急性胰腺炎患者血清miR-181a-5p表達(dá)及與Th17/Treg免疫平衡的關(guān)系

張 瑜， 辛前有， 馮亞飛， 郭 偉

(1.山西省長(zhǎng)治市北大醫(yī)療潞安醫(yī)院普通外科， 山西 長(zhǎng)治 046200 2.長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院附屬和濟(jì)醫(yī)院胃腸外科， 山西 長(zhǎng)治 046011)

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是常見(jiàn)的消化系統(tǒng)急癥，其病情進(jìn)展迅速，極易引發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征，導(dǎo)致多器官功能障礙或衰竭，致殘致死率高[1]。近年來(lái)隨著人口老齡化進(jìn)展和生活水平的提高，AP發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，盡管近年來(lái)針對(duì)AP的診治已取得較大進(jìn)展，但AP特別是重癥AP仍未得到控制，預(yù)后仍然較差[2]。因此研究AP發(fā)生發(fā)展機(jī)制是目前研究熱點(diǎn)。炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)參與AP發(fā)生發(fā)展[3]。研究表明，輔助性T細(xì)胞17/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(T helper cell 17/T regulatory cell，Th17/Treg)免疫失衡在AP炎癥反應(yīng)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[4]。近年越來(lái)越多研究表明，微小RNA(microRNA，miRNA)參與AP發(fā)生發(fā)展[5]。miR-181a-5p是新近發(fā)現(xiàn)的miRNA家族成員，有研究通過(guò)分析AP患者循環(huán)中miRNA表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)，miR-181a-5p在AP患者血清中表達(dá)顯著下調(diào)[6]。然而關(guān)于miR-181a-5p在AP患者血清中的表達(dá)和功能尚不清楚，本研究就通過(guò)檢測(cè)AP患者血清miR-181a-5p表達(dá)，分析其與Th17/Treg免疫平衡的關(guān)系，以期為AP防治提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料:選取2020年1月至2021年12月我院收治的110例AP患者為AP組，其中男62例，女48例；年齡27～74(46.65±5.88)歲；體質(zhì)指數(shù)18.25～30.65(23.54±1.68)kg/m2；病因：膽源性54例、酒精性25例、高甘油三酯血癥性18例、病因不明13例。另選取同期58名體檢健康者為對(duì)照組，其中男30例，女28例；年齡24～71(45.87±5.17)歲；體質(zhì)指數(shù)18.77～26.32(22.87±1.18)kg/m2；兩組一般資料比較無(wú)差異(P>0.05)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①AP符合《急性胰腺炎基層診療指南(實(shí)踐版·2019)》[7]診斷標(biāo)準(zhǔn)；②發(fā)病至入院時(shí)間<48h；③年齡≥18歲；④患者或家屬知情并簽署同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①慢性胰腺炎急性發(fā)作、外傷性胰腺炎；②妊娠及哺乳期婦女；③合并嚴(yán)重心肝腎和造血系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)損害、惡性腫瘤；④近3個(gè)月內(nèi)使用免疫抑制劑和激素。本研究經(jīng)符合赫爾辛基宣言。

1.2方 法

1.2.1外周血Th17、Treg和相關(guān)因子檢測(cè) 收集AP組入院次日清晨和對(duì)照組體檢時(shí)4mL外周靜脈血，分置2管(各2mL)，其中1管3000r/min離心15min(半徑10cm)后取上層血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)Th17相關(guān)因子[白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、IL-17]和Treg相關(guān)因子[IL-10、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)]，試劑盒均購(gòu)自武漢巴菲爾生物技術(shù)服務(wù)有限公司(編號(hào)：E-EL-H0102c、E-EL-H0105c、E-EL-H0103c、E-EL-H0110c)。另1管肝素鈉抗凝后，密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，于RPMI 1640培養(yǎng)基中調(diào)整密度為1×106個(gè)/mL。用佛波肉豆蔻醋酸、離子霉素、布雷菲德菌素A處理細(xì)胞后，于37℃黑暗環(huán)境中孵育5h，獲取刺激細(xì)胞重懸于PBS中，加入相應(yīng)抗體后采用賽默飛Attune NxT流式細(xì)胞儀通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th17、Treg百分比，并計(jì)算Th17/Treg比值。

