陳皮對(duì)土壤中六價(jià)鉻的去除效果及機(jī)理

劉增俊，許賀峰，郭彥旭，樊艷玲*

1. 北京市生態(tài)環(huán)境保護(hù)科學(xué)研究院，北京 100037

2. 四川中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，四川 成都 610101

鉻(Cr)是重要的工業(yè)金屬，常用于金屬冶煉、皮革鞣制、電鍍、木材防腐等行業(yè). 這些工業(yè)活動(dòng)產(chǎn)生的含鉻渣、廢水和廢氣，可能會(huì)由于泄漏、儲(chǔ)存或處置不當(dāng)而污染土壤和地下水[1]. 土壤中的鉻主要以三價(jià)(Ⅲ)和六價(jià)(Ⅵ)兩種形態(tài)存在，且極易通過氧化還原反應(yīng)而相互轉(zhuǎn)化[2]. Cr(Ⅲ)一般以氧化物和氫氧化物的形式存在于土壤中，其毒性和生物可利用度較低，Cr(Ⅵ)主要以陰離子CrO42-和Cr2O72-的形式存在，不易被表面帶負(fù)電的土壤顆粒吸附，相應(yīng)地在土壤中的遷移能力更強(qiáng)[3]. 由于Cr(Ⅵ)的強(qiáng)氧化能力和生物膜穿透特性，其可以通過陰離子交換通道自由穿透細(xì)胞膜，具有毒性、致癌、致突變和致畸性. 研究[4]表明，人體長(zhǎng)期暴露在Cr(Ⅵ)濃度高于4.33 mg/kg的環(huán)境中時(shí)，會(huì)對(duì)腸道、腎臟產(chǎn)生不良影響，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)＜吧?

現(xiàn)階段Cr(Ⅵ)污染土壤修復(fù)主要通過化學(xué)還原，常用的修復(fù)藥劑包括鐵及其化合物、硫化物和有機(jī)改良劑[5-6]. 鐵系物和硫化物具有價(jià)格低廉、修復(fù)高效的優(yōu)點(diǎn)，但在修復(fù)過程中產(chǎn)生的H+和H2S易對(duì)土壤和大氣造成二次污染[7]. 有機(jī)改良劑(包括有機(jī)肥、生物炭等)雖然環(huán)境友好，但獲取途徑受限且修復(fù)效果較低[5]. 因此，尋找價(jià)廉、量大、易獲取且環(huán)境友好的高效修復(fù)藥劑成為Cr(Ⅵ)污染土壤修復(fù)的重要工作之一.

我國(guó)柑橘產(chǎn)量和消費(fèi)量均位居世界前列. 2010-2019年，我國(guó)柑橘產(chǎn)量從2 581.7×104t增至4 584.5×104t，增幅高達(dá)77.58%[8]. 但無論是直接食用還是生產(chǎn)加工，都會(huì)產(chǎn)生40%～50%的果皮廢棄物，這些果皮往往沒有得到合理化利用而被填埋處置[9]. 陳皮是柑橘干燥后的果皮，其中含有豐富的纖維素和黃酮類化合物.這些物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)中含有大量的羥基、羧基等能團(tuán)，對(duì)重金屬有吸附絡(luò)合作用[10]. 趙華等[11]和張瑋等[12]分別使用干燥后的陳皮去除溶液中的Cr(Ⅵ)和Pb(Ⅱ)，發(fā)現(xiàn)陳皮對(duì)兩種重金屬的吸附量分別為56.04%和54.40%. 此外，陳皮中富含的纖維素[13]和黃酮醇苷類物質(zhì)[14]的水解產(chǎn)物可能充當(dāng)電子供體，將Cr(Ⅵ)還原為Cr(Ⅲ). 然而，陳皮對(duì)污染土壤中Cr(Ⅵ)去除效果及機(jī)理研究還不清楚.

鑒于此，該研究以采自河南省某鉻污染場(chǎng)地的土壤為研究對(duì)象，通過室內(nèi)模擬試驗(yàn)，系統(tǒng)探討了陳皮修復(fù)Cr(Ⅵ)污染土壤過程的影響因素、去除效果及作用途徑，以期為Cr(Ⅵ)污染土壤的修復(fù)提供理論支撐.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1化學(xué)試劑和器材

重鉻酸鉀(K2Cr2O7，分析純)購(gòu)自山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司. 所有試驗(yàn)塑料和玻璃容器在使用前均經(jīng)過去離子水潤(rùn)洗.

