INSM1在甲狀腺髓樣癌病理診斷中的意義

王雪寒,鄭燕軍,王小雙,劉 琰,蔡永萍

甲狀腺髓樣癌(medullary thyroid carcinoma, MTC)是一種起源于甲狀腺濾泡旁細(xì)胞(C細(xì)胞)的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤,占甲狀腺惡性腫瘤的1%～2%,而病死率在甲狀腺癌中超過14%[1-2]。MTC臨床表現(xiàn)隱匿,易發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,晚期患者手術(shù)及放、化療效果有限,預(yù)后較差[3],因此,早發(fā)現(xiàn)、早確診可有效降低患者病死率?，F(xiàn)階段,MTC的診斷主要根據(jù)組織學(xué)及免疫組化標(biāo)記,如Syn、CgA、降鈣素(calcitonin, CT)和CEA[4],但這些指標(biāo)的靈敏度和特異度不夠理想。近期研究表明,INSM1在多種神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中有較高的診斷價值,而在MTC中的報道較少。本文旨在通過免疫組化檢測INSM1在MTC和與其組織學(xué)具有重疊、易混淆的甲狀腺腫瘤中的表達(dá)情況,并與傳統(tǒng)MTC標(biāo)志物進(jìn)行比較,以明確INSM1在MTC病理診斷中的價值。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2019年1月～2022年6月安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院和安徽醫(yī)科大學(xué)附屬宿州醫(yī)院術(shù)后病理確診的甲狀腺腫瘤共計53例,包括28例MTC(實驗組)和25例形態(tài)上與MTC具有重疊的其他甲狀腺腫瘤(包括透明變梁狀腫瘤6例、低分化癌16例、梭形細(xì)胞乳頭狀癌2例和甲狀腺內(nèi)副神經(jīng)節(jié)瘤1例)(對照組)。28例MTC患者年齡42～69歲,中位年齡56歲,其中男性11例,女性17例;25例對照組患者年齡35～81歲,中位年齡59歲,其中男性9例,女性16例。所有標(biāo)本均行HE染色,并由2位高年資病理醫(yī)師經(jīng)HE切片及免疫組化染色明確診斷。

1.2 主要試劑鼠抗人單克隆抗體INSM1(sc-271408)購自Santa Cruz公司;Syn、CgA、CT和CEA抗體購自北京中杉金橋公司;免疫組化染色EnVision兩步法試劑盒購自福州邁新公司。

1.3 免疫組化免疫組化染色采用EnVision兩步法,INSM1抗體稀釋濃度為1 ∶200,Syn、CgA、CT和CEA抗體為即用型抗體。操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4 結(jié)果判斷INSM1陽性定位于細(xì)胞核,Syn、CgA、CT和CEA陽性定位于細(xì)胞質(zhì)。采用半定量積分法對陽性細(xì)胞所占百分率和腫瘤細(xì)胞染色強(qiáng)度進(jìn)行判斷。(1)染色細(xì)胞百分率:選擇著色熱點區(qū)域,在光鏡高倍(×400)下隨機(jī)選取10個視野,計算陽性細(xì)胞率(陽性瘤細(xì)胞數(shù)/總瘤細(xì)胞數(shù))×100%,無陽性細(xì)胞為0分,陽性細(xì)胞數(shù)占1%～5%為1分,6%～10%為2分,11%～50%為3分,≥51%為4分。(2)染色強(qiáng)度:無陽性著色為0分,淺黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分。將兩項得分相乘作為最終評分:0～2分為陰性,3～12分為陽性。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,使用χ2檢驗及Fisher確切概率法進(jìn)行統(tǒng)計分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTC和對照甲狀腺癌中INSM1的表達(dá)在28例MTC中,絕大部分形態(tài)呈典型的梁狀、巢團(tuán)狀或島狀排列(圖1A),瘤細(xì)胞圓形、卵圓形,細(xì)胞核大小較一致,胞質(zhì)淡染,常有淀粉樣物沉積,少數(shù)病例呈梭形細(xì)胞型、小細(xì)胞型、副神經(jīng)節(jié)瘤樣等亞型。INSM1陽性定位于細(xì)胞核,陽性率為96.4%(27/28),即靈敏度為96.4%,其中25例(92.6%,25/27)陽性細(xì)胞比例≥51%,染色強(qiáng)度呈中等至強(qiáng)陽性(圖1B),腫瘤內(nèi)其他細(xì)胞及物質(zhì)(包括殘存的濾泡膠質(zhì)、淀粉樣物及壞死組織等)為陰性,背景干凈,易于判讀。在25例對照組中,INSM1多呈陰性,如透明變梁狀腫瘤(圖1C、D)、甲狀腺低分化癌(圖1E、F)、梭形細(xì)胞乳頭狀癌(圖1G、H),僅在1例副神經(jīng)節(jié)瘤中陽性(圖1I、J),陽性率為4.0%(1/25),即特異度為96.0%。INSM1在實驗組(96.4%)中的陽性率顯著高于對照組(4.0%)(P<0.05)。

