基于實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析水楊酸苯酚貼膏現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

劉曉強(qiáng) 蔣曉勤 潘璐艷

水楊酸苯酚貼膏又名雞眼膏，是治療雞眼的常用藥，其處方由水楊酸780 g、苯酚40 g及基質(zhì)適量制成1 000 g。其中水楊酸起抗真菌、止癢及溶解角質(zhì)作用，苯酚則為消毒防腐劑，起殺菌、止癢作用，常見(jiàn)不良反應(yīng)為皮膚刺激和腐蝕[1-2]?，F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)《國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)》（地方標(biāo)準(zhǔn)上升為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)）第十一冊(cè)WS-10001-（HD-0927）-2002，檢驗(yàn)項(xiàng)目包括性狀、鑒別（酚羥基化學(xué)反應(yīng)鑒別）、檢查（5片重）及含量測(cè)定（容量分析法測(cè)定水楊酸含量），而該片芯呈淡紅色至磚紅色，其含量測(cè)定項(xiàng)下供試品溶液呈淡紅色至紅色，而容量分析法以0.1 mol/L NaOH為滴定劑，酚酞為指示劑，滴定終點(diǎn)顏色變化為無(wú)色至粉紅色，滴定終點(diǎn)的判定明顯受到溶液顏色的影響。同時(shí)，因不同廠家供試品溶液顏色有差異，滴定終點(diǎn)受到影響也有差異，導(dǎo)致該含量分析方法準(zhǔn)確性也有差異。此外，該標(biāo)準(zhǔn)中未涉及該復(fù)方制劑中有效成分之一苯酚的鑒別及含量測(cè)定，導(dǎo)致無(wú)法判定其成品制劑中是否含有苯酚及含量。筆者擬采用自建高效液相色譜法（HPLC）對(duì)水楊酸苯酚貼膏中水楊酸及苯酚含量進(jìn)行檢測(cè)，并將實(shí)驗(yàn)結(jié)果簡(jiǎn)要匯報(bào)如下。

1 儀器、試劑與方法

1.1 儀器

島津LC-20AD高效液相色譜儀（含四元低壓泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、UV檢測(cè)器、色譜工作站，日本島津公司），島津LC-40D X3高效液相色譜儀（含四元高壓泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、PDA檢測(cè)器、色譜工作站，日本島津公司），賽默飛 UltiMate3000高效液相色譜儀（含三元低壓泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、UV檢測(cè)器、色譜工作站，美國(guó)賽默飛世爾科技公司），梅特勒XP205電子天平（瑞士Mettler Toledo），Milli-Q純水機(jī)（美國(guó)Merck）。

1.2 試劑與藥品

冰醋酸（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，20220610），純化水（實(shí)驗(yàn)室自制），苯酚（中國(guó)食品藥品檢定研究院，100509-202005，100%），水楊酸（中國(guó)食品藥品檢定研究院，100106-202106，99.8%），4-羥基間苯二甲酸（中國(guó)食品藥品檢定研究院，101150-201602），4-羥基苯甲酸（中國(guó)食品藥品檢定研究院，101149-202204），1,4-對(duì)苯醌（中國(guó)食品藥品檢定研究院，101197-201904）。水楊酸苯酚貼膏，生產(chǎn)企業(yè)A（12批次），生產(chǎn)企業(yè)B（21批次），生產(chǎn)企業(yè)C（7批次），生產(chǎn)企業(yè)D（7批次），生產(chǎn)企業(yè)E（7批次），生產(chǎn)企業(yè)F（3批次）。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件[3-5]色譜柱：C18（Shim-Nex CS C18，4.6×150 mm，5 μm），流動(dòng)相：甲醇-2%冰醋酸溶液（40∶60），柱溫：35 ℃，波長(zhǎng)：270 nm，流速：1.0 ml/min，進(jìn)樣量：10 μl。

