老年白內(nèi)障患者血清miR-26a和miR-26b表達水平及意義*

曾 濤，唐曉蕾，曾 建

電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬綿陽醫(yī)院·綿陽市中心醫(yī)院眼科,四川綿陽 621000

白內(nèi)障是導(dǎo)致中老年人低視力和致盲的主要病因，據(jù)統(tǒng)計50歲以上人群白內(nèi)障患病率達22.24%，70歲以上為60.03%[1]。白內(nèi)障以晶狀體混濁為主要病理特征，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)介導(dǎo)的晶狀體纖維化是導(dǎo)致晶狀體混濁的關(guān)鍵[2]。EMT可介導(dǎo)成肌纖維細胞積累，膠原蛋白過度分泌，沉積于晶狀體，引起晶狀體渾濁和視力障礙[3]。微小核糖核酸(miRNA)具有基因轉(zhuǎn)錄后表達水平調(diào)控作用，影響細胞增殖、分化、凋亡等過程，在晶狀體上皮細胞凋亡和EMT過程中也發(fā)揮著重要的作用[4]?，F(xiàn)有研究顯示miR-26家族成員miR-26a、miR-26b在EMT和纖維化中起關(guān)鍵作用，miR-26a可通過抑制EMT減少滋養(yǎng)層細胞增殖和侵襲[5]，還可負性調(diào)控心房組織血管緊張素Ⅱ/ Kruppel樣因子4/轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)通路抑制心臟纖維化[6]。miR-26b可抑制其靶點Gata4表達水平，抑制血管緊張素-Ⅱ引起的心室心肌細胞中心鈉素和β肌球蛋白重鏈表達水平，抑制心肌纖維化和肥大[7]。但miR-26a、miR-26b在白內(nèi)障的報道十分少見，鑒于此本研究擬檢測血清miR-26a、miR-26b的表達水平，分析其與老年人白內(nèi)障易感的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2018年2月至2021年12月本院收治的137例老年白內(nèi)障患者作為白內(nèi)障組，其中男56例，女81例，年齡62～77歲，平均(68.15±5.19)歲，中位體質(zhì)量指數(shù)23.65 kg/m2，中位收縮壓135.26 mm Hg，中位舒張壓72.16 mm Hg；基礎(chǔ)疾?。焊哐獕?1例，糖尿病75例；吸煙史62例，飲酒史35例。納入標準：(1)裂隙燈顯微鏡、超聲等檢查確認存在晶狀體混濁，經(jīng)臨床診斷為白內(nèi)障[8]；(2)年齡60歲以上；(3)入組前未接受手術(shù)、藥物治療。排除標準：(1)眼外傷、眼球震顫、青光眼等；(2)瞳孔、晶狀及角膜等器質(zhì)性病變；(3)患有感染、免疫性疾病或血液疾??；(4)合并肝纖維化、腎纖維化、肺纖維化等疾病。另選擇同期于本院門診體檢的107例志愿者作為對照組，均排除白內(nèi)障、青光眼、眼底病變等眼部疾病，其中男42例，女65例，年齡61～76歲，平均(67.79±5.07)歲，中位體質(zhì)量指數(shù)23.52 kg/m2，中位收縮壓134.05 mm Hg，中位舒張壓72.09 mm Hg；基礎(chǔ)疾?。焊哐獕?2例，糖尿病35例；吸煙史23例，飲酒史21例。兩組受試者均對本研究知情同意；白內(nèi)障組合并糖尿病、吸煙史比例高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；兩組年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)、收縮壓、舒張壓、合并高血壓比例比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1.2儀器與試劑 M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶(Epicentre 公司)，TRIzol試劑盒(美國賽默飛公司)，CFX96實時熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad)，cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國賽默飛公司，引物序列測定及合成由上海基康公司完成，SpectraMax?iD5 多功能酶標儀(上海美谷分子儀器有限公司)，雙抗體夾心酶聯(lián)免疫試劑盒購自奧維亞生物技術(shù)有限公司。使用日立HITACHI 7600-020全自動生化分析儀及其配套試劑。