1.1.2供試土壤

Cr(Ⅵ)污染土壤(HCR)采自河南省某鉻污染場(chǎng)地(34.7°N、111.9°E)，未污染的土壤(HN)采自河南省某農(nóng)田(35.1°N、113.8°E). 兩部分土壤均取自表層(0～20 cm)，由不銹鋼螺旋鉆收集，并裝入聚乙烯塑料密封中，運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室. 在室溫下自然風(fēng)干后，剔除土壤中較大的石塊砂礫和植物根系，研磨后過2 mm尼龍篩，備用.

將采集到的未污染土壤樣品均勻分為3份，每1 kg土壤中分別加入60、100和300 mL K2Cr2O7溶液〔其中Cr(Ⅵ)濃度為10 000 mg/L〕，使土壤中Cr(Ⅵ)的初始濃度分別達(dá)到600、1 000和3 000 mg/kg，依次記為HN-Low、HN-Mid和HN-High. 向土壤中加入去離子水，使土壤含水量達(dá)到35%±5%，于室溫條件下老化60 d，備用.

土壤理化性質(zhì)見表1.

表1 供試土壤理化性質(zhì)Table 1 Physiochemical properties of the test soils

1.1.3陳皮

市場(chǎng)采購(gòu)?fù)耆墒斓母涕?，自來水沖洗并用刷子刷去表面蠟質(zhì)，剝皮后用去離子水將橘子皮清洗3～5遍. 將干凈的橘皮放入干燥箱中105 ℃下殺青30 min，并在60 ℃下干燥36 h，粉碎后過0.15 mm尼龍篩，貯存于干燥陰涼處，備用.

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1陳皮添加量和Cr(Ⅵ)初始濃度對(duì)土壤中Cr(Ⅵ)去除過程的影響

為分析陳皮對(duì)土壤中高Cr(Ⅵ)濃度的去除效果，向HN-High土壤中分別加入1.0%、2.0%、2.5%、5.0%、7.5%和10.0%(土壤干質(zhì)量的百分比)的陳皮粉末，以不添加陳皮粉末的土壤作為對(duì)照，在培養(yǎng)第0、3、7、15、25和30天取樣，分析土壤中Cr(Ⅵ)濃度及其浸出濃度的變化.

基于上述試驗(yàn)結(jié)果，將5%的陳皮粉末分別添加到3種不同污染程度(HN-Low、HN-Mid和HN-High)的室內(nèi)模擬土壤中，分別標(biāo)記為HT-Low、HT-Mid和HT-High，以不添加陳皮粉末的土壤作為對(duì)照，在培養(yǎng)第0、3、7、15、25和30天取樣，分析土壤中Cr(Ⅵ)濃度及其浸出濃度的變化.

1.2.2陳皮對(duì)污染土壤中Cr(Ⅵ)的去除效果及機(jī)制

選取Cr(Ⅵ)污染土壤，設(shè)置滅菌和非滅菌兩種處理. 采用MLS-3751L-PC全自動(dòng)高壓滅菌器(Sanyo，Japan)滅菌2次，溫度設(shè)定60 ℃，時(shí)間持續(xù)6 h，每次間隔2 h，滅菌完成后獲得滅菌土壤. 試驗(yàn)處理如下： ①不做任何處理的Cr(Ⅵ)污染土壤(CK)；②滅菌處理的Cr(Ⅵ)污染土壤(CKST)；③Cr(Ⅵ)污染土壤添加5%的陳皮(HT)；④滅菌后的Cr(Ⅵ)污染土壤添加5%的陳皮(HTS). 在培養(yǎng)第30天取樣，分析土壤中Cr(Ⅵ)濃度及其浸出濃度和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化.

所有處理均在室溫下培養(yǎng)，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)平行. 在培養(yǎng)周期內(nèi)，定期向處理土壤中加入去離子水，使土壤含水量維持在30%～40%. 每個(gè)處理采集土樣200 g，用于Cr(Ⅵ)濃度及其浸出濃度的測(cè)定. 處理額外采集土樣20 g，用于16S rDNA測(cè)定.

