MicroRNA-122-5P通過靶向MMP-9抑制TPA誘導(dǎo)的SW480細胞侵襲遷移能力

張麗君， 石 皓， 姜卓言， 謝海娟， 王 林， 俞紅女

(1.大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院， 遼寧 大連 116021 2.山東省曹縣市人民醫(yī)院腫瘤科， 山東 曹縣 274400)

結(jié)直腸癌(Colorectal cancer，CRC)是中國第五位常見惡性腫瘤，其病死率排惡性腫瘤第二[1]，40%～50%的結(jié)直腸癌患者死于遠處轉(zhuǎn)移[2]。而侵襲是轉(zhuǎn)移形成最重要的一步，MMP-9是最復(fù)雜的基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metal proteinases，MMPs)之一，可促進侵襲其他組織從而引起轉(zhuǎn)移[3]，因此抑制MMP-9的表達和/或調(diào)節(jié)上游活性可能是一種潛在的治療策略。有研究發(fā)現(xiàn)佛波酯(TPA)身為一種腫瘤促進劑，可誘導(dǎo)多種腫瘤MMP-9激活和侵襲遷移的發(fā)生[4,5]。近年來發(fā)現(xiàn)微小RNA(microRNA，miRNA)可以通過與靶基因3'非編碼區(qū)互補結(jié)合抑制癌基因或作為腫瘤啟動子進而參與癌癥過程[6,7]。同時可作為重要的生物調(diào)節(jié)因子，調(diào)節(jié)細胞增殖，凋亡，癌癥進展和腫瘤發(fā)生[8]。利用生物信息學(xué)分析顯示MMP-9在結(jié)直腸癌中高表達，并且與miR-122-5p存在連接位點。但目前關(guān)于 miR-122-5p 在結(jié)直腸癌中的研究仍然很少，因此本實驗旨在探究miR-122-5p能否靶向MMP-9逆轉(zhuǎn)TPA引起的結(jié)直腸癌腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移，并分析其潛在的作用方式。

1 材料與方法

1.1實驗材料:人結(jié)直腸癌SW480細胞購買于中科院；胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基分別購于上海生工BBI公司和美國Gibco公司； qPCR所用Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒Ⅱ和SYBR Green預(yù)混型qPCR試劑盒購自艾科瑞生物工程有限公司；轉(zhuǎn)染所用GP-transfect-Mate轉(zhuǎn)染試劑和RNA oligo試劑購自蘇州吉瑪基因；免疫印跡法所需細胞裂解液和山羊抗兔IgG抗體購自美國Thermo Fisher Scientific 公司、MMP-9抗體購自Santa Cruz 公司、GAPDH抗體購自Bioworld 公司、ECL發(fā)光試劑購自生工生物工程(上海)股份有限公司；明膠酶譜實驗所使用酶譜顯色緩沖液購自北京天恩澤基因科技有限公司；Transwell實驗所需Matrigel基底膠和0.1%結(jié)晶紫染色液均購自北京索萊寶科技有限公司、Transwell小室購自美國 Corning 公司；實驗用藥佛波酯TPA購自美國 Sigma 公司。

1.2生物信息學(xué)分析:通過GEO2R(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)數(shù)據(jù)庫篩選結(jié)直腸癌差異表達基因，利用GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php)數(shù)據(jù)庫驗證差異基因在結(jié)直腸癌患者較正常的表達情況，根據(jù)差異基因結(jié)合miRWalk (http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/) 數(shù)據(jù)庫預(yù)測靶向miRNA,最后通過TargetScan (https://www.targetscan.org/vert_71/) 數(shù)據(jù)庫預(yù)測結(jié)合位點。

