀腺外浸潤、TNM分期無相關(guān)性。既往研究[8]顯示,在38%的PTC中觀察到SMOC2完全缺失與BRAF突變?nèi)笔嚓P(guān),本組PTC中SMOC2表達與BRAF V600E突變相關(guān)性分析并未發(fā)現(xiàn)兩者間的相關(guān)性,有待擴大樣本進一步觀察。本組67例SMOC2表達丟失病例中,38例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,29例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,提示SMOC2丟失可能與PTC發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。

    根據(jù)Xin等[15]提出的標準,分子標志物的PLR>10或NLR<0.1可視為獨立診斷指標,SMOC2的NLR<0.1,由此提示SMOC2可作為單獨診斷PTC的標志物,但其缺乏較高敏感度和特異性,需與其他標志物聯(lián)合檢測。本實驗CK19、Galectin-3、MC和BRAF V600E免疫組化結(jié)果與Asghari等[16]和Parker等[17]的研究結(jié)果一致。以上標志物相互組合,以SMOC2、CK19、Galectin-3、MC和BRAF V600E五者聯(lián)合輔助診斷PTC時,其AUC值最高,輔助診斷效能優(yōu)于其余標志物組合,成為新的高敏感度和特異性的組合。

    綜上所述,SMOC2陽性率下降和在細胞質(zhì)中表達的極性消失可作為PTC診斷和鑒別診斷的重要標志物,與CK19、Galectin-3、MC、BRAF V600E五者聯(lián)合檢測優(yōu)于其他標志物組合,可在一定程度上提高對PTC診斷的敏感度和特異性。

    猜你喜歡
    乳頭狀敏感度孵育
    全體外預(yù)應(yīng)力節(jié)段梁動力特性對于接縫的敏感度研究
    電視臺記者新聞敏感度培養(yǎng)策略
    新聞傳播(2018年10期)2018-08-16 02:10:16
    三物黃芩湯組分(群)配伍在大鼠肝微粒體孵育模型中的相互作用
    中成藥(2017年9期)2017-12-19 13:34:27
    Identifying vital edges in Chinese air route network via memetic algorithm
    大鼠肝微粒體孵育體系中2種成分的測定及其代謝
    中成藥(2017年5期)2017-06-13 13:01:12
    在京韓國留學(xué)生跨文化敏感度實證研究
    甲狀腺乳頭狀癌中Survivin、VEGF、EGFR的表達及臨床意義分析
    癌癥進展(2016年10期)2016-03-20 13:15:50
    SUMO4在甲狀腺乳頭狀癌中的表達及臨床意義
    Diodes高性能汽車霍爾效應(yīng)閉鎖提供多種敏感度選擇
    乳頭狀汗管囊腺癌一例
    亚洲精品第二区| 中文字幕av成人在线电影| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 亚洲,欧美,日韩| 亚洲性久久影院| www.av在线官网国产| 精品一区二区三区人妻视频| 国产亚洲5aaaaa淫片| 国产黄频视频在线观看| 3wmmmm亚洲av在线观看| 精品久久久久久电影网| 床上黄色一级片| 免费看美女性在线毛片视频| av卡一久久| videossex国产| 亚洲成人久久爱视频| 久久久久久久国产电影| 99热这里只有是精品50| 最近最新中文字幕大全电影3| 午夜福利成人在线免费观看| videos熟女内射| 啦啦啦韩国在线观看视频| 91狼人影院| 老司机影院毛片| 午夜福利网站1000一区二区三区| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 亚洲乱码一区二区免费版| 久久久午夜欧美精品| 国产乱人视频| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 夫妻性生交免费视频一级片| 日韩成人伦理影院| 免费av观看视频| 黄色欧美视频在线观看| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 精品国产露脸久久av麻豆 | 婷婷色综合大香蕉| 国产一区二区在线观看日韩| 亚洲av成人av| av一本久久久久| 国产精品爽爽va在线观看网站| 成人亚洲精品av一区二区| 午夜福利成人在线免费观看| 超碰97精品在线观看| 免费看av在线观看网站| 91精品国产九色| 亚洲av不卡在线观看| 在线观看人妻少妇| 精品一区二区三卡| 国产激情偷乱视频一区二区| 夫妻性生交免费视频一级片| 国产亚洲5aaaaa淫片| 热99在线观看视频| 