靶向SDF-1通過(guò)調(diào)控腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞亞型增強(qiáng)結(jié)直腸癌化療敏感性的作用*

陳茹 劉洪伯 馬麗麗

(新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院腫瘤科，新疆 烏魯木齊 830011)

結(jié)直腸癌(Colorectal cancer, CRC)是全球第三大常見(jiàn)的癌癥類(lèi)型，致死率也位居全球第三位，每年造成約7萬(wàn)例患者死亡[1]。隨著人們飲食和生活方式的變化，CRC發(fā)病率也呈上升趨勢(shì)。盡管近幾十年來(lái)CRC的診斷和治療均取得了一定進(jìn)展，但尚未開(kāi)發(fā)出有效的方法來(lái)治療晚期轉(zhuǎn)移性CRC，據(jù)統(tǒng)計(jì)，局部CRC患者的5年生存率為80%，而遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者的5年生存率僅為10%～20%[2]。目前，基于手術(shù)的綜合治療仍是晚期CRC治療的最佳策略，其中常用的一線化療藥物包括氟尿嘧啶、亞葉酸鈣和奧沙利鉑等[3-4]，但這些藥物的長(zhǎng)期重復(fù)使用會(huì)導(dǎo)致耐藥性產(chǎn)生，從而限制了其臨床應(yīng)用。基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(Stromal cell-derived factor-1，SDF-1)，也稱為CXC趨化因子配體12(CXCL12)，是一類(lèi)具有強(qiáng)大趨化潛能的穩(wěn)態(tài)細(xì)胞因子，與跨膜G蛋白偶聯(lián)受體CXCR4相互作用，參與一系列生理和病理過(guò)程，例如參與多種組織器官發(fā)育、細(xì)胞生長(zhǎng)、腫瘤進(jìn)展、血管生成及轉(zhuǎn)移[5-6]。AMD3100是SDF-1/CXCR4軸的特異性拮抗劑，通過(guò)特異性的與CXCR4結(jié)合抑制SDF-1/CXCR4軸之間的相互作用，進(jìn)一步阻斷該軸參與的生理和病理過(guò)程，并且與其他趨化因子受體無(wú)交叉反應(yīng)[7]。目前，靶向SDF-1已經(jīng)成為多種實(shí)體瘤的治療策略之一，本研究旨在探討通過(guò)AMD3100靶向SDF-1阻斷SDF-1/CXCR4軸后對(duì)結(jié)直腸癌化療敏感性的影響及其作用機(jī)制，以期為結(jié)直腸癌的治療提供一種新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SPF級(jí)BALB/c裸鼠30只，4周齡，體質(zhì)量18～20 g，飼養(yǎng)于新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫度為22～25℃，相對(duì)濕度為40%～60%，每日光照/黑暗交替各12 h，期間自由飲水與飲食。本研究通過(guò)醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審核通過(guò)。

1.2 主要材料與試劑 人結(jié)直腸癌細(xì)胞系LoVo和人單核細(xì)胞系THP-1購(gòu)自購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。胎牛血清購(gòu)自杭州四季青；青霉素-鏈霉素雙抗、RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；佛波酯(PMA)、白細(xì)胞介素-4(IL-4)、奧沙利鉑(Oxaliplatin)和SDF-1抑制劑AMD3100購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher Scientific公司；M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司；SYBR?Premix Ex TaqTMII試劑盒購(gòu)自日本Takara公司；CCK-8試劑盒、BCA蛋白檢測(cè)試劑盒及ECL發(fā)光液購(gòu)自上海碧云天生物研究所；免疫組織化學(xué)染色試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；APC標(biāo)記CD86抗體、PE標(biāo)記CD206抗體、eFluor 450 標(biāo)記F4/80抗體、APC標(biāo)記CD11c抗體以及兔抗人SDF-1、iNOS、Arg-1抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；兔抗人GAPDH抗體和辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG購(gòu)自北京中杉金橋生物有限公司。其他使用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)與誘導(dǎo) 將凍存的LoVo細(xì)胞浸入37℃水浴鍋復(fù)蘇后，加入適量含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。在THP-1細(xì)胞中添加RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，調(diào)整密度為1×106個(gè)/mL，吸取100 μL接種于6孔板中，每孔加入20 ng/mL PMA，于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3 d，誘導(dǎo)細(xì)胞貼壁分化為M0型巨噬細(xì)胞，再換用20 ng/mL IL-4繼續(xù)培養(yǎng)72 h，誘導(dǎo)獲得TAMs細(xì)胞。