1.2.2血清miR-181a-5p表達(dá)檢測(cè):收集AP組入院次日清晨和對(duì)照組體檢時(shí)3mL靜脈血，3000r/min離心15min(半徑10cm)后取上層血清，Trizol法提取血清總RNA，反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，以cDNA為模板，按照SYBR Premix Ex Taq試劑盒(上海赫果生物科技有限公司，編號(hào)：DRR820A)進(jìn)行PCR擴(kuò)增：miR-181a-5p正向引物：5′-AAGATGAGGGTGTTTACG-3′，反向引物：5′-AAGCCTTCTGCCTTAGTT-3′；miR-181a-5p內(nèi)參U6正向引物：5′-GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3′，反向引物：5′-TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC-3′。反應(yīng)條件：95℃ 90s，95℃ 30s，63℃ 30s，72℃ 15s，循環(huán)40次后收集Ct值，采用2-ΔΔCT法計(jì)算血清miR-181a-5p表達(dá)。

1.3AP嚴(yán)重程度分組:AP患者入院后48h參考《急性胰腺炎基層診療指南(實(shí)踐版·2019)》[7]評(píng)估AP嚴(yán)重程度，根據(jù)病情嚴(yán)重程度分為輕癥AP組(無(wú)并發(fā)癥和器官功能衰竭)41例、中度重癥AP組(有局部或全身并發(fā)癥，可伴有持續(xù)時(shí)間<48h的器官功能衰竭)37例、重癥AP組(伴有持續(xù)時(shí)間>48h的器官功能衰竭)32例。

2 結(jié) 果

2.1AP組與對(duì)照組miR-181a-5p、Th17、Treg比較:與對(duì)照組比較，AP組血清miR-181a-5p表達(dá)和外周血Treg百分比降低，Th17百分比和Th17/Treg升高(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 AP組與對(duì)照組miR-181a-5p Th17 Treg比較

2.2AP組與對(duì)照組Th17、Treg相關(guān)因子表達(dá)水平比較:與對(duì)照組比較，AP組外周血IL-6、IL-17水平升高，IL-10、TGF-β1水平降低(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 AP組與對(duì)照組Th17 Treg相關(guān)因子表達(dá)水平比較

2.3不同嚴(yán)重程度AP患者血清miR-181a-5p表達(dá)和外周血Th17、Treg百分比比較:輕癥、中度重癥、重癥AP組血清miR-181a-5p表達(dá)和外周血Treg百分比依次降低，外周血Th17百分比和Th17/Treg依次升高(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 不同嚴(yán)重程度AP患者血清miR-181a-5p表達(dá)和外周血Th17 Treg百分比比較[M(P25,P75)]

2.4不同嚴(yán)重程度AP患者Th17、Treg相關(guān)因子和Th17/Treg比較：輕癥、中度重癥、重癥AP組外周血IL-6、IL-17水平依次升高，IL-10、TGF-β1水平依次降低(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 不同嚴(yán)重程度AP患者Th17 Treg相關(guān)因子和Th17/Treg比較

2.5AP患者血清miR-181a-5p表達(dá)與Th17/Treg的相關(guān)性 Pearson/Spearman相關(guān)性分析顯示，AP患者血清miR-181a-5p表達(dá)與IL-6、IL-17、Th17、Th17/Treg呈負(fù)相關(guān)，與IL-10、TGF-β1、Treg呈正相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 AP患者血清miR-181a-5p表達(dá)與Th17/Treg的相關(guān)性

3 討 論

AP是多種病因引起胰腺分泌的胰酶在胰腺內(nèi)異常激活，對(duì)胰腺和周圍器官產(chǎn)生消化作用而引起的以胰腺局部炎癥反應(yīng)為主要特征的急腹癥，盡管臨床中80%～85%的AP為輕癥，但仍有20%的患者可發(fā)展為中度重癥甚至重癥，重癥AP常累及肺臟、肝臟、腎臟、心臟等全身多個(gè)器官，病死率高達(dá)30%～50%[8]。探索AP發(fā)生發(fā)展機(jī)制有助于早期診斷和提升治療效果。目前尚不完全明確AP發(fā)病機(jī)制，但胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)炎癥信號(hào)通路的持續(xù)活化引起腺泡細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞、凋亡和壞死在AP發(fā)病中扮演重要角色，而隨著病情進(jìn)展炎癥又可累及全身多個(gè)器官，導(dǎo)致組織結(jié)構(gòu)及功能損害[3]。