91久久精品国产一区二区三区| 久久久久久久久久黄片| av又黄又爽大尺度在线免费看| 五月玫瑰六月丁香| 99热网站在线观看| 国产一区二区三区av在线| 国产极品天堂在线| 日本-黄色视频高清免费观看| 久久鲁丝午夜福利片| 国产成人午夜福利电影在线观看| 亚洲在线观看片| 亚洲在线观看片| 精品一区二区三卡| kizo精华| 少妇熟女aⅴ在线视频| 伦精品一区二区三区| 欧美人与善性xxx| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 麻豆久久精品国产亚洲av| 亚洲欧美精品自产自拍| 一区二区三区高清视频在线| 蜜臀久久99精品久久宅男| 亚洲精品视频女| 久久热精品热| 亚洲乱码一区二区免费版| 美女大奶头视频| 街头女战士在线观看网站| 在线观看一区二区三区| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 男女边吃奶边做爰视频| 免费观看性生交大片5| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 亚洲国产av新网站| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 中文欧美无线码| 成年女人看的毛片在线观看| 国产亚洲精品av在线| 国产视频内射| 午夜福利在线观看吧| 日韩强制内射视频| 91久久精品国产一区二区三区| 听说在线观看完整版免费高清| 18禁在线播放成人免费| 日日干狠狠操夜夜爽| 毛片一级片免费看久久久久| 久久97久久精品| 亚洲精品久久午夜乱码| 免费观看无遮挡的男女| 舔av片在线| 搡老乐熟女国产| 国产成人福利小说| 久久久久久久久久黄片| av免费在线看不卡| 97超视频在线观看视频| 久久精品国产自在天天线| 男女啪啪激烈高潮av片| 精品不卡国产一区二区三区| 久久鲁丝午夜福利片| 国产亚洲精品av在线| 亚洲在线观看片| 亚洲国产精品国产精品| 免费看av在线观看网站| 亚洲精品第二区| 国产淫片久久久久久久久| 亚洲va在线va天堂va国产| 两个人视频免费观看高清| 听说在线观看完整版免费高清| 国产黄a三级三级三级人| 国产成人免费观看mmmm| 最新中文字幕久久久久| 国产亚洲5aaaaa淫片| 日韩人妻高清精品专区| 天堂俺去俺来也www色官网 | 午夜福利视频精品| 丰满乱子伦码专区| 国产av不卡久久| 又大又黄又爽视频免费| 亚洲av国产av综合av卡| 成人毛片60女人毛片免费| 精品不卡国产一区二区三区| 免费无遮挡裸体视频| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 少妇丰满av| 久久久亚洲精品成人影院| 国产免费一级a男人的天堂| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 成人鲁丝片一二三区免费| 亚洲一区高清亚洲精品| 特级一级黄色大片| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 三级经典国产精品| 国产老妇伦熟女老妇高清| 国模一区二区三区四区视频| 丝袜美腿在线中文| 久久久色成人| 最近的中文字幕免费完整| 超碰97精品在线观看| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 美女被艹到高潮喷水动态| 赤兔流量卡办理| 色综合色国产| 国产免费一级a男人的天堂| 2022亚洲国产成人精品| 欧美bdsm另类| 夫妻午夜视频| 一个人观看的视频www高清免费观看| 麻豆成人午夜福利视频| 欧美成人精品欧美一级黄| 免费黄频网站在线观看国产| 成人午夜精彩视频在线观看| 欧美日本视频| 最近中文字幕2019免费版| 男人舔奶头视频| 日日撸夜夜添| a级毛片免费高清观看在线播放| 久久久国产一区二区| 有码 亚洲区| 亚洲国产精品成人综合色| 精品人妻熟女av久视频| 国产人妻一区二区三区在| 亚洲一区高清亚洲精品| 亚洲天堂国产精品一区在线| av专区在线播放| 人妻一区二区av| 亚洲性久久影院| 一个人看的www免费观看视频| 国产午夜福利久久久久久| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 婷婷六月久久综合丁香| 床上黄色一级片| 免费观看性生交大片5| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 国产精品一区www在线观看| 亚洲精品国产av蜜桃| 国产色爽女视频免费观看| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品 | 99re6热这里在线精品视频| 亚洲国产高清在线一区二区三| 国产爱豆传媒在线观看| 街头女战士在线观看网站| 久久久久精品久久久久真实原创| 欧美精品国产亚洲| 