丹酚酸B通過Ctsk/STAT3軸對小鼠口腔癌的抑制作用*

杜雯雯 廖鎮(zhèn) 王娟 王茜

(1.重慶市第九人民醫(yī)院口腔科，重慶， 400700；2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院口腔正畸科，河南 鄭州 450000)

口腔癌是頭頸部最典型的惡性腫瘤之一，包括舌癌、牙齦癌、頰黏膜癌、唇癌及頜骨癌等，因其易轉(zhuǎn)移、預(yù)后差，采取有效手段預(yù)防口腔癌癥顯得尤為重要[1-2]。目前對于口腔癌的主要治療手段為癌癥化學(xué)預(yù)防，但化學(xué)預(yù)防藥物的長期耐藥性及不良反應(yīng)導(dǎo)致治療效果不佳，開發(fā)新的以天然植物為基礎(chǔ)的抗腫瘤藥物，是目前抑制腫瘤藥物研發(fā)熱點?；钛鍪侵嗅t(yī)治療常用手段，臨床研究顯示，活血化瘀藥物具有抗凝血，抑制癌細(xì)胞增生、轉(zhuǎn)移，調(diào)節(jié)機(jī)體自身免疫等作用[3-4]。丹參作為臨床治療常用中藥，可通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、分化和凋亡等發(fā)揮抗炎、抗腫瘤作用[5-6]。丹酚酸B是一種從丹參中提取的水溶性酚酸類化合物，作為丹參最具代表的單體成分，含量高、且作用效果強(qiáng)[7-8]。有研究表明，丹酚酸B可減輕大鼠結(jié)腸癌炎性反應(yīng)及病理損傷，抑制細(xì)胞增殖，從而發(fā)揮抗腫瘤作用[9]。本研究通過建立口腔癌模型，初步探討丹酚酸B對小鼠口腔癌的抑制作用，為丹酚酸B相關(guān)藥物研發(fā)及腫瘤臨床治療口腔癌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選取SPF級C57BL/6雄性小鼠100只，體重(20±3)g，6周齡，購自上海菲諾克生物科技有限公司，許可證號：SCXK(滬)2018-0005，光照晝夜交替12 h，室溫飼養(yǎng)1周。本研究通過醫(yī)院動物倫理委員會審核通過。

1.1.2 藥物、主要試劑和儀器 丹酚酸B，純度98%，成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司；順鉑注射液，國藥準(zhǔn)字：H20043889，云南植物藥業(yè)有限公司；白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)ELISA試劑盒，美國R&D公司；DAB顯色試劑盒，美國Sigma公司；兔抗5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2-deoxyUridine，BrdU)單抗、組織蛋白酶K(cathepsin K，Ctsk)單抗、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3(hosphorylated signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)單抗、磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3(p-hosphorylated signal transducer and activator of transcription 3，p-STAT3)單抗、信號傳導(dǎo)抑制因子3(recombinant suppressors of cytokine Signaling 3，SOCS3)多抗、羊抗兔二抗-HRP，英國Abcam公司；電泳儀、垂直電泳槽，美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 建模、分組 隨機(jī)選取80只小鼠，建立口腔癌模型[10]：采用致癌劑4-硝基喹啉-1-氧化物(4-nitroquino-line-1-oxide，4NQO)誘導(dǎo)法，將含有0.5%的4NQO丙二醇溶液涂于小鼠口腔頰囊兩側(cè)，3次/周，共4周。當(dāng)小鼠口腔頰囊黏膜組織相繼出現(xiàn)白色斑塊、潰瘍、糜爛、顆粒狀增生等現(xiàn)象，即為造模成功。建模成功后隨機(jī)分為模型組、丹酚酸B低劑量組、丹酚酸B高劑量組、陽性藥物組，每組20只，余下20只為對照組，對照組小鼠口腔涂抹丙二醇溶液。

1.2.2 干預(yù)方法 建模成功后24 h，對照組每日灌服等量蒸餾水；丹酚酸B低、高劑量組、陽性藥物組分別灌服10 mg·kg-1、40 mg·kg-1丹酚酸B溶液及4 mg·kg-1順鉑溶液，各100 μL，1次/日，共計4周。

1.2.3 樣品采集 末次給藥干預(yù)后24 h，小鼠腹腔注射20 μL BrdU，2 h后脫頸處死，剝離口腔頰囊黏膜組織，一部分置于4%多聚甲醛固定備用，另一部分則于-80℃存儲備用。

