飼料中黃曲霉毒素B1對(duì)克氏原螯蝦幼蝦生長、飼料利用和肝胰腺組織結(jié)構(gòu)的影響

黃 瑩 郭雅哲 婁格格 滿 洲 葛汝祥 朱曉鳴 向 勇 陳新華

(1.福建農(nóng)林大學(xué)海洋學(xué)院, 福建省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 福州 350002; 2.中國科學(xué)院水生生物研究所淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430072)

霉菌毒素是天然存在的一類毒性物質(zhì), 特別是黃曲霉毒素(AFT), 系真菌曲霉的有毒代謝產(chǎn)物, 具有強(qiáng)致癌性[1]。根據(jù)熒光分析, AFT分為B族和G族兩大類及其衍生物, 目前已分離鑒定出20多種。飼料原料中常見的AFT主要有AFB1、AFB2、AFG1和AFG2, 其中AFB1的毒性作用最強(qiáng)[2], 廣泛存在于霉變的食物和飼料中。長期攝入含有AFT的飼料可引發(fā)動(dòng)物發(fā)生肝癌, AFB1目前被公認(rèn)為致癌能力最強(qiáng)的天然毒素, 已被證實(shí)還具有致畸、致細(xì)胞突變等作用[3]。AFB1污染是一個(gè)全球性的問題, 尤其以熱帶及亞熱帶地區(qū)最為嚴(yán)重, 而這些地方的水產(chǎn)養(yǎng)殖量約為全球年產(chǎn)量的80%[4]。王倩等[5]對(duì)全國471份飼料原料及飼料的調(diào)查報(bào)告中顯示, 所有樣品中AFB1檢出率為87.69%, 檢出最高值為107.27 μg/kg; 其中配合飼料中AFB1檢出率為79.31%, 檢出最高值為67.12 μg/kg。根據(jù)《無公害食品漁用配合飼料安全限量》的規(guī)定, 我國漁用配合飼料中AFB1含量不得高于10 μg/kg[6]。

國內(nèi)外已有關(guān)于AFB1對(duì)部分水生動(dòng)物影響的報(bào)道[7—10], 不同品種對(duì)AFB1的敏感性差異較大[4]。有研究表明AFB1可直接攻擊蝦的肝胰腺, 對(duì)肝胰腺消化、代謝和解毒功能造成損傷, 進(jìn)而破壞營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和儲(chǔ)存功能[11—14]。用含有AFB1<20 μg/kg的飼料飼喂南美白對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)10d, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)蝦死亡數(shù)量顯著升高[15]。用含AFB150 μg/kg的飼料飼喂南美白對(duì)蝦14d后, 肝胰腺組織出現(xiàn)異常; 當(dāng)AFB1濃度達(dá)到400 μg/kg時(shí), 蝦的生長速度明顯被抑制; 當(dāng)AFB1濃度高達(dá)900 μg/kg時(shí), 蝦的消化率水平明顯降低[16]。當(dāng)飼料中天然AFT含量為1000 μg/kg時(shí), 南美白對(duì)蝦幼蝦存活率顯著降低[13]。另有研究表明, 斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeus monodonFabricius)稚蝦攝食AFB1水平超過75 μg/kg的飼料2個(gè)月后體重顯著降低[17]。與此相對(duì), Boonyaratpalin等[18]對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦研究發(fā)現(xiàn), AFB1在50—100 μg/kg時(shí), 蝦生長不受影響; 而當(dāng)AFB1濃度高達(dá)500 μg/kg以上時(shí), 幼蝦死亡率才會(huì)增加。