国产亚洲最大av| 亚洲国产最新在线播放| 男人狂女人下面高潮的视频| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 国产成人精品一,二区| 18+在线观看网站| www.av在线官网国产| 国产永久视频网站| 国产成人免费观看mmmm| 99九九线精品视频在线观看视频| 亚洲高清免费不卡视频| 国产麻豆成人av免费视频| 天堂影院成人在线观看| 午夜视频国产福利| 亚洲经典国产精华液单| 1000部很黄的大片| 婷婷色综合大香蕉| 午夜激情久久久久久久| 丝袜美腿在线中文| 美女高潮的动态| 欧美97在线视频| 搞女人的毛片| 欧美三级亚洲精品| 精品久久久久久电影网| 亚洲精品国产成人久久av| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 91在线精品国自产拍蜜月| 精品一区二区三区视频在线| 亚洲av电影不卡..在线观看| videos熟女内射| av专区在线播放| 亚洲精品aⅴ在线观看| 寂寞人妻少妇视频99o| 22中文网久久字幕| 看非洲黑人一级黄片| 五月玫瑰六月丁香| 乱人视频在线观看| 人妻系列 视频| 久久久欧美国产精品| 欧美变态另类bdsm刘玥| 99视频精品全部免费 在线| 少妇人妻一区二区三区视频| 搡老乐熟女国产| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 亚洲成人一二三区av| 国产午夜精品一二区理论片| 色网站视频免费| 日本与韩国留学比较| 亚州av有码| 六月丁香七月| 熟妇人妻不卡中文字幕| 夜夜爽夜夜爽视频| 欧美日本视频| 日本-黄色视频高清免费观看| 亚洲自拍偷在线| xxx大片免费视频| av在线播放精品| 久久久色成人| 18禁动态无遮挡网站| 免费少妇av软件| 免费看光身美女| 欧美xxⅹ黑人| 男女下面进入的视频免费午夜| 久久人人爽人人爽人人片va| 嫩草影院新地址| 久久久久精品性色| 成年av动漫网址| 欧美日本视频| 中文字幕av成人在线电影| 日日撸夜夜添| 校园人妻丝袜中文字幕| 中文乱码字字幕精品一区二区三区 | 日韩亚洲欧美综合| 天堂俺去俺来也www色官网 | 少妇熟女aⅴ在线视频| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 婷婷色综合大香蕉| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 国产免费视频播放在线视频 | 亚洲第一区二区三区不卡| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 乱人视频在线观看| 亚洲成人久久爱视频| 欧美潮喷喷水| 国内精品美女久久久久久| 美女黄网站色视频| 亚洲欧美清纯卡通| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 内射极品少妇av片p| 永久免费av网站大全| 99热网站在线观看| 在线观看免费高清a一片| 超碰97精品在线观看| 午夜免费观看性视频| 精品一区二区三区人妻视频| 一级毛片 在线播放| 国产黄色小视频在线观看| 亚洲精品第二区| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 22中文网久久字幕| 麻豆国产97在线/欧美| 午夜爱爱视频在线播放| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 成人亚洲精品一区在线观看 | 在线免费观看的www视频| 国产高清有码在线观看视频| 天堂俺去俺来也www色官网 | 看十八女毛片水多多多| 久久99精品国语久久久| 亚洲av免费在线观看| 最后的刺客免费高清国语| 成人亚洲精品av一区二区| 国产成人freesex在线| 亚洲自拍偷在线| 深爱激情五月婷婷| 日本黄色片子视频| 日韩在线高清观看一区二区三区| 国产乱人视频| 一级毛片久久久久久久久女| 国产大屁股一区二区在线视频| 免费看a级黄色片| 六月丁香七月| 久久久欧美国产精品| 久久久久久久久大av| 精品一区二区三区视频在线| 国产探花在线观看一区二区| av天堂中文字幕网| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 天美传媒精品一区二区| 久久久久性生活片| 欧美潮喷喷水| 亚洲第一区二区三区不卡| 国产成人91sexporn| 男女视频在线观看网站免费| 国产69精品久久久久777片| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 精华霜和精华液先用哪个| 18禁在线播放成人免费| 少妇人妻精品综合一区二区| 美女被艹到高潮喷水动态| 亚洲电影在线观看av| 