1.3 分析方法

1.3.1土壤理化性質(zhì)測(cè)定

使用FiveEasy Plus臺(tái)式pH計(jì)〔FE28-Standard，梅特勒托利多科技(中國(guó))有限公司〕在土壤-水懸浮液中(m/V為1∶2.5)測(cè)定pH；使用TOC-5000分析儀(Shimadzu，Japan)測(cè)定總有機(jī)碳含量；使用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀〔ICAP RQ，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司〕測(cè)量陽離子交換量[15]. 參照《土壤和沉積物銅、鋅、鉛、鎳、鉻的測(cè)定 火焰原子吸收分光光度法》(HJ 491-2019)和《土壤和沉積物 六價(jià)鉻的測(cè)定 堿溶液提取-火焰原子吸收分光光度法》(HJ 1082-2019)分別測(cè)定土壤中總鉻和Cr(Ⅵ)濃度，檢出限分別為4和0.5 mg/kg；參照《固體廢物 浸出毒性浸出方法 硫酸硝酸法》(HJ/T 299-2007)測(cè)定Cr(Ⅵ)的浸出濃度，檢出限為0.004 mg/L.

1.3.2DNA提取與高通量測(cè)序

土壤總DNA使用天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)的Magnetic Soil And Stool DNA試劑盒提取.應(yīng)用帶有barcode的特異性引物序列341F(5'-CCTA YGGGRBGCASCAG-3')和806R(5'-GGACTACNNGG GTATCTAAT-3')擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA的V3～V4區(qū)域.使用TruSeq DNA PCR-Free Library Preparation試劑盒(Illumina，USA)建庫(kù)試劑盒進(jìn)行文庫(kù)的構(gòu)建，經(jīng)Qubit@2.0熒光劑定量和檢測(cè)后，用Illumina NovaSeq進(jìn)行高通量測(cè)序.

使用fastp(Version 0.20.0)對(duì)測(cè)得的原始序列進(jìn)行質(zhì)控，使用FLASH(Version 1.2.7)對(duì)原始序列片段進(jìn)行拼接[16]. 拼接后的數(shù)據(jù)由QIIME(Version 1.9.1)[17]質(zhì)量過濾器過濾后，基于97%的序列相似性進(jìn)行OTU歸并和劃分，并使用RDP classifier[18]對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類注釋. Chao1指數(shù)和Shannon-Wiener指數(shù)分別用于評(píng)價(jià)土壤細(xì)菌群落的豐富度和均勻度[19].通過主坐標(biāo)分析(Principal co-ordinates analysis，PCoA)和優(yōu)勢(shì)物種相對(duì)豐度分析來揭示細(xì)菌群落組成與結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律. 主坐標(biāo)分析和群落組成分析制圖均利用R語言(Version 3.3.1)工具. 采用PICRUST對(duì)OTU豐度表進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，計(jì)算各功能類別的豐度，并通過Student's t-test對(duì)PICRUST中功能基因進(jìn)行假設(shè)性檢驗(yàn)，以評(píng)估豐度差異的顯著性水平[20].

1.3.3XANES分析

使用中國(guó)科學(xué)院高能物理研究所1W1B-XAFS試驗(yàn)站的同步輻射裝置測(cè)定鉻K邊的X射線近邊吸收光譜(X-ray absorption near-edge structure，XANES).光束線為1W1B，儲(chǔ)存環(huán)中電子能量為2.5 GeV，流量為200 mA. Cr的參考標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)包括K2Cr2O7和CrCl3.由于樣品中Cr的濃度較低，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中Cr的濃度較高，故分別采用熒光模式和透射模式進(jìn)行測(cè)定，以確保結(jié)果更加真實(shí)合理. 使用Athena軟件測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行合并、本底扣除和歸一化分析[21].

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0和Excel 2019軟件進(jìn)行處理.

