紅花黃色素調(diào)節(jié)NF-κB/NLRP3信號(hào)通路對(duì)心肌梗死大鼠心肌細(xì)胞焦亡和炎性損傷的影響

趙 雯， 張 勇， 張 波， 安 笑， 陳瑞敏， 任 超

(解放軍第九六〇醫(yī)院， 山東 濟(jì)南 250031)

心肌梗死(myocardial infarction，MI)是國(guó)內(nèi)外發(fā)病率和死亡率最高的心腦血管系統(tǒng)疾病之一，其發(fā)病時(shí)，導(dǎo)致細(xì)胞壞死和組織損傷的心肌缺血是心源性猝死的原因之一[1]。臨床上雖已采用ACEⅠ、ARB及β受體阻滯劑等藥物來(lái)穩(wěn)定或改善MI患者的心功能障礙，但其預(yù)后仍不理想，且長(zhǎng)期應(yīng)用帶來(lái)的耐藥性和不良反應(yīng)也為臨床應(yīng)用帶來(lái)挑戰(zhàn)。因此，尋找藥物減輕MI心肌細(xì)胞焦亡和炎性損傷具有重要意義。紅花黃色素(Carthamin yellow，CY)是從菊科植物紅花花瓣中提取而得，是一種可溶性查爾酮混合物，包括羥基CY A、CY A、CY B、槲皮素、山奈酚等。其中含量最高的是羥基SY A ，是主要的有效成分[2]。因羥基SY A需要對(duì)CY進(jìn)行進(jìn)一步分離、提純、純化等過程，且提取的單體易受到光照、溫度而影響穩(wěn)定性，本實(shí)驗(yàn)采用混合物CY作為研究對(duì)象。研究發(fā)現(xiàn)CY具有抑制血栓形成、抗心肌缺血、降血脂、抗氧化等藥理作用[3]。劉廣雁等[4]發(fā)現(xiàn)CY對(duì)心肌細(xì)胞H9C2具有保護(hù)作用。目前關(guān)于CY發(fā)揮生物學(xué)功能的機(jī)制尚不明確，對(duì)MI大鼠的心肌細(xì)胞焦亡與炎性損傷存在的影響值得研究和探討。研究表明NF-κB/NLRP3信號(hào)通路與細(xì)胞焦亡與炎癥反應(yīng)相關(guān)，其過度激活可能導(dǎo)致炎癥性疾病的發(fā)生[5]，但在MI中的作用及其機(jī)制尚不清楚。本研究通過結(jié)扎左前降支法建立MI大鼠模型，給予CY干預(yù)，并予以腹腔注射NLRP3激活劑LPS，觀察CY對(duì)MI大鼠心肌細(xì)胞焦亡和炎性損傷的影響，及NF-κB/NLRP3信號(hào)通路在其中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:SPF級(jí)SD大鼠72只，雄性，250g～280g，購(gòu)自博濟(jì)醫(yī)藥科技股份有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK(粵)：2022-0279。實(shí)驗(yàn)前飼養(yǎng)于采光良好、通風(fēng)的實(shí)驗(yàn)室，溫度(22±1)℃，相對(duì)濕度40%～60%，自由飲水、進(jìn)食。適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后開始實(shí)驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)已得到本院的動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2主要試劑:紅花黃色素(CY)購(gòu)自于廣州威佳科技有限公司；戊巴比妥鈉購(gòu)自于Sigma公司；注射用青霉素鈉購(gòu)自瑞陽(yáng)制藥有限公司；2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)購(gòu)自于北京索萊寶科技有限公司；伊文思藍(lán)(EB)購(gòu)自上海生工生物公司；NF-κB激活劑LPS購(gòu)自于美國(guó)Peprotech公司；NLRP3、NF-κB、GSDMD-N、cleaved-caspase1、β-actin抗體及其二抗購(gòu)自于Abcam公司；大鼠LDH、IL-1β、IL-18檢測(cè)試劑盒購(gòu)自于上海生工生物公司；RIPA裂解液購(gòu)自于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3MI大鼠模型的建立:參考文獻(xiàn)[6]方法，隨機(jī)選取60只大鼠通過冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎法建立大鼠MI模型。通過腹腔注射新鮮制備的2%戊巴比妥鈉(10mL/kg)來(lái)麻醉大鼠。將大鼠固定于仰臥位置，行氣管插管，并連接呼吸機(jī)，同時(shí)進(jìn)行大鼠心電圖監(jiān)測(cè)。于胸骨左側(cè)3～4個(gè)肋骨間以20～30度的角做一個(gè)1cm長(zhǎng)的縱行切口，將胸肌逐層分離后，在大鼠胸部第3-4個(gè)肋骨間隙最寬處用眼瞼器固定，暴露心臟。隨后迅速在大鼠平左心耳底部用6-0號(hào)線結(jié)扎左前降支近端。最后關(guān)閉胸腔，縫合肌肉層，排除胸腔內(nèi)空氣，手術(shù)部位用注射用青霉素鈉浸潤(rùn)，縫合皮膚。當(dāng)觀察到手術(shù)過程中結(jié)扎區(qū)周圍心肌組織發(fā)白，心電圖J點(diǎn)位置抬高時(shí)，說(shuō)明MI大鼠模型建立成功。共造模成功48只大鼠，隨機(jī)分為4組，分別是MI模型組(Model組)、低劑量CY組(CY-L組，20mg/kg)、高劑量CY組(CY-H組，40mg/kg)和高劑量CY+NF-κB激活劑組(CY-H+LPS組，CY 40mg/kg+LPS 10mg/kg[7])，每組12只。另取12只大鼠作為對(duì)照組(Control組)，12只大鼠作為假手術(shù)組(Sham組)。Control組只進(jìn)行麻醉操作，Sham組麻醉后開胸腔暴露心臟，只穿線不結(jié)扎。手術(shù)后灌胃給藥，CY-L組腹腔注射CY 20mg/kg，CY-H組腹腔注射CY 40mg/kg，CY-H+LPS組注射CY 40mg/kg和LPS 10mg/kg，Control組、Sham組和Model組腹腔注射同等體積的生理鹽水。每日一次，共給藥28d。

