1株新型鴨呼腸孤病毒(SL株)的全基因組測定分析及其致病性

楊曉偉,陸 婧，王凱民，莊鴻琨，田宇森，李俊鋒，朱盈名，劉 霞，張立武，趙光偉, *

(1.西南大學 動物醫(yī)學院，重慶 榮昌 402460；2.南京海關動植物與食品檢測中心，江蘇 南京，210095;3 貴州省動物疫病預防控制中心，貴州 貴陽550008；4.重慶三杰眾鑫生物工程有限公司，重慶 榮昌 402460)

禽呼腸孤病毒(avian reovirus,ARV)是呼腸孤病毒科、正呼腸孤病毒屬的成員。鴨源呼腸孤病毒是其中的一種，目前主要有2種基因型，一種是番鴨呼腸孤病毒(muscovy duck reovirus,MDRV)，主要引起番鴨、半番鴨肝臟、脾臟壞死，腎臟出血等病理變化，俗稱“花肝病”或“肝白點病”；另一種則是引起麻鴨、番鴨、北京鴨、櫻桃谷鴨等多品種鴨以脾臟斑塊樣壞死為特征的“脾壞死病”，該病的病原為新型鴨呼腸孤病毒(novel duck reovirus,NDRV)，可通過垂直和水平2種方式傳播，發(fā)病鴨病死率達到5%～50%，日齡越小病死率越高，無明顯的季節(jié)性，已經(jīng)成為我國近年來最嚴重的鴨病毒性傳染病之一[1]。

NDRV與其他禽源呼腸孤病毒均為呼腸孤病毒科、正呼腸孤病毒屬的成員，為分節(jié)段的雙鏈RNA病毒[2]。病毒粒子無囊膜，約為70 nm，呈24面體對稱，具有雙層衣殼結構，病毒基因組由10個基因組片段組成，根據(jù)基因組在PGAE電泳中的遷移率不同，可分為3個長片段(L1、L2、L3)，3個中片段(M1、M2、M3)和4個小片段(S1、S2、S3、S4)[3]。除了S1片段以外其他的基因片段均只含有1個開放閱讀框，分別編碼1種蛋白，L組編碼λ蛋白(λ1、λ2、λ3)，M組編碼μ蛋白(μ1、μ2、μ3)，S組S2、S3、S4分別編碼σA、σB、 σNS蛋白，S1基因片段具有多順反子結構，包含3個重疊的開放閱讀框并編碼σC、P10、P17蛋白[4]。NDRV S1片段的多順反子結構與MDRV差異較大，且MDRV的p10和σC蛋白由最小的基因組節(jié)段S4編碼，并且不編碼p17蛋白，因此NDRV 在基因組序列上與其他禽源呼腸孤病毒存在較大差異[5]。

近年來，我國川渝地區(qū)鴨場中多發(fā)以肝臟、脾臟出血、壞死為主要特征的傳染性疾病，病死率達30%，其特征與NDRV病相似。因此，為明確該病的致病原及其分子特征，本試驗對四川省隆昌地區(qū)的患病鴨進行了病毒的分離、鑒定與全基因組的測定分析，以期為該病的防控提供必要的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 病毒的分離無菌采集四川省隆昌某鴨場5只具有典型脾臟壞死的花邊鴨病料(肝臟和脾臟)，剪碎混勻，加入無菌PBS液研磨為勻漿液，于-20℃ 和4℃反復凍融3次，12 000 r/min離心15 min 取上清液，用孔徑為0.22 μm的一次性濾芯過濾除菌，將濾液經(jīng)尿囊腔按0.2 mL/枚接種11日齡SPF鴨胚8枚，同時設置8枚作為對照組注射等量無菌生理鹽水，用蠟封孔，37℃靜置孵育。將接種病料后24～120 h內(nèi)死亡的鴨胚和對照組鴨胚于4℃冷藏2 h后收集尿囊液，將收集的尿囊液按1∶10的比例加入氯仿后12 000 r/min離心取上清，同樣用0.22 μm濾芯過濾除菌后分裝于-80℃保存，將其命名為F1代。將F1代尿囊液按照同樣的方法接種于一批新的SPF鴨胚，依次傳代(標記為Fn)，直到感染鴨胚出現(xiàn)規(guī)律性死亡，剖解死亡鴨胚并記錄病理變化。