1.3實驗方法

1.3.1細胞培養(yǎng):人結(jié)直腸癌SW480細胞培養(yǎng)在90%DMEM和10%FBS配置成的完全培養(yǎng)基，放于37℃、體積分數(shù)為5%CO2細胞培養(yǎng)箱中，以1∶3進行傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的SW480細胞接種于六孔板中，待細胞貼壁后用TPA(100nM)處理不同時間(0，6，12，24h)，通過RT-qPCR和Western blot法檢測TPA對SW480細胞MMP-9表達的影響。細胞生長至60%～80%時利用GP-transfect-Mate對SW480細胞進行轉(zhuǎn)染,分組如下：陰性對照NC組、NC+TPA組、轉(zhuǎn)染miR-122-5p minics(minic組)和minic+TPA組。細胞轉(zhuǎn)染后用含有TPA(100nM)的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3.2RT-qPCR 檢測細胞MMP-9與miR-122-5p表達水平：采用Trizol法從處理好的SW480細胞提取總RNA，進一步使用Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒Ⅱ進行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，保存于-20℃。PCR擴增時對cDNA稀釋5倍使用，根據(jù)SYBR Green預(yù)混型qPCR試劑盒說明書添加熒光，使用引物序列見表1。

表1 qPCR引物序列

1.3.3miRNA minics 轉(zhuǎn)染：將處于對數(shù)生長期的SW480細胞進行鋪板(ρ=1.7×105/孔)，培養(yǎng)18h細胞密度達到60%～80%時，按照GP-transfect-Mate轉(zhuǎn)染試劑和RNA oligo試劑說明書要求進行轉(zhuǎn)染。置于培養(yǎng)箱中，4～6h將細胞液換成含10%FBS新鮮完全培養(yǎng)基，24h檢測mRNA表達或檢測蛋白表達。轉(zhuǎn)染RNA oligo合成序列見表2。

表2 轉(zhuǎn)染RNA oligo 合成序列

1.3.4免疫蛋白印跡試驗：收集所需細胞用配置好的細胞裂解液進行裂解提取蛋白，采用BCA法繪制標準曲線和實現(xiàn)蛋白定量，在保證濃度一致的前提下調(diào)整各個樣品的體積進行蛋白變性制樣，于-80℃保存。分別配制使用了濃度10%與12%的分離膠與濃縮膠，上樣后按照電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、洗膜、孵育MMP-9抗體和GAPDH抗體4℃過夜、洗膜后室溫孵育山羊抗兔IgG抗體,最后用ECL發(fā)光試劑進行顯影，結(jié)果圖像使用ImageJ軟件分析和計算灰度值。

1.3.5明膠酶譜實驗:將處理后的細胞收集并完成制樣，配制濃度10%分離膠與濃縮膠，凝固每孔上樣15ul，以60v，30min轉(zhuǎn)100v，60min完成電泳后，依據(jù)酶譜顯色緩沖液說明書孵育過夜，0.05%R-250考馬斯亮藍染色液染色，最后使用UVP凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照，ImageJ軟件進行灰度值計算。

1.3.6Transwell 實驗檢測細胞侵襲和遷移:進行遷移實驗時直接將細胞懸液(ρ=2×105個/小室)放到小室；進行侵襲實驗時取30μL Matrigel基底膠稀釋液均勻鋪滿Transwell小室，置于培養(yǎng)箱2h后更換培養(yǎng)基，將細胞懸液(ρ=3×105個/小室)加到小室。根據(jù)實驗設(shè)計給需要佛波酯TPA處理的組別在上下室加入TPA，使終濃度為100nM。24h后5%多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色液染色，在倒置顯微鏡下觀察與拍照，最后使用ImageJ軟件計數(shù)穿膜細胞數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1生物信息學(xué)分析MMP-9在結(jié)直腸癌組織中的表達情況：通過GEO2R數(shù)據(jù)庫找到結(jié)直腸癌相關(guān)數(shù)據(jù)集(GSE77199、GSE141174、SGE38026)，以P<0.05，LogFC>1.0為篩選條件，進行數(shù)據(jù)合集(如圖1A)，得到差異表達基因4個(MMP-9、PDGFRB、TGM2、UBD)。借助TCGA數(shù)據(jù)庫初步篩查發(fā)現(xiàn)MMP-9在結(jié)直腸癌組織中較正常高表達(*P<0.05)，如(圖1B)。