1.3.2 流式細(xì)胞術(shù) 收集誘導(dǎo)后的TAMs細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞并重懸，并在細(xì)胞懸液中加入等體積血清，于室溫下封閉30 min，接著加入APC標(biāo)記CD86抗體與PE標(biāo)記CD206抗體，于4℃暗室反應(yīng)30 min，PBS洗滌細(xì)胞后再次重懸，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面CD86和CD206表達(dá)情況。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 使用5 μg·mL-1SDF-1抑制劑AMD3100處理TAMs細(xì)胞24 h后，收集細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞。Trizol試劑分別提取TAMs細(xì)胞與SDF-1抑制劑AMD3100處理后TAMs細(xì)胞的總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA純度與濃度，選擇OD260/OD280值在1.8～2.0間的樣品，按照M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各基因在mRNA上的表達(dá)水平，具體根據(jù)SYBR?Premix Ex TaqTMII試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，設(shè)內(nèi)參基因?yàn)镚APDH。擴(kuò)增條件為：95℃ 3 min，1個(gè)循環(huán)；95℃ 30 s、60℃ 30 s、58℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，根據(jù)2-ΔΔCt法計(jì)算各基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。引物具體序列如下：SDF-1上游引物5′-CCTGTGTGTCATGCCCTCTT-3′，下游引物5′-AGTCCAGCCTGCTATCCTCA-3′；iNOS上游引物5′-ATGACTGAATATAACTTGTG-3′，下游引物5′-GAGAAGGACAAGAAAGCC-3′；TNF-α上游引物5′-TCTTCTCATTCCTGCTTGTG G-3′，下游引物5′-GGTCTGGGCCATAGAACTGA-3′；Arg-1上游引物5′-AGGGCAGAGTCAAGATGA AC-3′，下游引物5′- TGTGGTTGTCAGTGGAGCT TG-3′； TGF-β上游引物5′-ACCTCGGCTGGAAGT GGATC-3′，下游引物5′-CCTTGCTGTACTGCGTG TCC-3′；GAPDH上游引物：5′-AACGGATTTGGTC GTATTG-3′,下游引物：5′-GGAAGATGGTGATGG GATT-3′。

1.3.4 蛋白質(zhì)免疫印跡 在經(jīng)AMD3100處理和未處理的TAMs細(xì)胞中加入RIPA裂解緩沖液提取總蛋白，BCA法測(cè)定總蛋白質(zhì)質(zhì)量。制備10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠，取蛋白樣品等量上樣，通過(guò)電泳分離蛋白質(zhì)，將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜，加入5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST洗膜，加入兔抗人SDF-1抗體(1∶1000)，設(shè)內(nèi)參蛋白為GAPDH(1∶1000)，4℃下共同孵育過(guò)夜；次日，棄去一抗工作液，TBST洗膜，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶5000)，室溫孵育1 h，TBST再次洗膜，ECL化學(xué)發(fā)光液顯色曝光，凝膠成像系統(tǒng)拍照，Image J軟件分析蛋白條帶的灰度值。

1.3.5 共培養(yǎng)體系的建立與實(shí)驗(yàn)分組 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LoVo細(xì)胞和經(jīng)不同處理的TAMs細(xì)胞，將LoVo細(xì)胞以5×104個(gè)的密度接種在Transwell小室的6孔板底部，將TAMs細(xì)胞以1×105個(gè)的密度接種在Transwell小室的上層，分別加入適量新鮮培養(yǎng)基，以建立LoVo細(xì)胞與TAMs細(xì)胞的共培養(yǎng)體系。實(shí)驗(yàn)分組包括空白對(duì)照組、奧沙利鉑組(使用不同濃度0、0.5、5、50、500 μmol/L奧沙利鉑處理LoVo細(xì)胞48 h)，TAMs+奧沙利鉑組(LoVo細(xì)胞與TAMs細(xì)胞共培養(yǎng)，再用0、0.5、5、50、500 μmol/L奧沙利鉑處理LoVo細(xì)胞48 h)，AMD3100+TAMs+奧沙利鉑組(使用5 μg·mL-1SDF-1抑制劑AMD3100預(yù)先處理TAMs細(xì)胞24 h再與LoVo細(xì)胞共培養(yǎng)，之后使用0、0.5、5、50、500 μmol/L奧沙利鉑處理LoVo細(xì)胞48 h)。