2 結(jié)果與討論

2.1 陳皮添加量對(duì)土壤中Cr(Ⅵ)去除效果的影響

不同陳皮添加量對(duì)土壤中Cr(Ⅵ)濃度及其浸出濃度的去除效果見圖1. 由圖1可見，隨著陳皮添加量的增加，土壤中Cr(Ⅵ)濃度及其浸出濃度均顯著降低. 當(dāng)陳皮添加量由1%增至5%時(shí)，土壤中Cr(Ⅵ)的去除效果明顯增強(qiáng)，Cr(Ⅵ)濃度從(405.50±7.50)mg/kg降 至(14.50±6.98) mg/kg，Cr(Ⅵ)浸 出 濃 度 從(31.40±0.10) mg/L降至(1.06±0.28) mg/L. 繼續(xù)增加陳皮添加量至10%，土壤中Cr(Ⅵ)濃度及其浸出濃度略有下降，直至趨于穩(wěn)定，Cr(Ⅵ)濃度及其浸出濃度分別為(5.24±2.31) mg/kg和(0.47±0.11) mg/L. 陳皮添加量的進(jìn)一步增加并沒有導(dǎo)致Cr(Ⅵ)去除效果的顯著增強(qiáng). 可見，陳皮添加量為5%時(shí)能較好地去除土壤中Cr(Ⅵ).

圖1 陳皮添加量對(duì)土壤中Cr(Ⅵ)濃度和Cr(Ⅵ)浸出濃度的影響Fig.1 Effect of the amount of tangerine peel added on the Cr(Ⅵ) concentration in soil and the Cr(Ⅵ)leaching concentration with cultivation time

2.2 Cr(Ⅵ)初始濃度對(duì)陳皮去除土壤中Cr(Ⅵ)效果的影響

陳皮對(duì)不同Cr(Ⅵ)污染程度土壤的去除效果如圖2所示. 由圖2可見，未添加陳皮時(shí)，各處理土壤中Cr(Ⅵ)濃度和浸出濃度在30 d內(nèi)沒有明顯變化.添加5%陳皮后，各處理土壤中Cr(Ⅵ)濃度和浸出濃度均隨培養(yǎng)時(shí)間的增加而降低，其中HT-Low處理的下降速率最快，HT-Mid和HT-High次之. 隨著Cr(Ⅵ)初始濃度升高，陳皮對(duì)土壤中Cr(Ⅵ)的去除效果逐漸減弱. 然而，即使當(dāng)土壤中Cr(Ⅵ)初始濃度高達(dá)(1 713.33±206.77) mg/kg時(shí)，陳皮對(duì)Cr(Ⅵ)的去除率仍可達(dá)99.15%. 由此可見，陳皮對(duì)不同Cr(Ⅵ)程度的污染土壤均有較好的修復(fù)效果.

圖2 土壤中Cr(Ⅵ)初始濃度對(duì)陳皮去除Cr(Ⅵ)效果的影響Fig.2 Effect of the initial Cr(Ⅵ) concentration on the Cr(Ⅵ) removal efficiency in soil by tangerine peel

2.3 土壤滅菌對(duì)陳皮去除土壤中Cr(Ⅵ)效果的影響

陳皮對(duì)未滅菌(CK)和滅菌土壤(CKST)中Cr(Ⅵ)的去除效果如圖3所示. 由圖3可見，在未添加陳皮時(shí)，土壤中Cr(Ⅵ)濃度及其浸出濃度在滅菌前后無顯著變化，表明單一滅菌處理對(duì)土壤中Cr(Ⅵ)濃度和浸出濃度的影響有限. 陳皮添加量為5%時(shí)，CK處理中Cr(Ⅵ)濃度由初始的(1 600.13±298.11) mg/kg降至(10.07±2.98) mg/kg，Cr(Ⅵ)浸出濃度由初始的(143.20±13.5) mg/L降至(1.02±0.30) mg/L；而CKST處理土壤中Cr(Ⅵ)濃度從(1 596.67±216.73) mg/kg降至(143.20±13.5) mg/L，Cr(Ⅵ)浸出濃度從(135.24±5.87)mg/L降至(8.28±1.56) mg/L. 結(jié)果表明，陳皮對(duì)CK處理中Cr(Ⅵ)的去除效果顯著高于CKST處理(P＜0.05)，土壤微生物可能是造成該現(xiàn)象的主要原因. 土壤中細(xì)菌與重金屬離子之間存在復(fù)雜的關(guān)系，活性狀態(tài)下重金屬離子會(huì)影響細(xì)菌的多樣性和代謝活性，而細(xì)菌可以通過防御系統(tǒng)緩解重金屬離子的脅迫，如將活性態(tài)重金屬離子轉(zhuǎn)化為非活性態(tài)[22]. 可見，除陳皮本身的去除作用外，土壤微生物也會(huì)對(duì)陳皮去除土壤中Cr(Ⅵ)產(chǎn)生積極作用.