1.3.2 溶液制備方法系統(tǒng)適用性溶液的制備：取4-羥基苯甲酸、4-羥基苯二甲酸、1,4-對(duì)苯醌、水楊酸、苯酚各適量，精密稱定，加流動(dòng)相溶解并定量稀釋成每毫升中分別約含4-羥基苯甲酸5 μg、4-羥基苯二甲酸2.5 μg、1,4-對(duì)苯醌5 μg、水楊酸5 mg與苯酚0.25 mg的混合溶液。

供試品溶液的制備：取本品20片，研細(xì)混勻，精密稱取2片量，置100 ml量瓶中，加乙醇適量，超聲使水楊酸及苯酚溶解，加乙醇稀釋至刻度，搖勻即得（苯酚供試品溶液）。精密量取上述溶液5 ml，置50 ml量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，搖勻即得（水楊酸供試品溶液）。

對(duì)照品溶液的制備：取水楊酸及苯酚各適量，精密稱定，加乙醇溶解并稀釋成每毫升中約含水楊酸0.312 mg、苯酚0.16 mg的溶液。

1.3.3 含量計(jì)算方法按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算供試品中的水楊酸及苯酚含量，按標(biāo)示量計(jì)算。

1.3.4 方法學(xué)驗(yàn)證內(nèi)容依據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版四部9101分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則項(xiàng)下要求，結(jié)合本方法應(yīng)用范圍（擬用于高效液相色譜鑒別、有關(guān)物質(zhì)檢查以及含量測(cè)定等），筆者擬進(jìn)行專屬性、精密度（對(duì)照品進(jìn)樣精密度、重復(fù)性、中間精密度）、準(zhǔn)確度、范圍及線性、耐用性（包括流速、流動(dòng)相比例、柱溫、儀器以及色譜柱等）等方法學(xué)考察項(xiàng)目[6-8]。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果

專屬性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明溶劑乙醇、空白基質(zhì)均未在苯酚峰及水楊酸峰處出峰，不干擾檢測(cè)；系統(tǒng)適用性溶液中1,4-對(duì)苯醌、4-羥基苯甲酸、苯酚、4-羥基間苯二甲酸以及水楊酸等各成分色譜峰依次出峰，峰形良好，且各峰間分離度符合規(guī)定。見(jiàn)圖1。苯酚供試品溶液、水楊酸供試品溶液中苯酚及水楊酸色譜峰保留時(shí)間、紫外吸收峰與對(duì)照品溶液一致。

精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：對(duì)照品進(jìn)樣精密度實(shí)驗(yàn)中苯酚和水楊酸峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）依次為0.03%和0.03%，重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中6份供試品苯酚和水楊酸含量的RSD依次為0.8%和0.4%，中間精密度實(shí)驗(yàn)中6份供試品苯酚和水楊酸含量的RSD依次為1.7%和0.8%。準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)中苯酚和水楊酸低、中、高濃度加樣回收率為99.5%～100.6%及99.9%～100.8%.

范圍及線性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明苯酚在0.08～0.24 mg/ml范圍內(nèi)，r=0.999 97，表明線性良好，水楊酸在0.156～0.468 mg/ml范圍內(nèi)，r=0.999 93，表明線性良好。耐用性實(shí)驗(yàn)中，流速依次調(diào)整為0.8 ml/min及1.2 ml/min，流動(dòng)相依次調(diào)整為甲醇-2%冰醋酸溶液（35∶65）及甲醇-2%冰醋酸溶液（45∶55），柱溫依次調(diào)整為30 ℃及40 ℃，高效液相色譜儀依次更換為島津LC-40D X3及賽默飛 UltiMate3000，依次采用Shim-pack VP-ODS C18（4.6×250 mm，5 μm）及XBridge C18（4.6×250 mm，5 μm）色譜柱時(shí)，系統(tǒng)適用性溶液中各色譜峰峰間分離度均滿足要求，對(duì)照品進(jìn)樣精密度符合要求。

綜上所述，該方法專屬性、精密度（對(duì)照品進(jìn)樣精密度、重復(fù)性、中間精密度）、準(zhǔn)確度、范圍及線性等方法學(xué)考察項(xiàng)目均符合規(guī)定。