1.3.6 CCK-8法 收集奧沙利鉑組、TAMs+奧沙利鉑組、AMD3100+TAMs+奧沙利鉑組LoVo細(xì)胞，根據(jù)CCK-8試劑盒分別檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，各組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，在每個(gè)細(xì)胞孔中加入10 μL CCK-8試劑液，輕輕混勻，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2 h，通過(guò)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定450 nm處各孔光密度值(OD值)。

1.3.7 動(dòng)物移植瘤模型建立 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的LoVo細(xì)胞，加入0.25%胰蛋白酶消化，吹打呈單細(xì)胞懸液，以4000 rpm/min離心10 min，棄上清，并用適量的RPMI 1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液密度為1×107個(gè)/mL，取30只BALB/c裸鼠，并吸取0.5 mL的細(xì)胞懸液注射到裸鼠右側(cè)腋窩皮下，觀察注射部分移植瘤長(zhǎng)出情況。待腫瘤長(zhǎng)出，取12只腫瘤大小為100 mm3的模型裸鼠，將其根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為3組，包括對(duì)照組、奧沙利鉑組、AMD3100+奧沙利鉑組，每組4只，奧沙利鉑組腹腔注射8 mg/kg奧沙利鉑，AMD3100+奧沙利鉑組腹腔注射5 mg/kg SDF-1抑制劑AMD3100和8 mg/kg奧沙利鉑，對(duì)照組同時(shí)注射等體積生理鹽水，每日一次，持續(xù)18 d。首次給藥后，在第0、3、6、9、12、15、18 d使用游標(biāo)卡尺測(cè)量各組裸鼠腫瘤塊的長(zhǎng)徑和短徑，計(jì)算腫瘤體積V=1/2×腫瘤長(zhǎng)徑×腫瘤短徑2。末次給藥后，脫頸椎處死各組裸鼠，解剖取其腫瘤組織并稱重，固定在10%福爾馬林溶液中備用。

1.3.8 不同亞型巨噬細(xì)胞分選 將裸鼠腫瘤組織切成大約1 mm3小塊，加入裂解液置于冰上孵育30 min，通過(guò)細(xì)胞裂解儀處理，再經(jīng)過(guò)濾、離心、重懸的步驟制備單細(xì)胞懸液。PBS洗滌細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液密度為1×107個(gè)/mL，吸取90 μL移至無(wú)菌離心管中，加入10 μL eFluor 450抗鼠F4/80抗體，分選F4/80陽(yáng)性細(xì)胞后，再次加入10 μL APC標(biāo)記CD11c抗體和10 μL PE標(biāo)記CD206抗體，進(jìn)行二次分選。在F4/80陽(yáng)性基礎(chǔ)上，CD11c陽(yáng)性為M1型巨噬細(xì)胞，CD206陽(yáng)性為M2型巨噬細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

1.3.9 免疫組織化學(xué)染色 取固定好的腫瘤組織制備常規(guī)石蠟切片，厚度為4 μm，切片置于烤箱高溫處理1 h后，脫蠟脫水，蒸餾水浸洗，使用檸檬酸鈉對(duì)切片進(jìn)行抗原修復(fù)，滴加3%過(guò)氧化氫，室溫孵育10 min，PBS沖洗切片，滴加稀釋的10%山羊血清封閉45 min，清除切片周?chē)囊后w，加入兔抗人iNOS(1∶100)抗體、兔抗人Arg-1抗體(1∶100)，4℃冰箱內(nèi)孵育過(guò)夜；次日，棄一抗工作液，PBS 沖洗切片，加入HRP的山羊抗兔IgG(1∶1000)，室溫孵育1 h。PBS再次沖洗切片，滴加DAB顯色液，流水沖洗，Harris蘇木素復(fù)染1 min，1%鹽酸酒精分化，自來(lái)水水洗返藍(lán)，再將切片進(jìn)行程序化脫水、透明，置于通風(fēng)櫥晾干，中性樹(shù)膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)為胞質(zhì)著色棕黃色至棕色，隨機(jī)選擇6個(gè)視野，計(jì)算目的蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率。