圖1 生物信息學(xué)分析MMP-9在結(jié)腸癌組織中的表達A：結(jié)直腸癌差異表達Veen圖；B： MMP-9在結(jié)直腸癌中高表達注：與正常組織(N)相比，*P<0.05

2.2生物信息學(xué)篩選MMP-9的靶基因miRNA：通過GEO2R篩選結(jié)直腸癌差異表達miRNA，選取數(shù)據(jù)集GSE85589、GSE125904差異表達miRNA，按照條件(P<0.05,logFC >1.0)進行篩選。同時，借助靶點預(yù)測數(shù)據(jù)庫miRWalk得到MMP-9存在連接位點(score=1.0)的miRNAs進行合集得到其靶基因為has-miR-122-5p(如圖2A)。隨后，通過Targetscan數(shù)據(jù)庫預(yù)測兩者的連接位點(如圖2B)所示。

圖2 生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫預(yù)測MMP-9靶基因miRNAA：結(jié)直腸癌差異表達miRNA Veen圖; B： miR-122-5p 和 MMP-9 mRNA 3'-UTR 的結(jié)合位點

2.3TPA 對結(jié)直腸癌SW480 細胞MMP-9 表達的影響：TPA(100nmoL /L)處理 SW480 細胞不同時間(0，6，12，24h)，利用RT-PCR 法檢測細胞中 MMP-9 mRNA的表達水平，結(jié)果(如圖 3)所示，TPA 誘導(dǎo) SW480 細胞 MMP-9mRNA表達顯著上調(diào)，呈時間依賴性，24h 時增加最為明顯(** P<0.01)。

圖3 MMP-9 mRNA的相對表達注：與0h相比，** P<0.01

2.4TPA 對結(jié)直腸癌SW480 細胞miR-122-5p 表達的影響：觀察TPA(100nM) 誘導(dǎo) MMP-9 表達上調(diào)過程中對miR-122-5p 表達的影響，結(jié)果(如圖4)所示,與空白對照組相比較，TPA 處理組 miR-122-5p 表達水平明顯降低(** P<0.01)。

圖4 TPA影響SW480細胞miR-122-5p的表達注：與Control組相比，** P<0.01

2.5MiR-122-5p 對SW480 細胞MMP-9 表達的影響

2.5.1過表達 miR-122-5p 的細胞模型建立 ：觀察miR-122-5p 在結(jié)直腸癌SW480 中的生物效應(yīng)，將miR-122-5p minic 及NC 在SW480 細胞中進行轉(zhuǎn)染，結(jié)果(如圖 5)所示，Control 組與 NC 組間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。miR-122-5p minic 在結(jié)直腸癌 SW480 細胞中轉(zhuǎn)染成功(**P<0.01)。

圖5 SW480細胞轉(zhuǎn)染 miR-122-5p minic 后 miR-122-5p 表達水平：與Control組相比，** P<0.01

2.5.2MiR-122-5p 對 TPA 誘導(dǎo) SW480 細胞 MMP-9 表達及分泌的作用 ：利用 RT-qPCR 和 Western blot進一步觀察 miR-122-5p 對 MMP-9 的調(diào)控作用，結(jié)果(如圖 6)所示，與 NC 組相比，NC+TPA 組MMP-9表達顯著上調(diào)(**P<0.01)；與 NC+TPA 組相比,過表達 miR-122-5p 的 minic+TPA 組 MMP-9 表達明顯下降(# P<0.05,##P<0.01)；明膠酶譜法結(jié)果顯示過表達 miR-122-5p明顯抑制 TPA 誘導(dǎo)的 MMP-9 分泌。

圖6 MiR-122-5p 影響 TPA 誘導(dǎo) SW480 細胞 MMP-9 的表達A：MMP-9 mRNA 表達水平；B： MMP-9 蛋白表達情況及定量柱狀圖注：與NC組相比，** P<0.01；與NC+TPA組相比，A:# P<0.05，B:## P<0.01