1.3方法

1.3.1miR-26a、miR-26b的表達水平及纖維化指標檢測 所有受試者均于入組后當天采集靜脈血3 mL注入干燥試管，血液凝固后取上層液離心(4 ℃ 3 000 r/min，半徑10 cm，時間15 min)，上機檢測。采用TRIzol法提取總RNA，選擇吸光度值A(chǔ)260/A280比值位于1.9～2.1的RNA樣品，采用M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶將其轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：50 ℃逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)45 min,再85 ℃ 5 min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。實時熒光PCR 儀檢測血清中miR-26a、miR-26b的表達水平。引物序列：miR-26a正向引物為5′-CGG TTC AAG TAT CCA GGA-3′;反向引物為5′-TGG GTT CAT TTG TGG GTC TT-3′。miR-26b正向引物為5′-CGG CCT GTT GTC CAT TAG T-3′，反向引物為5′-TGG GTT CAT TTC TGG GTG TT-3′。β-actin正向引物為5′-TGT CCA CCT TCC AGC AGA TGT-3′，反向引物為5′-GCT CAG TAA CAG TCC GCC TAG A-3′。反應(yīng)體系：SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ′(2×)12.5 μL，dNTP 1.6 μL，Taq DNA 聚合酶1 μL，正、反向引物 10 μmol/L各1 μL，加反應(yīng)緩沖液至20 μL。反應(yīng)參數(shù)：92 ℃預(yù)變性 20 s，96 ℃ 變性2 s，85 ℃延伸 20 s，80 ℃ 退火6 s，共30 個循環(huán)。以β-actin 為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計算miR-26a、miR-26b相對表達水平，取3 次平行試驗的平均值。取血清樣本，采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清轉(zhuǎn)化生長因子-β2(TGF-β2)、透明質(zhì)酸(HA)、Ⅳ型膠原(Ⅳ-C)、層黏連蛋白(LN)、Ⅲ型前膠原肽(PCⅢ)水平。

1.3.2臨床資料收集 收集所有受試者性別、年齡、體質(zhì)量、收縮壓、舒張壓、基礎(chǔ)疾病(高血壓、糖尿病)、生活習(xí)慣(吸煙、飲酒、戶外陽光暴露時間)、實驗室指標；收集患者白內(nèi)障晶狀體渾濁分級(LOCSⅢ分級)。采用酶法檢測血清總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、直接法測定低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)。血糖儀檢測末梢血空腹血糖(FPG)，ACCESS 2全自動免疫分析及其配套試劑測定血清空腹胰島素(FINS)。根據(jù)FPG、FINS計算穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)]，公式為HOMA-IR= FPG×FINS/22.5。LOCSⅢ分級從6張晶狀體斷面彩色照片分析晶狀體核(NC)顏色和皮質(zhì)(C)，后囊膜(P)渾濁程度并進行評分，評分范圍：NC顏色1.0～6.9分，C渾濁為1.0～5.9分，P渾濁為1.0～5.9分[9]。

2 結(jié) 果

2.1白內(nèi)障組和對照組LOCSⅢ分級戶外陽光暴露時間、糖脂代謝指標比較 白內(nèi)障組LOCSⅢ分級NC顏色評分1～5分，平均(3.39±0.78)分；C評分1～4分，平均(2.45±0.37)分；P評分1～3分，平均(1.97±0.23)分。白內(nèi)障組戶外陽光暴露時間長于對照組，血清TC、FPG、FINS水平，HOMA-IR指數(shù)高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 白內(nèi)障組和對照組戶外陽光暴露時間、糖脂代謝指

2.2白內(nèi)障組和對照組血清miR-26a、miR-26b和血清纖維化指標比較 白內(nèi)障組血清miR-26a、miR-26b表達水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，TGF-β2、HA、Ⅳ-C、LN、PCⅢ水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 白內(nèi)障組和對照組血清miR-26a、miR-26b和血清纖維化指標差異

2.3miR-26a、miR-26b表達與LOCSⅢ分級評分的相關(guān)性 miR-26a、miR-26b表達與LOCSⅢ分級NC顏色、C、P評分均呈負相關(guān)(P<0.05)，見表3。