1.2 病原的RT-PCR鑒定參考相關文獻[6]，根據(jù)NDRV S1基因序列的保守區(qū)域設計合成1對特異性引物，上游F：5′-TGAGACGCCTGACTACGA-TT-3′，下游R：5′-ATGCTTGGAGTGAGACGA-CT-3′，預期擴增片段大小為380 bp，引物由華大基因科技公司合成。取1.1保存的組織勻漿液和尿囊液，分別用EasyPure Viral DNA/ RNA提取試劑盒(ER201-01，北京全式金)提取其總RNA并反轉錄為cDNA，按如下體系和條件進行擴增。PCR反應體系(25.0 μL)：模板3 μL，10 pmol/L上、下游引物各1.0 μL，Premix Taq 12.5 μL，無菌ddH2O 7.5 μL。PCR擴增程序：94℃預變性5 min；94℃ 40 s，55℃ 40 s，72℃ 45 s，共33個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存，將PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測后回收目的片段，送華大基因科技有限公司進行測序。

1.3 全基因組序列的測定病毒全基因組的測定由上海凌恩生物科技有限公司完成。其主要步驟為：取1.1中保存的尿囊液提取總RNA，利用紫外分光光度計檢測其純度，使其D260/D280值在1.8～2.0之間以制備測序文庫。以1 μg 總 RNA起始量建庫，首先使用Illumina的TruseqTMRNA sample prep Kit專用片段化緩沖溶液將RNA片段化，接著用隨機寡核苷酸合成第1條鏈后混合DNA聚合酶Ⅰ和RNase H合成雙鏈cDNA。然后通過核酸外切酶/聚合酶將cDNA突出端補平，并在3′端連接上index接頭，使用Illumina聚合酶鏈反應引物混合物在15個循環(huán)的聚合酶鏈反應中選擇性富集兩端連接有銜接分子的DNA片段，于2%的瓊脂糖膠回收長度約150 bp的目的條帶,然后利用TBS380(picogreen)對回收的基因片段進行定量，在cBot Truseq PE Cluster Kit v3-cBot-HS上進行橋式擴增，然后將擴增得到的片段在Illunima novaseq 6000測序平臺進行300個循環(huán)測序獲得原始NGS數(shù)據(jù)。過濾低質(zhì)量測序數(shù)據(jù)，利用DNAStar軟件對過濾后的測序數(shù)據(jù)進行組裝。將最終測序得到的基因序列上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫。

1.4 同源性和遺傳進化分析利用DNAStar軟件和NCBI網(wǎng)站中BLAST功能對測序完成的病毒基因組進行同源性的分析比對；利用MEGA X軟件中的Neighbor-Joining法構建進化樹(bootstrap值500)，分別構建10個基因組片段的禽類呼腸孤病毒的系統(tǒng)發(fā)育樹，分析分離株在遺傳進化樹上與其他禽類呼腸孤病毒之間的差異。

1.5 分離毒株對鴨胚的致病性試驗取1.1中最新一代尿囊液，按10倍梯度進行系列稀釋，取10-4，10-5，10-6和10-74個稀釋度，每個稀釋度接種5枚9～11日齡SPF鴨胚，每枚絨毛尿囊腔接種0.2 mL，37℃培養(yǎng)，連續(xù)觀察120 h，根據(jù)Reed-Muench法，計算分離毒的ELD50。