克氏原螯蝦(Procambarus clarkii), 是一種深受消費(fèi)者歡迎的養(yǎng)殖蝦類, 其肉質(zhì)爽嫩, 味道鮮美。近幾年, 克氏原螯蝦產(chǎn)業(yè)呈幾何式增長, 現(xiàn)已成為我國最火爆的餐飲食品之一, 而關(guān)于它的食品安全問題也引起我國消費(fèi)者的高度重視[19]。克氏原螯蝦產(chǎn)業(yè)的發(fā)展同時(shí)促進(jìn)了克氏原螯蝦配合飼料的飛速增長, 推進(jìn)克氏原螯蝦產(chǎn)業(yè)繼續(xù)升溫的關(guān)鍵在于其專用飼料的開發(fā)[20]。大豆、玉米和花生等谷物是克氏原螯蝦養(yǎng)殖生產(chǎn)中常用的飼料原料[21], 而這些原料容易霉變產(chǎn)生高濃度的AFB1[7], 且飼料運(yùn)輸和保存不當(dāng)也容易發(fā)生霉變。有報(bào)道表明在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中, 受AFB1污染的飼料可能不會(huì)被丟棄而仍然可能用于飼養(yǎng)動(dòng)物[11]。AFB1污染已被確定為水產(chǎn)養(yǎng)殖面臨的一個(gè)重要問題, 不僅會(huì)造成經(jīng)濟(jì)損失, 還會(huì)引起各種魚病并發(fā)癥[7], 此外AFB1在水產(chǎn)動(dòng)物中的殘留可能會(huì)通過食物鏈的富集作用對(duì)人類健康產(chǎn)生威脅。目前有關(guān)水產(chǎn)AFB1的研究主要集中在魚類和部分海水蝦類上[22], 對(duì)淡水蝦類的相關(guān)探究較少, 鮮見AFB1對(duì)克氏原螯蝦的相關(guān)報(bào)道。本文旨在研究AFB1對(duì)克氏原螯蝦的生長、飼料利用、抗氧化能力、肝胰腺組織學(xué)和毒素積累的影響, 探討飼料中AFB1對(duì)克氏原螯蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的潛在危害。

1 材料與方法

1.1 養(yǎng)殖系統(tǒng)

實(shí)驗(yàn)養(yǎng)殖系統(tǒng)由16個(gè)矩形塑料(pp)養(yǎng)殖箱(100 cm×50 cm×50 cm) 組成, 養(yǎng)殖水深15 cm。每天上午和晚上各測1次水溫和室溫, 每2周測1次水體溶氧和氨氮水平。在整個(gè)養(yǎng)殖過程, 水溫保持在19—22℃。養(yǎng)殖用水經(jīng)充分曝氣, 溶氧含量6 mg/L以上, 氨氮含量<0.4 mg/L。光照周期為8﹕30到20﹕30。

1.2 實(shí)驗(yàn)飼料及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)飼料的配方和常規(guī)化學(xué)成分如表1所示。按設(shè)計(jì)濃度0、10、100和1000 μg/kg添加相應(yīng)量AFB1母液制成4種實(shí)驗(yàn)飼料, 各組飼料中AFB1的實(shí)際測定值分別為2.53、13.25、99.73和966.36 μg/kg。毒素梯度的設(shè)計(jì)參考已有的黃曲霉毒素對(duì)其他水產(chǎn)動(dòng)物的有關(guān)報(bào)道[12,13,23,24]。添加的AFB1購自美國Sigma公司, 首先溶于魚油配制成濃度為500 μg/mL的母液, 然后按照設(shè)計(jì)值添加相應(yīng)量到各組實(shí)驗(yàn)飼料中。將所有飼料原料過40目篩后, 按照從小到大的順序逐次添加并混勻, 之后使用飼料機(jī)(SLP-45, 上海華夏漁業(yè)機(jī)械儀器工貿(mào)公司)制作成直徑1 mm大小的顆粒, 并在60℃環(huán)境中烘干后放置在–20℃冰箱備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)魚與飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

克氏原螯蝦蝦苗采購于湖北省萊克集團(tuán)小龍蝦良種選育中心。在正式實(shí)驗(yàn)開始前, 克氏原螯蝦蝦苗放到室內(nèi)養(yǎng)殖系統(tǒng)中暫養(yǎng)3周后進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn),暫養(yǎng)期間投喂實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)飼料(飼料配方見表1)。在正式實(shí)驗(yàn)開始時(shí), 先讓克氏原螯蝦幼蝦禁食24h, 挑取外觀健壯、體格相近的克氏原螯蝦幼蝦[平均體重(0.382±0.005) g]隨機(jī)放入16個(gè)養(yǎng)殖水箱, 每箱16尾。共設(shè)置4個(gè)實(shí)驗(yàn)組, 每組設(shè)置4個(gè)平行。實(shí)驗(yàn)期間, 每天分別于9:00、17:00和22:00 投喂飼料。每天記錄攝食量, 實(shí)驗(yàn)持續(xù)42d。每天用虹吸管清除殘餌和排泄物, 換水1/3。清理死蝦, 記錄其體長和體重。