2.2 INSM1與傳統(tǒng)MTC標(biāo)志物在MTC中的靈敏度比較在28例MTC中,INSM1染色定位于細(xì)胞核,絕大部分病例陽性細(xì)胞比例≥51%,染色強(qiáng)度為中等至強(qiáng)陽性,背景其他細(xì)胞及物質(zhì)陰性,易于判讀(圖2A);Syn(圖2B)、CgA(圖2C)、CT(圖2D)和CEA(圖2E)定位于細(xì)胞質(zhì),染色模式從彌漫到局灶,強(qiáng)弱程度不盡相同,甚至呈弱斑片狀或小的點狀胞質(zhì)內(nèi)著色,同時部分病例胞質(zhì)著色可與背景淀粉樣物、腫瘤性壞死及殘存的濾泡膠質(zhì)混雜,視化及量化存在一定的主觀性,難以準(zhǔn)確判讀。INSM1、Syn、CgA、CT和CEA診斷MTC的靈敏度分別為96.4%、89.3%、71.4%、78.6%和96.4%。同時在6例CT陰性MTC中,INSM1均呈陽性,靈敏度較高。INSM1在MTC中的靈敏度與CEA一致,優(yōu)于Syn和CT,與CgA相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,表1)。

圖2 甲狀腺髓樣癌中INSM1、Syn、CgA、CT和CEA的表達(dá),EnVison兩步法:A.INSM1染色定位于細(xì)胞核,呈強(qiáng)陽性且背景干凈;B.Syn染色定位于細(xì)胞質(zhì),局部著色且強(qiáng)弱不等,部分區(qū)域不著色;C.CgA染色定位于細(xì)胞質(zhì),著色區(qū)域為點狀胞質(zhì)內(nèi)著色;D.CT染色定位于細(xì)胞質(zhì),局部著色,大部分區(qū)域不著色;E.CEA定位于細(xì)胞質(zhì),背景染色較重,腫瘤內(nèi)淀粉樣物及殘存濾泡膠質(zhì)均著色

表1 INSM1和傳統(tǒng)標(biāo)志物在甲狀腺髓樣癌中的靈敏度比較

2.3 INSM1與傳統(tǒng)MTC標(biāo)志物在對照組中的特異度比較在25例對照組中,INSM1僅在1例副神經(jīng)節(jié)瘤中呈強(qiáng)陽性,顯示了較高的特異度;而Syn、CgA、CT和CEA在多例低分化癌中表達(dá),其中CEA陽性高達(dá)7例。INSM1、Syn、CgA、CT和CEA的特異度分別為96.0%、80.0%、84.0%、88.0%和72.0%。INSM1在對照組中的特異度優(yōu)于Syn、CgA和CT,與CEA相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,表2)。

表2 INSM1與傳統(tǒng)甲狀腺髓樣癌標(biāo)志物在對照組中的特異度比較

3 討論

MTC是一種罕見的甲狀腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤,惡性程度高,易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及局部擴(kuò)散。臨床很多MTC患者初次就診時已經(jīng)進(jìn)展至局部晚期,傳統(tǒng)的手術(shù)及放、化療效果十分有限,病死率較高,早期及時、準(zhǔn)確的診斷和治療可有效延長患者生存期[3,5]。MTC組織學(xué)亞型繁多,包括乳頭狀型、梭形細(xì)胞型、小細(xì)胞型、透明細(xì)胞型、巨細(xì)胞型、嗜酸細(xì)胞型和副神經(jīng)節(jié)瘤樣等十余種,與多種甲狀腺腫瘤形態(tài)均有重疊,盡管MTC可伴有特異的淀粉樣物,但大部分病例很難發(fā)現(xiàn),僅通過組織學(xué)無法診斷。臨床工作中必須通過免疫組化輔助,常用的MTC標(biāo)志物有CT、CEA、Syn和CgA等[4],現(xiàn)有標(biāo)志物效果存在一定局限性,特異度和敏感度均不高,常需聯(lián)合使用,加重了病理工作負(fù)荷和患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。此外,少數(shù)病例CEA、CT雙陰性[6-7],又增加了MTC的診斷難度。因此,我們需要探索MTC中更加敏感、特異的診斷標(biāo)志物。

近年研究發(fā)現(xiàn),INSM1是一種具有C2H2鋅指結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子,最初是從胰島素瘤減數(shù)雜交cDNA文庫中分離出來的,人類和嚙齒動物的表達(dá)譜顯示,INSM1在胎兒大腦和發(fā)育中的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)中豐富,在成人組織中沉默、顯著減少或限制表達(dá)[8-9]。隨后的研究表明,INSM1在神經(jīng)內(nèi)分泌分化過程中作為重要的調(diào)節(jié)因子對神經(jīng)內(nèi)分泌器官的發(fā)育起重要作用,在神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中表達(dá)非常特異,而在其他非神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中幾乎不表達(dá)[10]。近期研究發(fā)現(xiàn),INSM1在多種器官神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中高表達(dá),包括肺、胰腺、胃腸道、頭頸部、子宮頸及泌尿生殖系統(tǒng)等[11-18]。另有研究報道,Rooper等[15]發(fā)現(xiàn)INSM1在頭頸部神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中具有高度的靈敏度(99%)和特異度(97.6%),優(yōu)于傳統(tǒng)的神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)志物,并因此用作神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤診斷標(biāo)志物,但I(xiàn)NSM1在MTC中的研究非常有限。