1.6 分離毒株對雛鴨的致病性試驗20只7日齡健康花邊鴨隨機分成攻毒組和陰性對照組，每組10只。攻毒組：取1.1中保存的最新一代尿囊液，按照0.3 mL(2×ELD50)/只劑量肌肉注射10只健康花邊鴨；陰性對照組：每只肌肉注射0.3 mL無菌生理鹽水。攻毒后連續(xù)觀察10 d，記錄鴨發(fā)病和死亡的情況。取發(fā)病鴨脾臟和肝臟進行組織切片，HE染色后觀察其組織病理學變化。

2 結果

2.1 病毒的分離病料接種后的鴨胚在第6代時出現(xiàn)規(guī)律性死亡，死亡高峰期集中在72 h左右。F6代鴨胚全部死亡，死亡鴨胚主要表現(xiàn)為胚體出血，尤以腿和內(nèi)臟器官最明顯(圖1A、B)，部分胚體明顯發(fā)育不良(圖1B、E)。肝臟、脾臟、頭部出血明顯(圖1C、D)。腿部嚴重出血(圖1E)。對照組均未出現(xiàn)異常癥狀(圖1F)。

A～E.均為攻毒組鴨胚(A可見頭部，內(nèi)臟器官出血；B和E中鴨胚發(fā)育受阻，腿部出血嚴重；C和D中鴨胚脾臟嚴重出血)；F.為未接毒的陰性對照，發(fā)育正常

2.2 病原的RT-PCR鑒定對勻漿液和尿囊液進行RT-PCR擴增，均擴增出約為380 bp的目的條帶 (圖2)，與預期大小相符。將測序結果與GenBank數(shù)據(jù)庫進行比對，結果顯示該病毒為NDRV，將其命名為SL株。

M.DL2000 DNA Marker;1.病料樣本檢測結果;2.F6代尿囊液檢測結果

2.3 分離毒株SL株全基因組的測序結果測序結果顯示，SL株基因組全長23 580 bp，G+C含量為49.62%，共由10個基因組片段組成，分別為S1～S4，其中S1 1 534 bp、S2 1 351 bp、S3 1 186 bp、S4 1 175 bp；M1～M3片段中M1 2 249 bp、M2 2 141 bp、M3 2 022 bp；L1～L3片段中L1 3 919 bp、L2 3 827 bp、L3 4 176 bp。將測序得到的全基因組序列上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫，其登錄號分別為MW196679～MW196688。其中S1基因為多順反子,含有3個重疊的ORF閱讀框，分別編碼3種蛋白(σC、P10、P17)，其他片段各含1個完整的ORF，編碼1種蛋白，SL株的所有節(jié)段與其他禽類呼腸孤病毒都具有相同的5′-GCUUUUU…UCAUC-3′末端保守序列(表1)。

表1 SL株基因組信息

2.4 全基因序列的同源性和遺傳進化分析結果將測序得到含有10個基因節(jié)段的全基因組序列用DNAStar軟件和NCBI的BLAST功能分別進行比對，結果顯示：SL株與NDRV、MDRV、GRV (03G株)、ARV的同源性分別為87.20%～99.48%，80.09%～98.77%，87.38%～95.90%和70.04%～91.15%，與NDRV毒株的同源性最高，與ARV毒株的同源性最低。其中與S1、S4、L2、L3等4個片段同源性最高的均是NDRV的GX-Y7株(分別為99.48%，99.23%，98.76%，98.44%)，與S2、S3、M3等3個片段同源性最高的均是NDRV的XT18株(分別為99.38%，99.15%，98.98%)。與M2片段同源性最高的是NDRV的SY株(98.55%)，與M1片段同源性最高的是NDRV的HN5D株(98.00%)。只有L1片段與MDRV的SH12株同源性最高(98.19%)。在與所有參考毒株的比對結果中，GX-Y7株和XT18株與SL株同源性最高，相比之下，SL株與ARV的同源性最高僅為91.15%。

A～C.L基因片段(L1～L3)的系統(tǒng)進化樹;D～F.M基因片段(M1～M3)的系統(tǒng)進化樹;G～J.S基因片段(S1～S4)的系統(tǒng)進化樹。紅色圓點標記的為本試驗分離毒株SL株