亚洲av成人精品一二三区| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 大香蕉97超碰在线| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 国产探花极品一区二区| 亚洲成人精品中文字幕电影| 激情 狠狠 欧美| 成年版毛片免费区| 1000部很黄的大片| 亚洲国产欧美在线一区| 久久久久九九精品影院| 成年av动漫网址| 国产黄片美女视频| 久久热精品热| 亚州av有码| 成人无遮挡网站| 乱码一卡2卡4卡精品| 色网站视频免费| 精品国产三级普通话版| av在线播放精品| 亚洲国产成人一精品久久久| 免费看光身美女| av免费观看日本| 色播亚洲综合网| 国产精品国产三级国产专区5o| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 精品人妻偷拍中文字幕| 日韩av免费高清视频| 成人性生交大片免费视频hd| 一级爰片在线观看| 精品一区二区三区人妻视频| xxx大片免费视频| 高清欧美精品videossex| 午夜精品一区二区三区免费看| 欧美xxⅹ黑人| 国产 亚洲一区二区三区 | 校园人妻丝袜中文字幕| 国产单亲对白刺激| 精品少妇黑人巨大在线播放| 3wmmmm亚洲av在线观看| 日日摸夜夜添夜夜爱| 丝瓜视频免费看黄片| 亚洲成人av在线免费| 国产 亚洲一区二区三区 | 91精品伊人久久大香线蕉| 欧美极品一区二区三区四区| 国内精品一区二区在线观看| 国产 一区精品| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 久久精品久久久久久久性| 国产一区二区三区综合在线观看 | 人人妻人人澡欧美一区二区| 国产精品女同一区二区软件| 干丝袜人妻中文字幕| 国产伦一二天堂av在线观看| 国产 一区精品| 一二三四中文在线观看免费高清| 亚洲精品国产av蜜桃| 天堂中文最新版在线下载 | 国产精品1区2区在线观看.| 久久这里只有精品中国| 午夜福利视频精品| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 午夜激情欧美在线| 亚洲丝袜综合中文字幕| av网站免费在线观看视频 | 97热精品久久久久久| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 国产中年淑女户外野战色| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 蜜臀久久99精品久久宅男| 国产精品女同一区二区软件| 国产一级毛片在线| 少妇高潮的动态图| 一级毛片 在线播放| 99久国产av精品国产电影| 国产探花在线观看一区二区| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 偷拍熟女少妇极品色| 欧美极品一区二区三区四区| 国产熟女欧美一区二区| 2018国产大陆天天弄谢| 麻豆乱淫一区二区| 国产成人精品福利久久| 成人国产麻豆网| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 一级爰片在线观看| 男女边摸边吃奶| 搡老妇女老女人老熟妇| 国产在线一区二区三区精| 亚洲精品aⅴ在线观看| or卡值多少钱| 99热这里只有精品一区| 人妻夜夜爽99麻豆av| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 亚洲精品国产av蜜桃| 成年女人看的毛片在线观看| 深爱激情五月婷婷| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 国产精品一区二区三区四区久久| 国产视频内射| 欧美日韩综合久久久久久| 国产视频首页在线观看| 欧美 日韩 精品 国产| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 99九九线精品视频在线观看视频| 欧美成人午夜免费资源| 亚洲电影在线观看av| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 亚洲图色成人| 日韩av不卡免费在线播放| 在线观看免费高清a一片| 日韩一区二区视频免费看| 国产真实伦视频高清在线观看| 99久久精品国产国产毛片| 亚洲无线观看免费| 七月丁香在线播放| 青春草国产在线视频| 国产一级毛片七仙女欲春2| 18禁动态无遮挡网站| 国产又色又爽无遮挡免| 国产精品无大码| 午夜爱爱视频在线播放| 亚洲色图av天堂| 久久久久久国产a免费观看| 伊人久久国产一区二区| 亚洲在久久综合| 国产成年人精品一区二区| 极品教师在线视频| 日韩av不卡免费在线播放| 久久午夜福利片| 亚洲欧美成人精品一区二区| 婷婷六月久久综合丁香| 少妇人妻精品综合一区二区| 亚洲经典国产精华液单| 2018国产大陆天天弄谢| 