2 結(jié)果

2.1 TAMs細(xì)胞的鑒定 通過(guò)倒置顯微鏡觀察THP-1細(xì)胞形態(tài)變化，觀察到誘導(dǎo)前細(xì)胞形態(tài)為規(guī)則圓形，邊緣清晰，呈懸浮狀，未附著在培養(yǎng)皿底部；經(jīng)過(guò)PMA、PMA+IL-4誘導(dǎo)后細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，顆粒較大，為混合圓形或紡錘形，細(xì)胞突起較明顯，見(jiàn)圖1。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，與誘導(dǎo)前細(xì)胞比較，PMA+IL-4誘導(dǎo)后的細(xì)胞中M1型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記物CD86表達(dá)水平明顯減少，同時(shí)M2型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物CD206表達(dá)水平明顯增加，見(jiàn)圖2。

圖1 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)(100×, 50 μm)

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)誘導(dǎo)前后細(xì)胞中CD86和CD206表達(dá)

2.2 各組TAMs細(xì)胞中SDF-1表達(dá)比較 qRT-PCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與未經(jīng)SDF-1抑制劑AMD3100處理的TAMs細(xì)胞比較，經(jīng)過(guò)SDF-1抑制劑AMD3100處理的TAMs細(xì)胞中SDF-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量與蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著下調(diào)(P<0.01)，說(shuō)明TAMs細(xì)胞中SDF-1表達(dá)受到抑制，見(jiàn)圖3。

圖3 TAMs細(xì)胞SDF-1表達(dá)檢測(cè)

2.3 各組TAMs細(xì)胞中iNOS、TNF-α、TGF-β及Arg-1表達(dá)比較 qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與未經(jīng)SDF-1抑制劑AMD3100處理的TAMs細(xì)胞比較，經(jīng)過(guò)SDF-1抑制劑AMD3100處理的TAMs細(xì)胞中iNOS mRNA和TNF-α mRNA的相對(duì)表達(dá)量均顯著升高(P<0.01)，TGF-β mRNA和Arg-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量則顯著降低(P<0.01)，見(jiàn)圖4。

圖4 qRT-PCR檢測(cè)兩組TAMs細(xì)胞中iNOS、TNF-α、TGF-β及Arg-1表達(dá)

2.4 各組LoVo細(xì)胞化療敏感性比較 CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度(0.5、5、50、500 μmol/L)奧沙利鉑處理LoVo細(xì)胞后，細(xì)胞存活率較空白對(duì)照組(0 μmol/L)均顯著下降(P<0.01)，見(jiàn)圖5。經(jīng)不同濃度(0.5、5、50、500 μmol/L)奧沙利鉑處理后，CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，與奧沙利鉑組比較，TAMs+奧沙利鉑組LoVo細(xì)胞存活率顯著升高(P<0.01)；與TAMs+奧沙利鉑組比較，AMD3100+TAMs+奧沙利鉑組LoVo細(xì)胞存活率顯著下降(P<0.01)，見(jiàn)表1。

表1 不同濃度奧沙利鉑對(duì)各處理組LoVo細(xì)胞存活率的影響

圖5 CCK-8檢測(cè)經(jīng)奧沙利鉑處理的LoVo細(xì)胞存活率

2.5 各組裸鼠腫瘤生長(zhǎng)比較 裸鼠首次給藥后，在第6、9、12、15、18 d時(shí)經(jīng)過(guò)測(cè)量發(fā)現(xiàn)，奧沙利鉑組和AMD3100+奧沙利鉑組的裸鼠腫瘤體積均較對(duì)照組顯著下降(P<0.01)，且在第12、15、18 d時(shí)，相較于奧沙利鉑組，AMD3100+奧沙利鉑組的裸鼠腫瘤體積進(jìn)一步下降(P<0.01)，見(jiàn)圖6A；在18 d后取各組裸鼠腫瘤組織，可見(jiàn)奧沙利鉑組和AMD3100+奧沙利鉑組裸鼠的腫瘤塊和重量均小于對(duì)照組(P<0.01)，同時(shí)AMD3100+奧沙利鉑組較奧沙利鉑組也顯著減小(P<0.01)，見(jiàn)圖6B、C。