表1 實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)飼料配方及化學(xué)組成(%干物質(zhì))Tab.1 Diet formulation and chemical composition of experimental diets (% in dry matter)

1.4 實(shí)驗(yàn)取樣

在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí), 克氏原螯蝦禁食24h, 稱取每缸蝦的體重并記錄。每缸隨機(jī)取3尾在冰盤上解剖出肝胰腺, 放入凍存管中經(jīng)液氮急凍, 然后轉(zhuǎn)移到–80℃冰箱中保存, 用作酶的測定。取肝胰腺分別用中性甲醛和戊二醛固定后進(jìn)行組織切片制作。剩余所有幼蝦冷凍干燥后用于AFB1含量分析。

1.5 樣品的測定

本實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)飼料中干物質(zhì)、粗蛋白、粗脂肪和灰分的含量測定參照文獻(xiàn)[25]的方法進(jìn)行。飼料干物質(zhì)在105℃下烘干至恒重, 通過失重法測定。飼料粗蛋白含量使用凱氏定氮儀(Kjeltec8400,FOSS)測定。飼料粗脂肪含量使用索氏抽提儀(ST243, FOSS)進(jìn)行測定。飼料樣品在馬福爐中550℃燃燒3h, 以失重法測定灰分。

采用南京建成生物工程研究所的試劑盒測定肝胰腺中堿性磷酸酶(AKP)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)活性和丙二醛(MDA)含量。實(shí)驗(yàn)飼料和克氏原螯蝦幼蝦全蝦AFB1含量經(jīng)甲醇水溶液(55﹕45)和石油醚(沸程為60—90℃)提取后采用ELISA法[4,25,26]進(jìn)行測定(試劑盒購自北京百靈康源生物公司)。取剩余所有克氏原螯蝦幼蝦全蝦蝦體冷凍干燥, 干燥后的全蝦樣品和飼料均研磨成粉末, 每組樣品測定3次。飼料和全蝦蝦體中的AFB1的提取方法如下: 取樣品置于帶塞錐形瓶中,加入甲醇水溶液和石油醚, 加塞水封后振蕩30min,并用快速濾紙過濾。加入三氯甲烷, 將提取液一并濾于蒸發(fā)皿中, 65℃水浴蒸干。分3次準(zhǔn)確加入20%甲醇-PBS將凝結(jié)物充分溶解后得到AFB1提取液, 4℃保存。取稀釋后的抗體與AFB1提取液在小管內(nèi)混合后(樣品反應(yīng)液)靜置待用, 取試劑盒中的酶標(biāo)板分別加入陰性對(duì)照、樣品反應(yīng)液及空白對(duì)照液, 37℃孵育箱中恒溫孵育, 120min取出酶標(biāo)板,倒掉反應(yīng)液, 用PBST洗液洗板后加入經(jīng)稀釋后的酶標(biāo)二抗, 37℃孵育60min后取出酶標(biāo)板, 倒掉反應(yīng)液, 用PBST洗板。將顯色液加入酶標(biāo)板, 37℃孵育15min后加入終止液。用酶標(biāo)儀(Power-Wave XS,BioTek Instruments, Inc., VT, USA)在490 nm下準(zhǔn)確讀取吸光值, 根據(jù)OD值及標(biāo)準(zhǔn)曲線求出AFB1含量。AFB1檢測限為0.1 μg/kg。

取小塊固定后的肝胰腺組織, 將其放于常規(guī)梯度酒精中脫水, 使用二甲苯作為透明劑, 使用石蠟進(jìn)行包埋, 切片的厚度為7 μm, 進(jìn)行HE染色后脫水后使用中性樹膠進(jìn)行封片。使用光學(xué)顯微鏡(Leica, DM 1000, GERMENY)和顯微鏡用科學(xué)數(shù)碼照相機(jī)(SPOT Insight 4 mp CCD scientific color digital camera, USA)獲取圖像。將固定在戊二醛固定液中的組織取出, 使用冷的0.1 mol/L濃度磷酸緩沖液洗滌3次, 放入1%鋨酸中固定2h后, 再進(jìn)行丙酮梯度脫水, 使用618環(huán)氧樹脂對(duì)其進(jìn)行包埋, 切片采用的是瑞典LKB-5型超薄切片機(jī), 之后將切片轉(zhuǎn)移至銅網(wǎng)使用醋酸鈾-枸櫞酸鉛進(jìn)行雙重染色, 最后采用日本JEM-100X透射電鏡進(jìn)行觀察并拍攝照片。