1.4大鼠心電圖檢查:末次給藥后，腹腔麻醉大鼠后行心電圖檢查。觀察并記錄各組大鼠左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)、左室收縮壓(LV systolic pressure，LVSP)、左室收縮末期容積(LV end-systolic volume，LVESV)、左室短軸縮短率(LV fractional shortening，LVFS)、左室舒張壓(LV end-diastolic pressure，LVEDP)、左室舒張末期容積(LV end-diastolic volume，LVEDV)，每個(gè)指標(biāo)均觀察并測(cè)量3個(gè)心動(dòng)周期，計(jì)算出均值。

1.5TTC-EB染色法測(cè)定大鼠心肌梗死面積:給藥結(jié)束后，每組選取6只大鼠處死，經(jīng)頸總動(dòng)脈逆行注射0.5% EB溶液1mL，摘除心臟，PBS洗滌后放入-20℃凍存過夜。次日橫向?qū)⒆笮氖仪谐珊穸仍?mm的切片共5片，切片浸入1% TTC溶液(37℃)并孵育20min，之后用多聚甲醛固定，使用ImageProPlus軟件計(jì)算大鼠心臟切片的梗死面積。染色后觀察切片，其中正常心肌呈藍(lán)色，梗死心肌呈白色，缺血心肌呈紅色。

1.6蘇木精-伊紅(HE)和Masson染色觀察各組大鼠心肌組織病理學(xué)變化:處死剩余大鼠并解剖取出心臟，將小于結(jié)扎線 0.5mm 的心肌組織浸于10%甲醛溶液中固定，酒精脫水、石蠟包埋、切片機(jī)切片，HE和Masson染色后于觀察各組大鼠心肌組織的病理學(xué)和纖維化變化。另取余下梗死處及邊緣心肌組織剪碎，儲(chǔ)存于-80℃。