2.6MiR-122-5p 對TPA 誘導(dǎo)SW480 細胞侵襲和遷移能力的影響：采用 Transwell檢測NC組、NC+TPA組、minic+TPA組和minic組細胞穿膜細胞數(shù)目，觀察細胞的侵襲與遷移能力，結(jié)果(如圖7-8)所示，與NC 組相比，NC+TPA 組侵襲和遷移細胞數(shù)目均顯著增多(**P<0.01)；與 NC+TPA 組相比，過表達miR-122-5p 的 minic+TPA 組細胞侵襲和遷移數(shù)目明顯減少(## P<0.01)。。

圖7 各組 SW480 細胞侵襲能力及其定量分析(×200)

圖8 各組 SW480 細胞遷移能力及其定量分析(×200)注：與NC 組相比，(** P<0.01)；與 NC+TPA 組相比，(## P<0.01)

3 討 論

結(jié)直腸癌為最常見癌癥之一，研究顯示，腫瘤轉(zhuǎn)移仍然是致死的主因，因此抑制癌細胞侵襲和遷移的研究具有重要意義。MMP-9 是研究最廣泛的 MMP 之一，主要由腫瘤細胞和基質(zhì)細胞分泌，激活的 MMP-9影響 BMs 阻礙腫瘤細胞運動的能力，因此在腫瘤發(fā)展過程中，基底膜的破壞是支持腫瘤侵襲和遷移的重要步驟[9]。目前文獻研究顯示，MMP-9 在不同惡性腫瘤中均有過表達，并且被證明與包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的腫瘤的進展和侵襲有關(guān)[10]。因此，抑制 MMP-9 的過表達是防治腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的重要策略。據(jù)報道，許多刺激因子，如腫瘤壞死因子-α、成纖維細胞生長因子-2 和 TPA 均可誘導(dǎo)MMP-9 過表達[11]。佛波酯(TPA)是從巴豆油中分離出一個經(jīng)典的腫瘤促進劑，被認為是 PKC 依賴的多種信號通路的有效誘導(dǎo)劑，即 PKC 激活劑。蛋白激酶 C(PKC)被稱為第二種信使依賴性蛋白激酶，在調(diào)節(jié)各種細胞應(yīng)答中起關(guān)鍵作用，也是促腫瘤的佛波酯的受體蛋白[12]。PKC 的激活參與了癌細胞增殖、侵襲、凋亡、耐藥性和遺傳不穩(wěn)定等的發(fā)生發(fā)展[13]。基于以上研究推測PKC激動劑TPA可通過誘導(dǎo)MMP-9表達，增強腫瘤轉(zhuǎn)移能力。因此，本研究首先通過生物信息學(xué)分析結(jié)直腸癌組織中 MMP-9的表達，發(fā)現(xiàn)MMP-9 在結(jié)直腸癌中同樣存在過表達的現(xiàn)象，與文獻報道相符。同時，一系列實驗表明TPA 可以誘導(dǎo) SW480 細胞 MMP-9 過表達與分泌，進而有助于腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移的發(fā)生。

大量研究表明，MicroRNA 在多種人類惡性腫瘤中均處于表達失調(diào)狀態(tài)，并可調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移等過程[14]。其中，miR-122-5p 表達失調(diào)可以影響多種類型癌癥的 EMT、侵襲、轉(zhuǎn)移、增殖或凋亡等癌癥進展相關(guān)過程。同時，本研究實驗也利用生物信息學(xué)分析以及相應(yīng)實驗證實miR-122-5p靶向調(diào)控MMP-9 的表達進而抑制SW480細胞的遷移侵襲能力。

綜上所述，在結(jié)直腸癌中，miR-122-5p能夠靶向調(diào)控MMP-9的表達，從而抑制TPA通過激活PKC誘導(dǎo)細胞侵襲遷移的能力。但是，miR-122-5p是否可以作為臨床診斷預(yù)后的標志物，以及TPA相關(guān)抑制劑能否用于改善預(yù)后還需進行深入研究。