2.2 含量測(cè)定結(jié)果

從圖2中可以看出6家生產(chǎn)企業(yè)的水楊酸苯酚貼膏中水楊酸含量（按標(biāo)示量計(jì)）均高于100%，在101%～109%之間，均落在限度（90%～110%）范圍內(nèi)。苯酚含量（按標(biāo)示量計(jì)）均低于10%，其中A、D、E、F 4家低于1%，均不在限度（90%～110%）范圍內(nèi)。見(jiàn)圖3。

圖2 水楊酸含量測(cè)定結(jié)果

圖3 苯酚含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 自擬方法

筆者基于對(duì)水楊酸苯酚貼膏質(zhì)量再評(píng)價(jià)的初衷建立并驗(yàn)證了水楊酸苯酚貼膏中水楊酸及苯酚的HPLC含量測(cè)定方法。筆者選擇以乙醇而非流動(dòng)相為溶解溶劑是出于水楊酸和苯酚的溶解度原因，查詢《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版二部水楊酸及苯酚各論項(xiàng)下，水楊酸在乙醇或乙醚中易溶，在沸水中溶解，在三氯甲烷中略溶，在水中微溶；苯酚在乙醇、三氯甲烷、乙醚、甘油、脂肪油或揮發(fā)油中易溶，在水中溶解，在液狀石蠟中略溶。水楊酸及苯酚在甲醇中溶解度均未知，且水楊酸苯酚貼膏現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中含量測(cè)定項(xiàng)下所用的溶解溶劑為中性稀乙醇，基于上述幾點(diǎn)因素，筆者最終選用乙醇為溶解溶劑。該方法驗(yàn)證過(guò)程參考了《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版四部9101分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則項(xiàng)下要求，因該方法主要用于含量測(cè)定，因此主要按含量測(cè)定項(xiàng)下要求進(jìn)行，依次驗(yàn)證了專屬性、精密度（對(duì)照品進(jìn)樣精密度、重復(fù)性、中間精密度）、準(zhǔn)確度、范圍及線性、耐用性等，所有驗(yàn)證項(xiàng)目均符合規(guī)定。同時(shí)，需指出，該方法也可用于該品種兩種主成分水楊酸及苯酚的高效液相色譜鑒別和有關(guān)物質(zhì)檢查。

3.2 原因分析

本制劑為復(fù)方制劑，此次涉及的所有生產(chǎn)企業(yè)的水楊酸苯酚貼膏中有效成分水楊酸含量符合規(guī)定而苯酚含量均不符合規(guī)定，基本可以排除投料原因。而苯酚屬于揮發(fā)性酚類物質(zhì)，其在室溫下即可揮發(fā)。因此，筆者考慮導(dǎo)致所有涉及批次苯酚含量均不合格的原因可能為處方及制劑工藝。筆者查詢了上述6家生產(chǎn)企業(yè)的水楊酸苯酚貼膏說(shuō)明書(shū)，將處方簡(jiǎn)要羅列如下：生產(chǎn)企業(yè)A，水楊酸、苯酚、凡士林、羊毛脂、石蠟、色素；生產(chǎn)企業(yè)B，水楊酸、苯酚、凡士林、羊毛脂、色素；生產(chǎn)企業(yè)C，水楊酸、苯酚、凡士林、石蠟、乙醇、色素；生產(chǎn)企業(yè)D，水楊酸、苯酚、凡士林、石蠟、乙醇、色素；生產(chǎn)企業(yè)E，水楊酸、苯酚、凡士林、石蠟、色素；生產(chǎn)企業(yè)F，水楊酸、苯酚、凡士林、羊毛脂、石蠟、色素；色素包括堿性玫瑰紅、胭脂紅等。上述基質(zhì)中凡士林、羊毛脂在室溫下呈半固態(tài)，石蠟呈固態(tài)。基于上述幾種物質(zhì)的特性，生產(chǎn)企業(yè)在工藝投料環(huán)節(jié)可采用加熱的工藝將上述物質(zhì)熔化以保證原輔料混合均勻。而苯酚屬于揮發(fā)性酚類物質(zhì)，在室溫下即可揮發(fā)，加熱則會(huì)加劇苯酚揮發(fā)，進(jìn)一步降低產(chǎn)品中苯酚含量。此外，市售產(chǎn)品中，部分廠家并未對(duì)該產(chǎn)品加用藥品包裝用復(fù)合膜袋，可導(dǎo)致產(chǎn)品中的苯酚在運(yùn)輸、儲(chǔ)藏過(guò)程中進(jìn)一步揮發(fā)，導(dǎo)致最終測(cè)得產(chǎn)品中苯酚含量極低。