欧美丝袜亚洲另类| 欧美日韩综合久久久久久| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 日韩电影二区| 国产不卡一卡二| 麻豆乱淫一区二区| 成人毛片a级毛片在线播放| 亚洲va在线va天堂va国产| 人妻一区二区av| 少妇的逼好多水| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 日本欧美国产在线视频| 精品酒店卫生间| av在线天堂中文字幕| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 蜜臀久久99精品久久宅男| 男人和女人高潮做爰伦理| 网址你懂的国产日韩在线| 午夜激情久久久久久久| 国产视频内射| 国产乱人视频| 欧美成人一区二区免费高清观看| 国产精品人妻久久久久久| 国产亚洲91精品色在线| av黄色大香蕉| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 人妻少妇偷人精品九色| 国产高清不卡午夜福利| 国产av国产精品国产| 欧美变态另类bdsm刘玥| 免费电影在线观看免费观看| 国产一级毛片在线| 两个人的视频大全免费| 亚洲精品影视一区二区三区av| 欧美日本视频| 麻豆国产97在线/欧美| 日韩欧美国产在线观看| 只有这里有精品99| 日韩 亚洲 欧美在线| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 直男gayav资源| 美女主播在线视频| 99久国产av精品| 国产三级在线视频| 韩国高清视频一区二区三区| av在线蜜桃| 日韩欧美精品免费久久| 搞女人的毛片| a级毛片免费高清观看在线播放| 国产免费又黄又爽又色| 国产成人免费观看mmmm| 99久国产av精品| 亚洲av国产av综合av卡| 久99久视频精品免费| 人妻夜夜爽99麻豆av| 亚洲高清免费不卡视频| 免费大片黄手机在线观看| 中国国产av一级| 亚洲丝袜综合中文字幕| 22中文网久久字幕| 精品久久久久久久末码| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 亚洲最大成人av| 男女那种视频在线观看| 草草在线视频免费看| 国产单亲对白刺激| 街头女战士在线观看网站| 亚洲精品成人av观看孕妇| 91久久精品电影网| 国产老妇伦熟女老妇高清| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 26uuu在线亚洲综合色| 国产精品久久久久久av不卡| 日韩成人伦理影院| 亚洲伊人久久精品综合| 亚洲精品日本国产第一区| 成人亚洲欧美一区二区av| 在线观看免费高清a一片| 久久鲁丝午夜福利片| 最近中文字幕高清免费大全6| 中国美白少妇内射xxxbb| 最近视频中文字幕2019在线8| 久久久久久久久中文| 国产亚洲91精品色在线| 夜夜爽夜夜爽视频| 精品午夜福利在线看| 精品久久久噜噜| 亚洲av男天堂| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 精品一区二区免费观看| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 又大又黄又爽视频免费| 亚洲成人一二三区av| 免费看a级黄色片| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 午夜日本视频在线| 免费在线观看成人毛片| 免费看a级黄色片| 免费看日本二区| 久久99精品国语久久久| 色视频www国产| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 亚洲成人久久爱视频| 22中文网久久字幕| 熟女人妻精品中文字幕| 国产午夜福利久久久久久| 男人和女人高潮做爰伦理| 免费观看av网站的网址| 六月丁香七月| 国产黄片美女视频| 一区二区三区免费毛片| 九九在线视频观看精品| 亚洲最大成人手机在线| 永久免费av网站大全| 水蜜桃什么品种好| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 三级国产精品片| 亚洲精品自拍成人| 午夜福利视频1000在线观看| 天堂中文最新版在线下载 | 日韩不卡一区二区三区视频在线| 亚洲av不卡在线观看| 国产精品av视频在线免费观看| 亚洲美女搞黄在线观看| 精品久久久久久电影网| 亚洲av在线观看美女高潮| 少妇被粗大猛烈的视频| 亚洲av不卡在线观看| 搡女人真爽免费视频火全软件| 国产乱人偷精品视频| 亚州av有码| 国产激情偷乱视频一区二区| 亚洲最大成人av| 国产成人freesex在线| 日本爱情动作片www.在线观看| 不卡视频在线观看欧美| 在线观看免费高清a一片| 中文天堂在线官网| 国产乱来视频区| 精品久久久久久电影网|