1.7免疫熒光法檢測(cè)各組大鼠心肌細(xì)胞焦亡:取出1.6中制備的心肌切片，經(jīng)去石蠟、抗原修復(fù)、透化后，然后用2%山羊血清封閉，加入一抗cleaved-caspase1(1∶300)和NLRP3(1∶200)，在4℃環(huán)境下孵育過夜。次日于暗處加入相應(yīng)的二抗溶液(1∶500)并孵育45min，之后在暗處再加入DAPI試劑孵育10min，在熒光顯微鏡下觀察記錄焦亡狀態(tài)的心肌細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算焦亡心肌細(xì)胞百分比。

1.8檢測(cè)各組大鼠心肌組織中IL-1β、IL-18和LDH水平:取1.6中凍存的心肌組織，加入冰生理鹽水于超聲勻漿機(jī)中3000 r/min制備10%心肌組織勻漿液。按IL-1β、IL-18和LDH試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)各組大鼠心肌組織中IL-1β、IL-18和LDH水平。

1.9Westren blot檢測(cè)各組大鼠心肌組織中NF-κB、NLRP3、GSDMD-N、cleaved-caspase1蛋白的表達(dá):取1.6中凍存的心肌組織，研磨后加入RIPA裂解緩沖液提取心肌組織總蛋白，BCA試劑盒對(duì)蛋白定量，經(jīng)過凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、脫脂奶粉封閉，將膜與一抗NF-κB(1∶2000)、NLRP3(1∶4000)、GSDMD-N(1∶2000)、cleaved-caspase1(1∶3000)及β-actin(1∶5000)4℃孵育過夜；次日搖床復(fù)溫，清洗膜，加入相應(yīng)二抗接著孵育2h。使用ECL顯色劑進(jìn)行顯色，經(jīng)Image Lab軟件分析計(jì)算各個(gè)蛋白條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算NF-κB、NLRP3、GSDMD-N、cleaved-caspase1蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠心功能指標(biāo):與Control組相比，Sham組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與Sham組相比，Model組大鼠LVEF、LVSP及LVFS降低，LVEDV、LVESV和LVEDP升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。與Model組相比，CY-L、CY-H組大鼠LVEF、LVSP及LVFS顯著升高，LVEDV、LVESV和LVEDP顯著降低(P<0.05)。與CY-L組相比，CY-H組大鼠LVEF、LVSP及LVFS顯著升高，LVEDV、LVESV和LVEDP顯著降低(P<0.05)。與CY-H組大鼠相比，CY-H+LPS組大鼠LVEF、LVSP及LVFS顯著降低，LVEDV、LVESV和LVEDP顯著升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠心功能指標(biāo)比較

2.2各組大鼠心肌梗死面積比較：Control組和Sham組大鼠無(wú)心肌梗死。與Sham組相比，Model組大鼠心肌梗死面積顯著增加(P<0.05)；與Model組相比，CY-L、CY-H組大鼠心肌梗死面積顯著減少(P<0.05)；與CY-L組相比，CY-H組大鼠心肌梗死面積顯著減少(P<0.05)；與CY-H組相比，CY-H+LPS組大鼠心肌梗死面積顯著增加(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2、圖1。

表2 各組大鼠心肌梗死面積比較

圖1 各組大鼠心肌組織TTC-EB染色

2.3各組大鼠心肌組織病理學(xué)變化：HE染色和Masson染色切片圖如圖2、圖3所示。Control組和Sham組大鼠心肌細(xì)胞排列規(guī)則，形態(tài)完整，無(wú)壞死和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，極少量的膠原纖維沉積；Model組大鼠心肌細(xì)胞腫大、排列紊亂，片狀壞死，可見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，大量膠原纖維沉積；與Model組比較，CY-L組和CY-H組大鼠心肌組織病理?yè)p傷減輕，心肌細(xì)胞壞死數(shù)量減少，炎性浸潤(rùn)減輕，膠原纖維沉積減少；與CY-H組相比，CY-H+LPS組心肌組織病理?yè)p傷嚴(yán)重，細(xì)胞大量水腫壞死，膠原纖維沉積增多。

圖2 各組大鼠心肌組織HE染色(×200)