3.3 思考與建議

基于上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，雖上述批次水楊酸苯酚貼膏按現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)均合格，但實(shí)際其已基本不含有效成分之一苯酚，因此按現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)無(wú)法有效控制該產(chǎn)品質(zhì)量[9]。因此基于嚴(yán)控已上市藥物質(zhì)量的角度出發(fā)，建議修訂現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，具體建議如下：1）增訂高效液相色譜鑒別項(xiàng)，規(guī)定供試品溶液中苯酚與水楊酸峰的保留時(shí)間應(yīng)與對(duì)照品溶液中相應(yīng)主峰的保留時(shí)間一致。2）增加微生物限度檢查項(xiàng)，規(guī)定取本品100 cm2，按《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版檢查，需氧菌總數(shù)不得超過(guò)102cfu/10 cm2，霉菌和酵母菌總數(shù)不得超過(guò)10 cfu/10 cm2，每10 cm2不得檢出金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌。3）修訂含量測(cè)定方法，將水楊酸含量測(cè)定方法由容量分析法改為HPLC，同時(shí)增加苯酚含量測(cè)定項(xiàng)（HPLC），并規(guī)定按標(biāo)示量計(jì)，苯酚和水楊酸含量均應(yīng)為90.0%～110.0%。

此外，筆者建議各生產(chǎn)企業(yè)進(jìn)一步優(yōu)化處方，上述處方分析中，多家企業(yè)處方中含有石蠟，石蠟在室溫下呈固態(tài)，雖有助于該制劑成品中片芯保持良好的性狀，但其溶解溫度較高，可能會(huì)導(dǎo)致原輔料混合階段苯酚大量揮發(fā)，建議少用或不用。有生產(chǎn)企業(yè)處方中含有乙醇，該輔料有助于將固態(tài)的水楊酸、苯酚及色素原料轉(zhuǎn)化為水楊酸、苯酚及色素溶液，減少原輔料混合階段加溫的溫度與時(shí)長(zhǎng)，可有效避免苯酚的揮發(fā)，建議其他生產(chǎn)企業(yè)參考或使用。同時(shí)建議各生產(chǎn)企業(yè)改進(jìn)生產(chǎn)工藝，盡可能采用低溫?cái)嚢韫に嚮蛭锢頂嚢韫に嚕M可能降低制劑工藝中苯酚的揮發(fā)量。此外，為減少儲(chǔ)存、運(yùn)輸過(guò)程中苯酚揮發(fā)量，建議在水楊酸苯酚貼膏外加藥品包裝用復(fù)合膜袋，同時(shí)在包裝盒外加用塑料復(fù)合膜。

綜上所述，本文所建立的水楊酸苯酚貼膏中水楊酸及苯酚的HPLC測(cè)定方法可用于水楊酸苯酚貼膏中水楊酸及苯酚的高效液相色譜鑒別、含量測(cè)定，上述HPLC也可進(jìn)一步用于該制劑的有關(guān)物質(zhì)檢查。同時(shí)，基于采用上述方法測(cè)定的含量結(jié)果，現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)已無(wú)法有效控制該產(chǎn)品質(zhì)量，建議更新標(biāo)準(zhǔn)。此外，建議各水楊酸苯酚貼膏生產(chǎn)企業(yè)致力于水楊酸苯酚貼膏的處方、制劑工藝以及包裝研究，以提高市場(chǎng)流通環(huán)節(jié)中水楊酸苯酚貼膏中苯酚含量，保障廣大患者用藥安全。