圖3 滅菌處理對(duì)陳皮去除土壤中Cr(Ⅵ)濃度和Cr(Ⅵ)浸出濃度的影響Fig.3 Effect of sterilization treatment on the removal of Cr(Ⅵ) concentration and Cr(Ⅵ) leaching concentration from soil by tangerine peel

2.4 陳皮對(duì)土壤中細(xì)菌群落多樣性的影響

由圖4可見，與CK處理相比，CKST處理中細(xì)菌群落的Chao1指數(shù)和Shannon-Wiener指數(shù)無顯著變化(P＞0.05). 這與Carter等[23]的試驗(yàn)結(jié)果不一致，這可能是由于在高溫高壓滅菌過程中，容器中的土壤很難達(dá)到完全分布均勻的狀態(tài)，使得土壤中的部分區(qū)域受熱不均以致很難使土壤細(xì)菌完全失活. 此外，如果土壤中某些細(xì)菌處在對(duì)高溫高壓有較強(qiáng)抗性的芽孢或休眠階段，它們也會(huì)一直存在于滅菌后的土壤中，甚至?xí)捎谕饨绛h(huán)境條件的改變(溫度升高、壓強(qiáng)增大)，在短時(shí)間內(nèi)轉(zhuǎn)為活性狀態(tài)并大量繁殖[24]. 上述兩點(diǎn)原因可能直接導(dǎo)致了CKST處理中細(xì)菌群落的多樣性指數(shù)無明顯變化.

圖4 不同土壤中細(xì)菌群落的Shannon-Wiener指數(shù)和Chao1指數(shù)Fig.4 Shannon-Wiener and Chao1 indexes of the soil bacteria in different treatments

添加陳皮后，CK和CKST處理中細(xì)菌群落的Chao1指數(shù)和Shannon-Wiener指數(shù)呈現(xiàn)不同的變化規(guī)律. CK處理土壤中細(xì)菌群落的Chao1指數(shù)顯著降低，Shannon-Wiener指數(shù)無顯著變化；而CKST處理土壤中細(xì)菌群落的Chao1指數(shù)無顯著變化，Shannon-Wiener指數(shù)卻顯著降低. 結(jié)果表明，陳皮不論添加至未滅菌土壤還是滅菌后土壤，都會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌群落多樣性的降低. 然而，一些研究[25-26]表明，將農(nóng)林廢棄物添加至土壤后，有機(jī)碳和有效氮含量的增加會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌群落多樣性也隨之增加. 這與本研究所得試驗(yàn)結(jié)果不一致，原因可能是土壤中鉻的形態(tài)和濃度影響了細(xì)菌群落的構(gòu)建.

主成分分析可反映不同處理中細(xì)菌群落組成的差異性. 由圖5可見，相同處理下土壤菌群較好地聚集在一起，而不同處理群落之間具有明顯分異. 其中，未經(jīng)過高溫高壓滅菌處理的兩組(CK和HT)距離較近，表明陳皮在除去土壤中Cr(Ⅵ)的過程中對(duì)土壤細(xì)菌群落的擾動(dòng)較小，同時(shí)再次證實(shí)了細(xì)菌在陳皮去除Cr(Ⅵ)過程中的貢獻(xiàn)較小.