目前研究認(rèn)為，Th17/Treg免疫失衡在AP發(fā)生發(fā)展中占據(jù)主導(dǎo)地位，二者均由Th0細(xì)胞分化而來(lái)，其中Th17細(xì)胞能通過(guò)分泌IL-6、IL-17等細(xì)胞因子放大炎癥，而Treg細(xì)胞能通過(guò)分泌IL-10、TGF-β1等細(xì)胞因子抑制Th17介導(dǎo)的炎癥，生理狀態(tài)下Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞數(shù)量恒定能維持Th17/Treg免疫平衡，當(dāng)Th17/Treg免疫失衡則會(huì)促發(fā)炎癥反應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)AP發(fā)生發(fā)展[9]。本研究結(jié)果顯示，AP患者外周血IL-6、IL-17、Th17百分比、Th17/Treg升高，而IL-10、TGF-β1、Treg百分比降低，說(shuō)明AP患者Th0細(xì)胞明顯向Th17細(xì)胞分化，Th17/Treg免疫明顯失衡。同時(shí)結(jié)果顯示，AP患者外周血IL-6、IL-17、Th17百分比、Th17/Treg隨著病情加重而升高，IL-10、TGF-β1、Treg百分比隨著病情加重而降低，進(jìn)一步說(shuō)明Th17/Treg免疫失衡參與AP發(fā)生發(fā)展，符合既往研究報(bào)道[9]。 目前Th17/Treg免疫平衡成為了AP的研究熱點(diǎn)，但關(guān)于AP患者Th17/Treg免疫平衡相關(guān)的生物標(biāo)志物報(bào)道較少。近年來(lái)隨著表觀遺傳學(xué)的深入，研究證實(shí)表觀遺傳學(xué)參與AP發(fā)生發(fā)展[10]。miRNA是一個(gè)新的表觀遺傳學(xué)中一類新的調(diào)控因子，能通過(guò)mRNA的3'-非翻譯區(qū)結(jié)合而降解或抑制其翻譯而調(diào)控基因表達(dá)，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡、炎癥等多種生物學(xué)功能，在AP發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。miR-181a-5p是一種高度保守miRNA，定位于人1號(hào)染色體前臂32.1處，近年研究發(fā)現(xiàn)miR-181a-5p是一個(gè)與炎癥反應(yīng)高度相關(guān)的miRNA，如miR-181a-5p能靶向抑制高遷移率族蛋白B1緩解神經(jīng)炎癥，能靶向抑制亮氨酸豐富重復(fù)FLII相互作用蛋白1抑制腎小球系膜細(xì)胞炎癥反應(yīng)[11]。巨噬細(xì)胞M1極化是引發(fā)AP炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵因素，有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-181a-5p能靶向抑制高遷移率族蛋白B1抑制AP小鼠巨噬細(xì)胞M1極化[12]。這些發(fā)現(xiàn)支持我們推測(cè)miR-181a-5p參與AP的假設(shè)。本研究結(jié)果顯示，AP患者血清miR-181a-5p表達(dá)顯著降低，且隨著病情加重而降低，提示血清miR-181a-5p低表達(dá)可能參與AP發(fā)生發(fā)展，符合既往研究報(bào)道[6]。近期趙萌等[13]臨床研究報(bào)道，原發(fā)免疫性血小板減少癥患者外周血miR-181a-5p低表達(dá)與Th17/Treg免疫失衡有關(guān)。上述研究提示miR-181a-5p低表達(dá)與Th17/Treg免疫失衡密切相關(guān)，是否與AP中Th17/Treg免疫失衡有關(guān)？本研究結(jié)果顯示，AP患者血清miR-181a-5p表達(dá)與IL-6、IL-17、Th17、Th17/Treg呈負(fù)相關(guān)，與IL-10、TGF-β1、Treg呈正相關(guān)，提示miR-181a-5p低表達(dá)可能通過(guò)Th17/Treg免疫失衡參與AP發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，AP患者血清miR-181a-5p表達(dá)降低、Th17/Treg免疫失衡，miR-181a-5p可能通過(guò)Th17/Treg免疫失衡參與AP發(fā)生發(fā)展。但本研究?jī)H從血清方面研究了miR-181a-5p與AP患者Th17/Treg免疫平衡的關(guān)系，還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。