表3 miR-26a、miR-26b表達與LOCSⅢ分級評分的相關(guān)性

2.4miR-26a、miR-26b表達水平與纖維化指標相關(guān)性分析 miR-26a、miR-26b表達水平與TGF-β2、HA、Ⅳ-C、LN、PCⅢ均呈負相關(guān)(P<0.05)，見表4。

表4 miR-26a、miR-26b表達水平與纖維化指標相關(guān)性

2.5老年白內(nèi)障易感的因素分析 將糖尿病(賦值：0=否，1=是)、吸煙史(賦值：0=否，1=是)、戶外陽光暴露時間，TC、FPG、FINS、HOMA-IR、miR-26a、miR-26b納入Logistic方程，向后逐步法排除無關(guān)變量，最終糖尿病是老年白內(nèi)障易感的危險因素(P<0.05)，miR-26a、miR-26b是保護因素(P<0.05)，見表5。校正糖尿病影響后，miR-26a(OR=0.436，95%CI：0.302～0.619)、miR-26b(OR=0.411，95%CI：0.295～0.603)仍與老年白內(nèi)障易感有關(guān)(P<0.05)。

表5 老年人發(fā)生白內(nèi)障的危險因素

2.6miR-26a、miR-26b診斷白內(nèi)障的價值分析 miR-26a、miR-26b、HA、Ⅳ-C、LN、PCⅢ診斷白內(nèi)障的最佳截斷值為2.31、2.65、261.35 μg/L、159.42 μg/L、96.08 μg/L、125.19 μg/L，曲線下面積為0.689、0.775、0.775、0.804、0.797、0.837，結(jié)合Logistic回歸模型分析聯(lián)合miR-26a、miR-26b診斷白內(nèi)障的曲線下面積為0.954，經(jīng)Delong test 檢驗聯(lián)合檢測高于單獨miR-26a、miR-26b、HA、Ⅳ-C、LN、PCⅢ(Z=7.101、5.298、6.235、5.135、0.598、0.435，P<0.05)，見表6和圖1。

表6 miR-26a、miR-26b診斷白內(nèi)障的效能

圖1 miR-26a、miR-26b診斷白內(nèi)障的ROC曲線

3 討 論

白內(nèi)障是一種常見的與年齡相關(guān)的疾病，由晶狀體渾濁引起。正常晶狀體是彈性、透明、雙凸的球形結(jié)構(gòu)，由上皮細胞和纖維細胞組成，晶狀體赤道部上皮細胞不斷向體內(nèi)延伸分化成纖維細胞，以維持晶狀體的透光性，實現(xiàn)光反射和光調(diào)節(jié)功能。晶狀體EMT可引起上皮細胞異常增殖遷移，導(dǎo)致上皮結(jié)構(gòu)完整性受損，散亂的間充質(zhì)樣細胞會積聚到晶狀體上皮細胞，分泌過多的纖連蛋白和膠原蛋白，導(dǎo)致結(jié)締組織積累和纖維化，最終喪失正常晶狀體結(jié)構(gòu)和功能，發(fā)生晶狀體渾濁[10]。miRNA是一組長度為22～25個核苷酸的非編碼RNA分子，可通過翻譯抑制或mRNA降解調(diào)節(jié)其靶標參與多種生物過程，已知miR-146a通過靶向Notch1抑制TGF-β誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細胞EMT過程[11]，miR-22-3p通過靶向組蛋白去乙?；?促進α-微管蛋白乙?；瘉矸乐咕铙w纖維化進展[12]，miR-30a-5p則可靶向SNAI1抑制晶狀體上皮細胞的EMT[13]。