圖5 不同處理土壤中細(xì)菌群落的主成分分析Fig.5 Principal component analysis of the bacterial community

2.5 陳皮對(duì)土壤中細(xì)菌群落組成的影響

不同處理土壤的細(xì)菌群落相對(duì)豐度如圖6所示.由圖6可見，厚壁菌門(Firmicutes)是CK處理中的優(yōu)勢(shì)菌門，其相對(duì)豐度為64.14%；芽孢桿菌屬(Bacillus)則是該處理中的最優(yōu)菌屬，其相對(duì)豐度為54.69%. 與CK處理相比，經(jīng)過高溫高壓滅菌處理的CKST處理土壤中厚壁菌門(Firmicutes)的相對(duì)豐度降至6.92%，變形菌門(Proteobacteria)的相對(duì)豐度增至70.48%；青枯菌屬(Ralstonia)和假單胞菌屬(Pseudomonas)是此時(shí)土壤中存在較為豐富的菌種，它們的相對(duì)豐度分別為35.31%和16.21%. 放線菌門(Actinobacteria)是廣泛存在于各處理土壤中的菌門，其在HTS處理土壤中相對(duì)豐度(83.30%)最大，HT處理(25.64%)次之. 然而，HT處理中并沒有優(yōu)勢(shì)菌種，但鏈霉菌屬(Streptomyces)是HTS處理土壤中的優(yōu)勢(shì)菌屬(71.24%).

圖6 不同處理土壤中細(xì)菌群落的物種組成Fig.6 Species composition of the soil bacterial community

根據(jù)樣本間物種豐度的相似性進(jìn)行聚類，可更明顯地呈現(xiàn)各組處理土壤中高豐度和低豐度的菌種. 由圖7可見，HT_2和CK處理的3個(gè)樣本較好地聚類在一起，而CKST_3和HTS處理的3個(gè)樣本聚類在一起，前者表明陳皮對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的擾動(dòng)較低，后者則表明在滅菌時(shí)土壤受熱不均勻，導(dǎo)致土壤中仍存在具有Cr(Ⅵ)去除潛力的菌種. 盡管如此，各處理土壤中均有特異性菌種富集. CK處理土壤中相對(duì)豐度較高的菌屬多具有耐鹽、耐堿和金屬耐受性，如諾卡氏菌屬[27](Nocardioides)、嗜鹽生地所球菌[28](Egicoccus)等，但它們只能在非高溫的土壤中才能正常生長(zhǎng). 高溫高壓滅菌處理使土壤中大部分土著菌屬失去活性，高度靈活且具有趨化性的菌屬數(shù)量增加，如青枯菌屬[29](Ralstonia)、Bryobacter[30]等，這些菌屬不僅具有耐鹽、耐堿或金屬耐受性，同時(shí)還具有嗜溫?zé)嵝? 當(dāng)添加陳皮后，有機(jī)碳等物質(zhì)的輸入豐富了土壤中細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)底物，與碳、氮固定相關(guān)的菌屬大量富集. 同時(shí)也刺激了原有土壤中具有Cr(Ⅵ)還原潛力菌屬的代謝和繁殖，使其在處理后的土壤中得到不同程度的富集，并能將有機(jī)碳作為活性電子供體促進(jìn)了Cr(Ⅵ)的還原[31]. 其中HT處理中典型的菌屬包括微桿菌屬(Microbacterium)、土壤球菌屬(Agrococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)，HTS處理土壤中的典型菌屬則為鏈霉菌屬(Streptomyces).

圖7 不同處理土壤中特異性富集菌屬的相對(duì)分布情況Fig.7 Relative distribution of some bacterial genera in each treatment