1.2.4 病理組織學(xué)觀察 取4%多聚甲醛固定備用1/2口腔頰囊黏膜組織，石蠟包埋，切片(5 μm)，加熱脫蠟，蘇木精染色(3～5 min)、清洗、置于1%(v/v)H2O2浸泡(10～30 s)，水洗、伊紅染色(20 min)，水洗，脫水(10 min)，透化(二甲苯，10 min)，中性樹脂封固，光學(xué)顯微鏡觀察，依據(jù)WHO癌癥診斷標(biāo)準(zhǔn)[11]，將小鼠口腔頰囊黏膜組織病變分為單純增生、異常增生(輕度異常增生、重度異常增生)、鱗癌等不同病理現(xiàn)象，并記錄四種病理現(xiàn)象的數(shù)目，取平均值。

1.2.5 細(xì)胞增殖 取4%多聚甲醛固定備用1/2口腔頰囊黏膜組織，切片，Brdu免疫組化ABC染色，測定細(xì)胞增殖活性，選取5個視野，光學(xué)顯微鏡下(200×)記錄被Brdu標(biāo)記的陽性細(xì)胞數(shù)及總細(xì)胞數(shù)。增殖指數(shù)以每100個細(xì)胞中被Brdu標(biāo)記的陽性細(xì)胞數(shù)表示。

1.2.6 促炎因子檢測 取-80℃存儲備用1/3口腔頰囊黏膜組織，加入組織裂解液勻漿，離心(12000 r/min，5 min，離心半徑20 cm)取上清液。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定IL-6、IL-1β、VEGF、HIF-1α含量，酶標(biāo)儀檢測在450 nm處吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算口腔頰囊黏膜組織IL-6、IL-1β、VEGF、HIF-1α含量。

1.2.7 Ctsk、STAT3、SOCS3 mRNA水平檢測 取-80℃存儲備用1/3口腔頰囊黏膜組織，勻漿，Trizol法提取RNA，測其純度與濃度，并逆轉(zhuǎn)錄得cDNA，進(jìn)行實時熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系：1.2 μL Taq聚合酶、1 μL上下游引物、4 μL模板cDNA、18.8 μL ddH2O。擴(kuò)增條件：預(yù)變性(94℃，30 s)、變性(94℃，5 s)、退火(59℃，30 s)，共40個循環(huán)，加熔解曲線，降溫(50℃，30 s)。以β-actin為內(nèi)參基因，數(shù)據(jù)分析采用2-△△Ct法，重復(fù)多次，取Ct均值。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.8 Ctsk、STAT3、p-STAT3、SOCS3蛋白表達(dá)水平檢測 取-80℃存儲備用1/3口腔頰囊黏膜組織，添加RIPA裂解緩沖液離心取上清，蛋白BCA試劑盒確定總蛋白濃度，待測蛋白樣品進(jìn)行電泳分離(100V，80 min)，轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜(250 mA恒流)，5%脫脂牛奶的磷酸鹽緩沖液封閉(2 h)，將樣品與Ctsk(1∶1000)、STAT3(1∶1000)、p-STAT3(1∶1000)、SOCS3(1∶1000)一抗進(jìn)行孵育(4℃，24 h)，TBST緩沖液洗膜，加二抗(HRP標(biāo)記的IgG，1∶5000)室溫孵育2 h，洗膜，曝光，顯影。Image J軟件測樣品條帶與β-actin條帶灰度值。其中目標(biāo)蛋白相對表達(dá)水平計算為目標(biāo)條帶與β-條帶灰度比值。

2 結(jié)果

2.1 建模結(jié)果 未建模小鼠口腔黏膜結(jié)構(gòu)正常，未發(fā)生病變，黏膜層次清晰，基底平滑，無明顯凸起；參與建模小鼠口腔黏膜上皮細(xì)胞極性消失，出現(xiàn)異常增生、異型性細(xì)胞，嚴(yán)重者發(fā)展為原位癌。見圖1。

圖1 建模與未建模小鼠口腔黏膜病理學(xué)變化(HE×200)

2.2 組口腔頰囊黏膜組織病理學(xué)觀察 HE結(jié)果顯示，對照組小鼠口腔頰囊黏膜細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，層次清晰，排列整齊，未出現(xiàn)血管擴(kuò)張現(xiàn)象；模型組黏膜細(xì)胞結(jié)構(gòu)、層次紊亂，且出現(xiàn)大量脫落，大量炎癥性細(xì)胞浸潤，出現(xiàn)異型增生現(xiàn)象；丹酚酸B低、高劑量組以及陽性藥物組黏膜細(xì)胞結(jié)構(gòu)相對完整，出現(xiàn)部分炎性細(xì)胞浸潤、輕度毛細(xì)血管擴(kuò)張現(xiàn)象，且丹酚酸B高劑量組與陽性藥物組改善明顯。見圖2。單純增生、輕度異常增生、重度異常增生、鱗癌病理程度組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，丹酚酸B低、高劑量組與陽性藥物組單純增生、輕度異常增生、重度異常增生、鱗癌病理程度降低(P<0.05)；與丹酚酸B低劑量組比較，丹酚酸B高劑量組與陽性藥物組單純增生、輕度異常增生、重度異常增生、鱗癌病理程度降低，且陽性藥物組顯著低于丹酚酸B高劑量組(P<0.05)。見表2。