本實驗結(jié)果顯示,INSM1在MTC中定位于細(xì)胞核,其中25例(92.6%,25/27)陽性細(xì)胞比例均≥51%,染色強(qiáng)度呈中等至強(qiáng)陽性,而傳統(tǒng)的MTC標(biāo)志物(Syn、CgA、CT和CEA)染色定位于細(xì)胞質(zhì),模式從彌漫到局灶,強(qiáng)弱程度不盡相同,甚至呈現(xiàn)弱斑片狀或小的點狀胞質(zhì)內(nèi)著色,有時難以觀察,同時部分病例胞質(zhì)的著色可與背景中淀粉樣物、腫瘤性壞死及殘存的濾泡膠質(zhì)混雜,導(dǎo)致免疫反應(yīng)評估不準(zhǔn)確。相比胞質(zhì)染色模式,核染色更清晰、穩(wěn)定,同時背景干凈,INSM1的染色模式比傳統(tǒng)的MTC標(biāo)志物更易于視化、量化和判讀。WHO(2022版)甲狀腺腫瘤新分類首次對MTC進(jìn)行分級,依據(jù)病理性核分裂象、腫瘤壞死和Ki-67增殖指數(shù)分為高、低級別,將<5個有絲分裂/2 mm2且無壞死和Ki-67<5%歸入低級別MTC,將至少具有以下3個特征之一:≥5個有絲分裂/2 mm2、壞死或Ki-67≥5%歸入高級別MTC[19]。按照最新分級標(biāo)準(zhǔn),本組28例MTC中,5例為高級別,23例為低級別,INSM1僅在1例低級別病例中呈陰性,其余病例均陽性,由此推測INSM1在MTC中的表達(dá)與腫瘤分級無確切相關(guān)性,這可能與本組樣本數(shù)偏少有關(guān)。

本實驗結(jié)果顯示,在28例MTC中,與傳統(tǒng)MTC標(biāo)志物相比,INSM1僅在1例MTC中呈陰性(<5%腫瘤細(xì)胞核弱陽性)(該例MTC中CEA陽性,Syn、CT局灶陽性,臨床血清CT和CEA均異常升高,術(shù)后降至正常,證實為髓樣癌),特異度優(yōu)于Syn和CT,與CgA相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),且在6例CT陰性MTC中INSM1均呈陽性,表現(xiàn)出較高的靈敏度。INSM1在25例對照組中,絕大部分腫瘤INSM1陰性,僅在1例副神經(jīng)節(jié)瘤中呈陽性,而Syn、CgA、CT及CEA在多例低分化癌中陽性,其中CEA高達(dá)7例,表明與傳統(tǒng)MTC標(biāo)志物相比,INSM1具有較高的特異度。Seok等[4]也發(fā)現(xiàn),INSM1在MTC中的靈敏度和特異度均較高,顯著優(yōu)于CgA,這與本實驗結(jié)果一致。

值得注意的是,INSM1在MTC及副神經(jīng)節(jié)瘤中均陽性,易出現(xiàn)診斷陷阱,但副神經(jīng)節(jié)瘤內(nèi)瘤細(xì)胞周圍支持細(xì)胞特異性表達(dá)S-100和SOX-10,可與MTC鑒別。其他需要鑒別的腫瘤:(1)透明變梁狀腫瘤:與MTC均可呈小梁狀或“器官樣”生長伴間質(zhì)透明樣變性,但透明變梁狀腫瘤與正常組織間境界清楚,細(xì)胞呈短梭形或多角形,并垂直于小梁長軸排列,細(xì)胞核圓形、卵圓形,可見核內(nèi)包涵體及核仁。免疫組化標(biāo)記TG、TTF-1和Galectin-3陽性,Ki-67呈特征性的膜陽性,玻璃樣透明變區(qū)PAS特殊染色呈陽性[20]。(2)甲狀腺低分化癌:又稱島狀癌,瘤細(xì)胞呈島狀、梁狀及實性排列,可伴壞死,常含其他甲狀腺癌(乳頭狀癌或濾泡癌等)成分,間質(zhì)無淀粉樣物[21]。免疫組化標(biāo)記TTF-1、TG及PAX8等陽性,CT陰性。(3)梭形細(xì)胞乳頭狀癌:細(xì)胞呈梭形,形態(tài)溫和,形態(tài)與MTC梭形細(xì)胞亞型極其相似,但其內(nèi)可夾雜少量乳頭狀癌成分,無淀粉樣物沉積,免疫組化表達(dá)CK、TTF-1等,不表達(dá)CT、CEA及神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)志物。

綜上,INSM1在MTC診斷中的靈敏度和特異度較高,且為核陽性,易于判讀,優(yōu)于傳統(tǒng)標(biāo)志物,是一種優(yōu)秀的新型神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)志物,值得推廣、應(yīng)用。