一些研究證實(shí)了這些特異性富集菌屬具有Cr(Ⅵ)還原潛力，如Chen等[32]在制革廠的土壤中發(fā)現(xiàn)并分離出土壤球菌屬(Agrococcus)的兩個(gè)Cr(Ⅵ)還原菌株，并證實(shí)它們對(duì)Cr(Ⅵ)的最大去除率可達(dá)99.1%. 微桿菌屬(Microbacterium)是存在于制革廢水的革蘭氏陽性菌，能適應(yīng)Cr(Ⅵ)濃度較高的環(huán)境. 研究[33]表明，微桿菌屬(Microbacterium)對(duì)環(huán)境中不同濃度Cr(Ⅵ)均有去除效果，但去除效果卻隨Cr(Ⅵ)濃度的升高而減弱. 在Cr(Ⅵ)還原過程中，微桿菌屬(Microbacterium)表面形態(tài)與胞內(nèi)代謝活動(dòng)發(fā)生變化，大量鉻酸鹽還原酶在胞內(nèi)累積，這表明它依靠胞內(nèi)酶還原Cr(Ⅵ). 鏈球菌屬(Streptococcus)是近期被證實(shí)可用于Cr(Ⅵ)修復(fù)的菌屬，它主要通過細(xì)菌表面形成的生物膜吸附Cr(Ⅵ)，如Streptococcus equisimilis[34]、Streptococcus salivarius[35]兩種代表菌株. 而HTS處理土壤中的鏈霉菌屬(Streptomyces)則是現(xiàn)階段修復(fù)Cr(Ⅵ)污染土壤的代表性菌屬，其大多數(shù)菌株對(duì)濃度低于200 mg/L的土壤具有極高的修復(fù)效果，并在35 ℃時(shí)仍具有較好的Cr(Ⅵ)去除效果，它主要利用細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的脫氫酶還原Cr(Ⅵ)[36]. 這些研究結(jié)果表明，陳皮的添加驅(qū)動(dòng)了土壤中Cr(Ⅵ)還原菌不同程度的富集. 當(dāng)土壤細(xì)菌處于重金屬污染的環(huán)境時(shí)，低濃度的重金屬能促進(jìn)它們的生長(zhǎng)，但隨著重金屬濃度的增加，它們會(huì)受到明顯的抑制作用[31]. 在該研究高濃度Cr(Ⅵ)污染土壤中，陳皮的加入除了給予細(xì)菌大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外，還在一定程度上緩解了Cr(Ⅵ)對(duì)土壤細(xì)菌的毒性抑制作用，改善了土壤細(xì)菌的外在生長(zhǎng)環(huán)境，促進(jìn)了具有Cr(Ⅵ)還原潛力的土著菌種數(shù)量的增大和累積. 盡管這些菌屬不同時(shí)存在于陳皮處理后的土壤中，但這也是陳皮去除Cr(Ⅵ)過程中不可忽視的途徑.

2.6 陳皮對(duì)土壤中細(xì)菌群落功能基因的影響

基于土壤細(xì)菌群落變化，利用PICRUST軟件對(duì)陳皮處理后菌群的功能基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，基因的平均占比及顯著性如圖8所示. 這些變化的功能基因中有8個(gè)功能基因的表達(dá)比例在陳皮處理組中表現(xiàn)為增加，其中維生素B6代謝功能顯著上調(diào)(P＜0.05).

圖8 不同處理土壤中細(xì)菌群落代謝功能分析Fig.8 Functional analysis of the bacterial community

添加陳皮后，由于有機(jī)碳的大量輸入，細(xì)菌胞質(zhì)中三羧酸、戊糖磷酸等途徑顯著上調(diào). 同時(shí)參與碳、氮代謝且能介導(dǎo)應(yīng)激反應(yīng)的磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)的相關(guān)基因也大量表達(dá)，這是細(xì)菌催化轉(zhuǎn)運(yùn)和調(diào)節(jié)能力的一種體現(xiàn)，可能是細(xì)菌緩解Cr(Ⅵ)毒性的一種代謝途徑. 由于土壤中Cr(Ⅵ)濃度隨著陳皮添加量的增加而逐漸降低，細(xì)菌胞內(nèi)DNA也通過堿基切除修復(fù)、錯(cuò)配修復(fù)等自身修復(fù)系統(tǒng)加以重組和修復(fù). 然而，在HT處理中菌群的維生素B6代謝起到不可忽視的調(diào)節(jié)作用. 維生素代謝是細(xì)菌還原Cr(Ⅵ)的一種非特異性反應(yīng)，其往往是作為氧化還原的中間產(chǎn)物參與去除過程，但細(xì)菌中僅有少數(shù)維生素類化合物被證實(shí)具有Cr(Ⅵ)還原潛力，如維生素B2[37]和維生素C[38]. 現(xiàn)階段，維生素B6減輕Cr(Ⅵ)毒性的能力僅在小白鼠身上得到證實(shí)[39]，但鑒于動(dòng)物細(xì)胞和菌細(xì)胞的差異，其在緩解細(xì)菌Cr(Ⅵ)毒性方面的作用還需進(jìn)一步研究確認(rèn).