表2 口腔癌病變結(jié)果分析比較

圖2 口腔頰囊黏膜組織病理學(xué)變化(HE×200)

2.3 細(xì)胞增殖指數(shù)比較 Brd U免疫組化結(jié)果顯示，單純增生、輕度異常增生、重度異常增生、鱗癌細(xì)胞增殖指數(shù)組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，丹酚酸B低、高劑量組與陽性藥物組單純增生、輕度異常增生、重度異常增生、鱗癌細(xì)胞增殖指數(shù)降低(P<0.05)；與丹酚酸B低劑量組比較，丹酚酸B高劑量組與陽性藥物組單純增生、輕度異常增生、重度異常增生、鱗癌細(xì)胞增殖指數(shù)降低，且陽性藥物組低于丹酚酸B高劑量組(P<0.05)。見表3、圖3。

圖3 Brd U免疫組化染色(200×)

表3 口腔黏膜上皮細(xì)胞增殖指數(shù)比較

2.4 促炎因子水平比較 口腔頰囊黏膜組織IL-6、IL-1β、VEGF、HIF-1α水平組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組比較，模型組IL-6、IL-1β、VEGF、HIF-1α水平升高(P<0.05)；與模型組比較，丹酚酸B低、高劑量組與陽性藥物組IL-6、IL-1β、VEGF、HIF-1α水平降低(P<0.05)；與丹酚酸B低劑量組比較，丹酚酸B高劑量組與陽性藥物組IL-6、IL-1β、VEGF、HIF-1α水平降低，且陽性藥物組低于丹酚酸B高劑量組(P<0.05)。見表4。

表4 口腔頰囊黏膜組織IL-6、IL-1β、VEGF、HIF-1α水平比較

2.5 Ctsk、STAT3、SOCS3 mRNA水平比較 口腔頰囊黏膜組織Ctsk、SOCS3 mRNA水平組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組比較，模型組Ctsk mRNA水平升高，SOCS3 mRNA水平降低(P<0.05)；與模型組比較，丹酚酸B低、高劑量組與陽性藥物組SOCS3 mRNA水平升高，Ctsk mRNA水平降低(P<0.05)；與丹酚酸B低劑量組比較，丹酚酸B高劑量組與陽性藥物組SOCS3 mRNA水平升高，Ctsk mRNA水平降低(P<0.05)；與丹酚酸B高劑量組比較，陽性藥物組SOCS3 mRNA水平升高，Ctsk mRNA水平降低(P<0.05)。見圖4。

圖4 口腔頰囊黏膜組織Ctsk、STAT3、SOCS3 mRNA水平比較(n=5)

2.6 Ctsk、STAT3、p-STAT3、SOCS3蛋白水平比較 口腔頰囊黏膜組織Ctsk、p-STAT3、SOCS3蛋白水平組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組比較，模型組Ctsk、p-STAT3蛋白水平升高，SOCS3蛋白水平降低(P<0.05)；與模型組比較，丹酚酸B低、高劑量組與陽性藥物組SOCS3蛋白水平升高，Ctsk、p-STAT3蛋白水平降低(P<0.05)；與丹酚酸B低劑量組比較，丹酚酸B高劑量組與陽性藥物組SOCS3蛋白水平升高，Ctsk、p-STAT3蛋白水平降低(P<0.05)；與丹酚酸B高劑量組比較，陽性藥物組SOCS3蛋白水平升高，Ctsk、p-STAT3蛋白水平降低(P<0.05)。見圖5。

圖5 口腔頰囊黏膜組織Ctsk、STAT3、p-STAT3、SOCS3蛋白表達(dá)(n=5)

3 討論

口腔黏膜癌一種發(fā)病率高、易轉(zhuǎn)移、浸潤較快的黏膜上皮惡性腫瘤，其中以口腔鱗狀細(xì)胞癌為主，即典型表現(xiàn)為口腔黏膜上鱗狀細(xì)胞發(fā)生癌變[12-13]。由于口腔癌發(fā)展進(jìn)程極其復(fù)雜，且伴隨著龐雜生物學(xué)行為，使得臨床研究出現(xiàn)各種局限性、不確定性，致使其發(fā)病機(jī)制研究更加困難，這也一直是眾多學(xué)者面臨的科研難題。