圖3 各組大鼠心肌組織Masson染色(×200)

2.4各組大鼠心肌細(xì)胞焦亡情況比較：Control組和Sham組基本無(wú)焦亡心肌細(xì)胞。與Sham組相比，Model組心肌細(xì)胞焦亡比例顯著增加(P<0.05)；與Model組相比，CY-L組、CY-H組大鼠心肌細(xì)胞焦亡比例顯著降低(P<0.05)；與CY-L組相比，CY-H組大鼠心肌細(xì)胞焦亡比例顯著降低(P<0.05)；與CY-H組相比，CY-H+LPS組大鼠心肌細(xì)胞焦亡比例顯著增加(P<0.05)。結(jié)果見表3、圖4。

圖4 大鼠心肌免疫熒光結(jié)果(DAPI，×200)注：箭頭所指為各組大鼠焦亡心肌細(xì)胞

表3 各組大鼠心肌細(xì)胞焦亡比例

2.5各組大鼠心肌組織中IL-1β、IL-18及LDH水平比較：與Control組相比，Sham組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。與Sham組比，Model組大鼠IL-1β、IL-18及LDH水平顯著升高(P<0.05)；與Model組相比，CY-L、CY-H組大鼠IL-1β、IL-18及LDH水平顯著降低(P<0.05)；與CY-L組相比，CY-H組大鼠IL-1β、IL-18及LDH水平顯著降低(P<0.05)；與CY-H組相比，CY-H+LPS組大鼠IL-1β、IL-18及LDH水平顯著升高(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 各組大鼠心肌組織中IL-1β IL-18及LDH水平比較

2.6各組大鼠心肌組織中NF-κB/NLRP3通路相關(guān)蛋白表達(dá)的比較:與Control組相比，Sham組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。與Sham組相比，Model組大鼠NF-κB、NLRP3、GSDMD-N、cleaved-caspase1蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。與Model組相比，CY-L組、CY-H組大鼠NF-κB、NLRP3、GSDMD-N、cleaved-caspase1蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。與CY-L組相比，CY-H組大鼠NF-κB、NLRP3、GSDMD-N、cleaved-caspase1蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與CY-H組相比，CY-H+LPS組大鼠NF-κB、NLRP3、GSDMD-N、cleaved-caspase1蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5、圖5。

圖5 各組大鼠心肌組織中NF-κB/NLRP3通路相關(guān)蛋白表達(dá)的比較注：A：Control組；B：Sham組；C：Model組；D：CY-L組；E：CY-H組；F：CY-H+LPS組

表5 各組大鼠心肌組織中NF-κB/NLRP3通路相關(guān)蛋白表達(dá)的比較

3 討 論

MI是一種嚴(yán)重的冠心病臨床類型，在發(fā)達(dá)國(guó)家導(dǎo)致每年超過1/3的患者死亡，是全球死亡和殘疾的主要原因之一，給人們生命健康帶來(lái)威脅[8]。本研究采用冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎法建立大鼠MI模型，該種模型在傳統(tǒng)的徐氏方法基礎(chǔ)上進(jìn)行改良，大大提高了造模成功率。結(jié)果顯示MI模型組大鼠LVESV、LVEDP、LVEDV升高，LVEF、LVSP、LVFS降低，切片顯示心肌梗死面積約為(43.28±3.79)%，提示MI模型大鼠心肌缺血、心功能下降。