將測序得到的10個全基因組序列利用MEGA X軟件中的Neighbor-Joining法構建進化樹，bootstrap設置為500，分別構建禽類呼腸孤病毒的系統(tǒng)發(fā)育樹，分析SL株全基因序列在遺傳進化樹上與其他禽類呼腸孤病毒之間的差異。結果顯示，參與比對的所有禽類呼腸孤病毒的基因組序列主要分為2個大類的進化支，即ARV主干支和MDRV、NDRV共同構成的主干支。在所有遺傳進化樹中，SL株的10個基因節(jié)段均位于MDRV和NDRV構成的主干支中，除了M1和L1片段的進化樹里面有MDRV的DH13株和SH12株外，其他所有的基因節(jié)段均與NDRV位于同分支。在SL株的所有遺傳進化樹中，L3、M2、 S2、 S3片段均與XT18株位于同一分支，遺傳位置關系最近(圖3C，E，H，I)。S1和S4片段則始終與GX-Y7株位于同一分支，遺傳位置最近(圖3G，J)，在L1、L2、M2片段的遺傳進化樹中，SY株、XT18株、GX-Y7株、DH13株、SH12株與L1片段位于同一大分支(圖3A，B，E)，M2片段與SY株位于另一個同分支(圖3E)，L2片段則與GX-Y7株和XT18株位于同一分支，且與XT18株的遺傳位置最近 (圖3B)。在所有的遺傳進化樹中，只有M1片段與MDRV源的DH13株在1個單獨的分支上，兩者遺傳位置最近，且與NDRV源的SY株的遺傳位置最近(圖3D)。

2.5 對鴨胚的致病性試驗接種后24 h內(nèi)均無鴨胚死亡。在24～120 h內(nèi)，10-4接種組5枚鴨胚均死亡，10-5接種組共死亡3枚，10-6接種組共死亡1枚，10-7接種組無死亡。根據(jù)Reed-Muench法，分離毒SL株的ELD50為10-5.32/0.2 mL。

2.6 對雛鴨的致病性試驗SL株感染4 d后有2只雛鴨出現(xiàn)精神沉郁、趴伏、拉黃綠色稀便，6 d后死亡4只，其中1只角弓反張(圖4A)，其余6只在觀察期內(nèi)均存活，但表現(xiàn)精神萎靡，食欲減退。可見其發(fā)病率為100%，病死率為40%。剖檢病死鴨可見肝臟出血，脾臟腫大、壞死(圖4B，C)。對照組均表現(xiàn)正常。

A.感染SL株死亡鴨；B.感染鴨的肝臟出血；C.感染鴨的脾臟腫大出血。箭頭指示角弓反張

感染發(fā)病鴨肝臟、脾臟的組織病理學觀察顯示：雛鴨肝臟細胞的正常結構模糊不清，出現(xiàn)肝臟細胞腫脹、空泡變性(圖5A)，血竇彌漫性出血，局部門管區(qū)有少量淋巴細胞及異嗜粒細胞浸潤(圖5B)；脾臟白髓嚴重萎縮、淋巴細胞壞死，紅髓輕度淤血(圖5C)，脾臟靜脈出現(xiàn)混合性血栓(圖5D)。

A．肝臟病理切片(×400)，箭頭指示肝細胞空泡變性；B.肝臟病理切片(×100)，箭頭指示淋巴細胞及異嗜粒細胞浸潤；C.脾臟病理切片(×400)，箭頭指示白髓萎縮，淋巴細胞壞死；D.脾臟病理切片(×100)，箭頭指示脾靜脈出現(xiàn)混合性血栓