miR-26家族包含兩個成熟的miRNA，分別是miR-26a和miR-26b，miR-26表達主要由缺氧狀態(tài)下缺氧誘導(dǎo)因子誘導(dǎo)，在細胞分化過程中也出現(xiàn)上調(diào)，miR-26靶基因參與細胞代謝、增殖、分化、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移，在多種不同類型腫瘤中表達異常，是一種癌癥潛在的有價值生物標志物和治療新靶點。有研究顯示，miR-26在肝癌[14]、乳腺癌[15]、腸道腫瘤[16]中發(fā)揮抑癌基因作用。在纖維化疾病中，miR-26家族也同樣具有重要作用，ZHANG等[17]報道顯示，miR-26a可直接抑制TGF-β2表達降低結(jié)締組織生長因子水平，阻止腎纖維化。WEI等[18]報道指出miR-26a通過分別靶向膠原蛋白Ⅰ和結(jié)締組織生長因子抑制心臟纖維化進程。miR-26a還可通過直接靶向Smad4、Smad3抑制TGF-β2誘導(dǎo)的特發(fā)性肺纖維化[19]。miR-26b通過靶向抑制Kelch樣ECH相關(guān)蛋白Ⅰ表達介導(dǎo)核因子紅細胞2相關(guān)因子2激活，減弱膠原蛋白Ⅰ和α平滑肌肌動蛋白表達，抑制異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心臟纖維化[20]。miR-26b還可通過抑制自噬減弱心肌細胞中胰島素樣生長因子-1表達水平，抑制心肌肥大[21]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，白內(nèi)障患者miR-26a、miR-26b表達水平均下調(diào)，且二者與晶狀體渾濁程度呈負相關(guān)，說明miR-26a、miR-26b可能參與了老年人白內(nèi)障發(fā)病和進展的過程。進一步相關(guān)性分析結(jié)果顯示，miR-26a、miR-26b表達均與TGF-β2、HA、Ⅳ-C、LN、PCⅢ水平呈負相關(guān)。TGF-βS是最顯著的促纖維化因子，TGF-β2是房水中TGF-βS的主要亞型，TGF-β2誘導(dǎo)的EMT在晶狀體纖維化中發(fā)揮關(guān)鍵作用[22]。HA是結(jié)締組織主要成分，主要由間質(zhì)細胞合成，LN由內(nèi)皮細胞合成，可介導(dǎo)細胞間黏連作用，在纖維化疾病中，HA、Ⅳ-C、LN、PCⅢ水平均明顯升高[23-24]。由此可見miR-26a、miR-26b可能通過調(diào)控晶狀體纖維化參與了老年人白內(nèi)障的發(fā)病過程。分析可能的機制為：miR-26b可作用于晶狀體上皮細胞中Smad4和選擇性環(huán)氧化酶2，上調(diào)E-鈣黏蛋白的表達水平，下調(diào)間充質(zhì)相關(guān)蛋白的表達水平，抑制晶狀體上皮細胞增殖遷移和EMT過程[25]，進而抑制晶狀體纖維化。Jagged-1/細胞表面跨膜蛋白(Notch)是纖維化關(guān)節(jié)信號通路，Jagged-1/Notch激活可誘導(dǎo)TGF-β2表達上調(diào)和EMT過程[26]。miR-26a、miR-26b可直接靶向Jagged-1/Notch信號傳導(dǎo)抑制TGF-β2的表達水平，逆轉(zhuǎn)EMT和纖維化進程，miR-26a、miR-26b還可抑制TGF-β2表達逆轉(zhuǎn)晶狀體纖維化進程[27]。

本研究ROC曲線分析結(jié)果顯示，miR-26a、miR-26b診斷白內(nèi)障死亡曲線下面積為0.689、0.775，說明二者均具有診斷白內(nèi)障的價值，聯(lián)合miR-26a、miR-26b及纖維化指標HA、Ⅳ-C、LN、PCⅢ指標后診斷效能明顯提高，miR-26a、miR-26b均低于閾值及HA、Ⅳ-C、LN、PCⅢ升高提示更高的白內(nèi)障患病風(fēng)險。

綜上所述，老年人白內(nèi)障患者血清miR-26a、miR-26b的表達水平均降低，miR-26a、miR-26b低表達可能是導(dǎo)致老年人發(fā)生白內(nèi)障的危險因素。miR-26a、miR-26b可能通過誘導(dǎo)晶狀體纖維化參與白內(nèi)障發(fā)病過程。miR-26a、miR-26b可作為白內(nèi)障診斷的輔助指標，有望成為白內(nèi)障未來治療的靶點。本研究局限性在于未檢測晶狀體中miR-26a、miR-26b的表達水平，晶狀體局部miR-26a、miR-26b的表達水平變化及其與晶狀體纖維化程度的關(guān)系尚無法驗證，仍需進一步納入手術(shù)治療的白內(nèi)障患者加以證實。