圖6 各組裸鼠腫瘤生長(zhǎng)情況

2.6 各組裸鼠腫瘤組織中M1、M2 亞型巨噬細(xì)胞比例比較 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，AMD3100+奧沙利鉑組裸鼠腫瘤組織中M1亞型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物F4/80+CD11c+表達(dá)顯著增加(P<0.01)，M2亞型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物F4/80+CD206+表達(dá)顯著減少(P<0.01)，而奧沙利鉑組較對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖7。

圖7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腫瘤組織M1、M2 亞型巨噬細(xì)胞比例

2.7 各組裸鼠腫瘤組織中iNOS和Arg-1表達(dá)比較 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)結(jié)果顯示，AMD3100+奧沙利鉑組裸鼠腫瘤組織中iNOS陽(yáng)性表達(dá)率較對(duì)照組顯著升高(P<0.01)，Arg-1陽(yáng)性表達(dá)率較對(duì)照組顯著下降(P<0.01)，而奧沙利鉑組和對(duì)照組的腫瘤組織中iNOS陽(yáng)性表達(dá)率和Arg-1陽(yáng)性表達(dá)率之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖8。

圖8 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)腫瘤組織中iNOS和Arg-1表達(dá)(100×)

3 討論

CRC全球每年約有136萬(wàn)例新增病例，是導(dǎo)致人類(lèi)癌癥死亡的主要原因之一，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的健康[2]。目前，手術(shù)切除仍是CRC治療最有效的方法，但化學(xué)療法也是術(shù)后輔助治療和轉(zhuǎn)移性癌癥治療中不可缺少的。而在化學(xué)藥物治療過(guò)程中產(chǎn)生的副作用，包括神經(jīng)毒性和胃腸道毒性，會(huì)顯著影響患者的生活質(zhì)量[8]。另外，許多患者在化學(xué)藥物治療過(guò)程中表現(xiàn)出了明顯的耐藥性。因此，迫切需要探索新策略以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的化療敏感性。

奧沙利鉑屬于第三代鉑化合物，能夠誘導(dǎo)癌細(xì)胞中鏈內(nèi)鳥(niǎo)嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤-腺嘌呤DNA連接的形成，以DNA為作用的靶部位，使鉑離子與DNA鏈交聯(lián)以阻斷其轉(zhuǎn)錄復(fù)制過(guò)程，從而誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡[9]。如今，基于奧沙利鉑的化學(xué)療法被認(rèn)為是CRC的一線治療方法，此外，也用于其他癌癥的治療當(dāng)中，如胃癌和胰腺癌[10-11]。然而，單獨(dú)或聯(lián)合使用奧沙利鉑治療中獲得性耐藥的產(chǎn)生會(huì)導(dǎo)致治療失敗，并且?guī)缀跛修D(zhuǎn)移性CRC最終都會(huì)產(chǎn)生耐藥性，因此，探究提高CRC治療中腫瘤細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑的敏感性具有重要意義。

目前，關(guān)于CRC細(xì)胞中奧沙利鉑抗藥性產(chǎn)生的分子機(jī)制尚未完全闡明，必須要更好地了解耐藥性產(chǎn)生中相關(guān)分子機(jī)制以開(kāi)發(fā)提高CRC細(xì)胞化療敏感性的有效治療方法。SDF-1的生物學(xué)效應(yīng)與其觸發(fā)的趨化反應(yīng)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞轉(zhuǎn)移以及基質(zhì)金屬蛋白酶和血管生成因子分泌的能力有關(guān)[12]。越來(lái)越多的研究表明，SDF-1及其受體的相互作用可激發(fā)下游信號(hào)傳導(dǎo)途徑，從而在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、腫瘤血管生成和化學(xué)抗性中發(fā)揮作用[13]。SDF-1/CXCR4相互作用使CXCR4磷酸化，促進(jìn)鈣通量，并直接激活MAPK、PI3K、Wnt和Sonic-Hedgehog信號(hào)通路，從而誘導(dǎo)各種類(lèi)型腫瘤細(xì)胞的增殖[14]。此外，SDF-1在膀胱癌、胃癌、肝細(xì)胞癌、前列腺癌中均高水平表達(dá)[15-16]，由此可見(jiàn)，SDF-1及其受體可能是癌癥治療的潛在靶標(biāo)。本研究通過(guò)體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，使用SDF-1抑制劑AMD3100可提高結(jié)直腸癌對(duì)奧沙利鉑的敏感性，從而抑制了腫瘤生長(zhǎng)。