3 討論

ARV自1954年在患有慢性呼吸道疾病的雛雞中被發(fā)現(xiàn)以來，世界多個國家如美國、意大利、新西蘭、巴西、阿根廷等都有發(fā)生，呈世界性分布[6]。然而近年來，許多國家又報道了具有不同致病特點的ARV變異株，最為突出就是感染鴨的新型呼腸孤病毒，2011年前后該病在我國大面積暴發(fā)，其最為典型的特征是引起鴨脾臟的出血、壞死，俗稱“脾壞死病”，病死率35%～40%[7]，與以往ARV、MDRV所引起的癥狀有較大差異，嚴重威脅著家禽養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。本試驗中四川隆昌地區(qū)發(fā)病鴨的臨床癥狀與以往報道的新型呼腸孤病毒感染病例非常相似，鑒于川渝地區(qū)是我國水禽養(yǎng)殖較為密集的地區(qū)，疾病發(fā)生造成的損失較大，因此本試驗對該地區(qū)典型病例進行了病毒的分離、鑒定及致病性研究。

鴨胚傳代是經(jīng)典的毒株分離手段之一，通過連續(xù)傳代讓病毒逐漸適應鴨胚產(chǎn)生規(guī)律性死亡，從而達到分離病毒的目的。試驗采用此方法成功分離到毒株，經(jīng)鑒定證實是新型呼腸孤病毒。通過對鴨胚和雛鴨的致病性試驗發(fā)現(xiàn)該毒株的毒力較強，對鴨胚的ELD50為10-5.32/0.2 mL，與陳宗艷等[8]報道的TH11毒株相比，兩者毒力相當。雛鴨的致病性試驗能夠復制出典型的臨床癥狀，用2倍ELD50劑量攻毒能導致40%的病死率，提示該毒株應屬于強毒株。雛鴨感染后肝臟、脾臟的組織病理學變化也充分驗證了這一點，其中肝臟細胞表現(xiàn)為腫脹、空泡變性，脾臟白髓嚴重萎縮、淋巴細胞壞死，其病理變化與之前報道[9]一致，符合強毒的病理特征。目前已將該毒株提交武漢大學保藏中心保藏，毒種保藏號CCTCC(NO.V201970)，以期為后續(xù)的生物制品開發(fā)提供前期基礎。

SL株全基因組測序顯示該病毒與ARV、NDRV基因組結構相似，均由10個片段組成，在每個片段的起始端和末端都具有禽正呼腸孤病毒特有的5′-GCUUUUU…UCAUC-3′保守序列。10個基因組片段分別編碼λA(L1)、λB(L2)、λC(L3)、μA(M1)、μB(M2)、μC(M3)、σA(S2)、σB(S3)、σNS(S4)、σC、P10、P17(S1)，根據(jù)SL株S1編碼3個蛋白，與MDRV 僅編碼σC和P10 2個蛋白不同，說明SL株是區(qū)別于以往MDRV的1種新型呼腸孤病毒。

對SL株的10個基因組片段進行同源性分析顯示，該毒株與NDRV的同源性最高(87.02%～99.48%)，親緣關系最近，而與ARV的同源性最低(91.15%～70.04%)，親緣關系最遠。系統(tǒng)進化樹顯示，SL株與MDRV和NDRV構成一個主干支，而ARV另為一個獨立的干支。在MDRV和NDRV構成的主干支里，SL株與GX-Y7和XT18兩個NDRV毒株具有較近的親緣關系，進一步說明SL株為一新型呼腸孤病毒。同時發(fā)現(xiàn)SL株中M1片段和L1片段與SH12和DH13兩個MDRV毒株也具有較高的進化地位，推測SL株或許存在MDRV和NDRV基因重組現(xiàn)象，這在禽源呼腸孤病毒中并不少見，其原因應與RNA 聚合酶缺乏矯正功能，因而分節(jié)段的RNA 病毒容易發(fā)生基因重組和抗原變異，與王劭等[10]得出的結論一致。

綜上，本試驗通過對臨床樣本的分離鑒定和SL毒株全基因組的測定以及致病性研究，確定新型呼腸孤病毒為致病原，該病毒與以往MDRV、ARV有較大差異。本試驗結果可為鴨呼腸孤病毒病的防控及其特異性生物制品的研發(fā)奠定基礎。