癌癥發(fā)生的關(guān)鍵因素為細(xì)胞過度增殖、凋亡，作為胸腺嘧啶類似物代表之一，Brd U可替代胸腺嘧啶參加S期細(xì)胞DNA復(fù)制，細(xì)胞增殖指數(shù)代表其活躍程度[14]。慢性炎癥和各類腫瘤病發(fā)相關(guān)，其中口腔癌的發(fā)生與口腔長期慢性炎癥密不可分[15]。馬瀅等[16]研究顯示，丹酚酸B可通過抑制相關(guān)信號通路，明顯減輕小鼠肝纖維化-肝細(xì)胞癌進(jìn)程，發(fā)揮抑癌作用。張琳等[17]研究認(rèn)為，丹酚酸B對結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖具有顯著抑制作用。另外也有報道顯示，丹酚酸B可誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬性死亡[18]。以上研究均提示丹酚酸B可通過不同途徑發(fā)揮抗癌作用，此外，丹酚酸B的抗炎作用也已得到證實[19]。本研究使用丹酚酸B干預(yù)口腔癌小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)丹酚酸B干預(yù)后，單純增生、輕度異常增生、重度異常增生、鱗癌等病理程度及Brd U細(xì)胞增殖指數(shù)，IL-6、IL-1β、VEGF、HIF-1α水平降低，提示丹酚酸B可通過降低口腔黏膜組織上皮細(xì)胞過度增殖，改善炎性反應(yīng)，減輕病理損傷，抑制小鼠口腔癌發(fā)生。HE結(jié)果顯示，丹酚酸B低、高劑量組與陽性藥物組口腔黏膜組織不同病理現(xiàn)象均較模型組出現(xiàn)改善，其中丹酚酸B高劑量組與陽性藥物組改善明顯，說明口腔癌的發(fā)生與細(xì)胞過度增殖息息相關(guān)，提示丹酚酸B作為口腔癌藥物治療手段，應(yīng)用前景廣闊。

致癌信號通路失調(diào)是癌癥的標(biāo)志，其中STAT信號通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[20]。STAT家族將信號從細(xì)胞膜傳至細(xì)胞核，在細(xì)胞存活與功能活動中起核心作用[21]。STAT可調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫和癌癥進(jìn)展，作為最重要的轉(zhuǎn)錄因子之一，STAT3可被細(xì)胞因子或生長因子激活，而STAT3異常激活可引起細(xì)胞不受限制增殖和惡性轉(zhuǎn)化[22-23]。研究表明，STAT3信號因子與多種腫瘤進(jìn)展直接相關(guān)，例如參與胰腺癌、乳腺癌和肺癌等腫瘤發(fā)展進(jìn)程[24-26]。STAT3作為細(xì)胞因子和生長因子信號，可調(diào)控下游SOCS3表達(dá)，從而調(diào)節(jié)多種致癌基因的轉(zhuǎn)錄，且STAT3上調(diào)也與自身不良預(yù)后有關(guān)[27]。Jiang等[28]研究顯示，激活STAT3通路，可促進(jìn)口腔癌細(xì)胞增殖。Ctsk與多種疾病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，在牙周炎、口腔癌等口腔頜面部疾病中發(fā)揮重要作用[29-30]。調(diào)控Ctsk/STAT3軸關(guān)鍵分子表達(dá)，可影響細(xì)胞增殖、分化和成熟過程[31]。本研究結(jié)果顯示，丹酚酸B能降低Ctsk mRNA和蛋白以及p-STAT3和SOCS3蛋白表達(dá)，說明丹酚酸B可介導(dǎo)Ctsk因子表達(dá)，并激活STAT3通路，抑制腫瘤細(xì)胞增殖與分化，提示丹酚酸B可抑制Ctsk/STAT3軸關(guān)鍵分子表達(dá)調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)活性，從而發(fā)揮對小鼠口腔癌的抑制作用。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，丹酚酸B對小鼠口腔癌具有明顯抑制作用，可能通過調(diào)控Ctsk/STAT3軸相關(guān)mRNA和蛋白表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)，抑制口腔黏膜異常增生，改善病理損傷，為丹酚酸B相關(guān)藥物研發(fā)及臨床口腔癌治療提供了新思路。但丹酚酸B是否可通過其他機(jī)制發(fā)揮抗癌作用，尚需進(jìn)一步研究。