2.7 陳皮對(duì)土壤中Cr(Ⅵ)去除機(jī)理

通過X射線近邊吸收光譜分析了CK和HT處理土壤中鉻形態(tài)的變化. 從XANES圖譜(見圖9)中可以看到，標(biāo)樣K2Cr2O7在5 992 eV附近有明顯的特征峰Peak1，CrCl3在6 007 eV附近有明顯的特征峰Peak2，這分別代表了Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)的特征峰. 對(duì)比兩組處理發(fā)現(xiàn)，CK處理同時(shí)在Peak1和Peak2處出現(xiàn)峰值，表明土壤中同時(shí)存在Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ). 向土壤中添加陳皮后，Peak1峰面積顯著減小，Peak2峰面積顯著增加，表明土壤中Cr(Ⅵ)被還原為Cr(Ⅲ).

圖9 陳皮對(duì)土壤中Cr賦存狀態(tài)的影響Fig.9 Normalized K-edge spectra of Cr in soil

盡管陳皮本身和土壤細(xì)菌均在去除過程中起作用，但陳皮本身可能起主導(dǎo)作用，即陳皮在進(jìn)入土壤后被微生物分解，其中的大分子物質(zhì)(如纖維素、黃酮醇苷)等水解釋放出可絡(luò)合還原Cr(Ⅵ)的小分子有機(jī)物(如葡萄糖[13]、槲皮素[14]等). 研究證實(shí)，槲皮素中具有孤對(duì)電子的雙鍵基團(tuán)和羥基基團(tuán)，能與Cr(Ⅵ)發(fā)生螯合作用，過程中Cr(Ⅵ)易被槲皮素還原為Cr(Ⅲ)，而槲皮素作為電子提供者則被氧化為醌類物質(zhì)，其對(duì)Cr(Ⅵ)的還原率高達(dá)99.99%[13,40]. 葡萄糖作為還原性糖，其分子中的醛基官能團(tuán)也可將Cr(Ⅵ)還原，并產(chǎn)生鉻酸絡(luò)合物或氫氧化鉻不溶性物質(zhì)[18,41]. 因此，這些有機(jī)物可能在陳皮去除Cr(Ⅵ)過程一直發(fā)揮著作用.

綜上，陳皮去除土壤中Cr(Ⅵ)的主要作用途徑是通過其中纖維素和黃酮醇苷等在土壤中水解的小分子物質(zhì)，直接將Cr(Ⅵ)還原為Cr(Ⅲ). 此外，陳皮可作為碳源，驅(qū)動(dòng)土壤中具有Cr(Ⅵ)還原能力的菌種間接還原Cr(Ⅵ)，但其貢獻(xiàn)量較低.

3 結(jié)論

a) 陳皮能在較短時(shí)間內(nèi)有效去除污染土壤中Cr(Ⅵ)，當(dāng)土壤中Cr(Ⅵ)初始濃度為(1 600.13±298.11)mg/kg、Cr(Ⅵ)浸出濃度為(143.20±13.5) mg/L、陳皮添加量為5%時(shí)，培養(yǎng)30 d后，土壤中Cr(Ⅵ)濃度及其浸出濃度分別降至(10.07±2.98) mg/kg和(1.02±0.30)mg/L，去除率分別達(dá)到99.37%和99.29%.

b) 陳皮降低了土壤中細(xì)菌群落的豐度和多樣性，并改變了群落的組成. 放線菌門(Actinobacteria)是陳皮添加后土壤中的優(yōu)勢(shì)菌門，而微桿菌屬(Microbacterium)、土壤球菌屬(Agrococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)和鏈霉菌屬(Streptomyces)是土壤中特異性富集的4種菌屬，且均具有還原Cr(Ⅵ)的潛力. 此外，細(xì)菌群落中維生素B6代謝的相關(guān)基因顯著上調(diào)，這可能是它們還原Cr(Ⅵ)的主要代謝途徑.

c) 陳皮對(duì)土壤中Cr(Ⅵ)的去除是一個(gè)復(fù)雜的過程，陳皮中大分子物質(zhì)的水解產(chǎn)物對(duì)Cr(Ⅵ)的還原作用在過程中起主要作用. 此外，陳皮也可作為碳源，驅(qū)動(dòng)土壤中具有Cr(Ⅵ)還原能力的菌種富集，但其還原貢獻(xiàn)量較低.