細(xì)胞焦亡是新定義的一種細(xì)胞死亡方式，其與炎癥相關(guān)。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生焦亡時(shí)，細(xì)胞體積增加，細(xì)胞膜破裂穿孔，內(nèi)容物流出，形成活化的焦亡小體，釋放炎癥因子進(jìn)而加重炎癥反應(yīng)，致組織損傷和病理學(xué)變化[9]。有研究顯示，心肌細(xì)胞焦亡參與了心衰的發(fā)生發(fā)展，也在心肌缺血/再灌注損傷中發(fā)揮了重要的作用[10]。而關(guān)于心肌細(xì)胞焦亡是否也參與了MI，目前研究較少。本研究建立MI大鼠模型后發(fā)現(xiàn)，Model組大鼠心肌組織中LDH水平增加，說(shuō)明損傷了心肌細(xì)胞膜；大鼠心肌組織中細(xì)胞焦亡所占百分比顯著升高(P<0.05)，炎癥因子IL-1β、IL-18增多，這些可能引起心肌組織壞死，造成心肌組織炎性損傷。HE染色和Masson染色結(jié)果顯示心肌細(xì)胞腫大、排列紊亂，有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，并出現(xiàn)大量膠原纖維沉積，這些都是明顯的炎性損傷特征。結(jié)果說(shuō)明心肌細(xì)胞焦亡在MI發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮了重要的作用，且炎性損傷有可能導(dǎo)致了MI和心功能的下降。

目前，中醫(yī)藥因其毒副作用較小，治療MI療效確切，將其與西醫(yī)結(jié)合應(yīng)用于MI已成為醫(yī)藥界研究熱點(diǎn)與趨勢(shì)。CY作為紅花的有效成分，市售的注射用紅花黃色素在活血化瘀方面的臨床效果優(yōu)于紅花。Lu等[11]研究發(fā)現(xiàn)CY能通過減少活性氧的釋放和炎癥反應(yīng)來(lái)保護(hù)心臟免受缺血/再灌注損傷；Guo等[12]發(fā)現(xiàn)CY能通過減輕大鼠炎癥反應(yīng)和鐵死亡來(lái)改善腦缺血/再灌注損傷。但CY在MI中對(duì)心肌細(xì)胞焦亡和炎性損傷的作用還鮮有報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，與Model組大鼠相比，CY-H組大鼠心功能明顯改善，心肌組織的炎癥損傷和細(xì)胞焦亡減弱，IL-1β、IL-18和LDH釋放減少，說(shuō)明CY能減輕MI的炎性損傷。

NLRP3是一種炎癥小體復(fù)合物，在細(xì)胞焦亡中發(fā)揮了重要的作用。當(dāng)細(xì)胞受到危險(xiǎn)信號(hào)后，NLRP3、ASC和pro-caspase1相互組裝導(dǎo)致pro-caspase1分解為活性cleaved-caspase1[13]。cleaved-caspase1促進(jìn)IL-1β的成熟和分泌，誘導(dǎo)了組織炎性損傷。GSDMD被催化裂解為GSDMD-N和GSDMD-C，其中GSDMD-N能導(dǎo)致與炎癥相關(guān)的細(xì)胞焦亡，且GSNMD受到NF-κB的調(diào)控。本研究結(jié)果顯示，與Sham組相比，Model組大鼠心肌組織中NF-κB、NLRP3、GSDMD-N、cleaved-caspase1蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)，誘導(dǎo)了心肌細(xì)胞炎性損傷和細(xì)胞焦亡。與Model組相比，CY-H組大鼠心肌組織中NF-κB、NLRP3、GSDMD-N、cleaved-caspase1蛋白表達(dá)顯著降低，且減輕了心肌組織炎性損傷和細(xì)胞焦亡。推測(cè)CY可能通過抑制NF-κB/NLRP3通路減輕MI導(dǎo)致的心肌細(xì)胞焦亡和炎性損傷。為了驗(yàn)證此猜想，本研究利用NF-κB的激活劑LPS來(lái)干預(yù)高劑量CY處理的MI大鼠。結(jié)果顯示，LPS減弱了高劑量CY對(duì)MI大鼠心肌細(xì)胞焦亡和炎性損傷的抑制作用。證實(shí)了CY可能抑制NF-κB/NLRP3通路，抑制MI大鼠的心肌細(xì)胞焦亡，減輕炎性損傷。

綜上所述，CY可能通過抑制NF-κB/NLRP3通路，抑制MI大鼠的心肌細(xì)胞焦亡，減輕炎性損傷。該研究為開發(fā)用于MI臨床治療的新型藥物提供了新的思路和方法。然而，該項(xiàng)研究還存在不足之處，NLRP3介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡可能還涉及了其他通路，還需進(jìn)一步設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究。