腫瘤微環(huán)境在癌癥生物學(xué)的各個(gè)方面都具有關(guān)鍵作用，包括生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、血管生成和進(jìn)展等。趨化因子及其受體最初被確定為炎性疾病的介體，但隨著研究的不斷深入，人們?nèi)找嬲J(rèn)識(shí)到趨化因子及其受體是腫瘤細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞之間的關(guān)鍵溝通橋梁，為腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造了一個(gè)寬松的微環(huán)境。因此，一種關(guān)鍵的癌癥治療策略可能打破這種交流通道以破壞腫瘤進(jìn)展。目前，在腫瘤微環(huán)境中靶向SDF-1及其受體的外源性分子與傳統(tǒng)化學(xué)療法相結(jié)合的研究已引起越來(lái)越多的關(guān)注。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMs)是腫瘤微環(huán)境中主要成分之一，在腫瘤間質(zhì)中浸潤(rùn)，參與腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移，在腫瘤微環(huán)境中靶向調(diào)控TAMs已成為癌癥免疫療法的一項(xiàng)新策略，并且可以與傳統(tǒng)療法包括化學(xué)療法和放射療法結(jié)合使用以發(fā)揮協(xié)同治療作用，使腫瘤患者獲得更好的治療效果[17]。通常情況下巨噬細(xì)胞分為M1型和M2型，其中M1型巨噬細(xì)胞能夠產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子，具有促炎和抗腫瘤特性；M2型巨噬細(xì)胞能夠分泌抗炎性細(xì)胞因子，發(fā)揮抗炎和促腫瘤作用[18-19]。隨著腫瘤細(xì)胞的不斷發(fā)展，巨噬細(xì)胞逐漸趨向于M2型，促進(jìn)腫瘤發(fā)生和發(fā)展[20]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，逆轉(zhuǎn)巨噬細(xì)胞從M1型轉(zhuǎn)變?yōu)镸2型可能會(huì)通過(guò)抑制細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移、藥物依賴和免疫逃逸來(lái)阻止癌癥的發(fā)生和發(fā)展[21]。本研究中使用SDF-1抑制劑AMD3100作用TAMs后，M1型巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記物iNOS、TNF-α的表達(dá)升高，M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記物TGF-β、Arg-1的表達(dá)則降低，表明SDF-1抑制劑AMD3100調(diào)控了TAMs亞型轉(zhuǎn)化。此外，經(jīng)過(guò)SDF-1抑制劑AMD3100作用結(jié)直腸癌移植瘤裸鼠后，腫瘤組織中M1亞型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物F4/80+CD11c+表達(dá)增加，iNOS陽(yáng)性表達(dá)率升高，M2亞型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物F4/80+CD206+表達(dá)減少，Arg-1陽(yáng)性表達(dá)率下降，這進(jìn)一步從體內(nèi)證明了靶向SDF-1調(diào)控TAMs亞型轉(zhuǎn)化從而增強(qiáng)了結(jié)直腸癌對(duì)奧沙利鉑的敏感性。

4 結(jié)論

靶向SDF-1能夠提高結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑的敏感性，起到協(xié)同抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用，其機(jī)制可能與誘導(dǎo)結(jié)直腸癌腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的亞型轉(zhuǎn)化相關(guān)。本研究為結(jié)直腸癌的免疫治療提高了一種新思路，為針對(duì)SDF-1及其下游信號(hào)通路的免疫治療提供了理論依據(jù)。