1.6 數(shù)據(jù)處理

利用以下公式計(jì)算存活率、攝食率、飼料效率和特定生長率:

式中,W1為平均初始體重(g),W2為平均終末體重(g),t為實(shí)驗(yàn)天數(shù)(d),I為攝食量(g)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS Statistics 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)一元方差分析(One-way ANOVA)后, 用Duncan’s 進(jìn)行多重比較, 當(dāng)P<0.05時(shí), 為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 飼料中AFB1水平對(duì)克氏原螯蝦幼蝦存活和生長的影響

如表2所示, 對(duì)照組克氏原螯蝦幼蝦存活率為87.50%, 10 μg/kg毒素組存活率與對(duì)照組無顯著差異(P>0.05), 100和1000 μg/kg毒素組存活率均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。克氏原螯蝦幼蝦攝食率隨AFB1濃度增加呈下降趨勢, 10 μg/kg毒素組克氏原螯蝦幼蝦攝食率與對(duì)照組無顯著差異(P>0.05),100和1000 μg/kg毒素組克氏原螯蝦幼蝦攝食率顯著低于對(duì)照組和10 μg/kg毒素組(P<0.05)。10 μg/kg毒素組克氏原螯蝦幼蝦終末體重、特定生長率和飼料效率與對(duì)照組無顯著差異(P>0.05), 100和1000 μg/kg毒素組終末體重、特定生長率和飼料效率顯著低于對(duì)照組和10 μg/kg毒素組(P<0.05)。

表2 飼料AFB1水平對(duì)克氏原螯蝦幼蝦生長和飼料利用的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)＊Tab.2 Effects of dietary AFB1 on growth performance and feed utilization of juvenile red swamp crayfish (mean±SE) *

2.2 飼料AFB1水平對(duì)克氏原螯蝦幼蝦抗氧化指標(biāo)的影響

如表3所示, 克氏原螯蝦幼蝦AKP活性隨著飼料中AFB1水平升高呈上升趨勢, 10 μg/kg毒素組克氏原螯蝦幼蝦AKP活性與對(duì)照組無顯著差異(P>0.05),100和1000 μg/kg毒素組AKP活性均顯著高于對(duì)照組和10 μg/kg毒素組(P<0.05), 1000 μg/kg毒素組AKP活性顯著高于100 μg/kg毒素組(P<0.05)。100和1000 μg/kg毒素組ALT和AST活性顯著高于對(duì)照組和10 μg/kg毒素組(P<0.05), 10 μg/kg毒素組ALT和AST活性與對(duì)照組間無顯著差異(P>0.05)。10 μg/kg毒素組克氏原螯蝦幼蝦CAT、GSH-Px、GST活性和MDA含量與對(duì)照組無顯著差異(P>0.05), SOD活性顯著低于對(duì)照組(P<0.05); 100和1000 μg/kg毒素組CAT、SOD、GSH-Px和GST活性均顯著低于對(duì)照組(P<0.05) , MDA含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

表3 飼料AFB1水平對(duì)克氏原螯蝦肝胰腺生化指標(biāo)的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)Tab.3 Effects of dietary AFB1 on biochemical indexes of juvenile red swamp crayfish (mean±SE)

2.3 飼料中AFB1水平對(duì)克氏原螯蝦幼蝦肝胰腺組織學(xué)的影響

如圖1所示, 對(duì)照組克氏原螯蝦幼蝦肝胰腺外觀正常, 肝細(xì)胞排列整齊, 肝小管管腔星狀結(jié)構(gòu)清晰, 基底膜和上皮細(xì)胞連接緊密, 細(xì)胞間連接致密。10 μg/kg AFB1毒素組B細(xì)胞略微增大, R細(xì)胞數(shù)量減少, 星狀管腔與對(duì)照組相似。100 μg/kg毒素組肝小管部分管腔星狀結(jié)構(gòu)消失, 肝細(xì)胞排列不規(guī)則, R細(xì)胞萎縮且數(shù)量進(jìn)一步減少, B細(xì)胞明顯增大,部分細(xì)胞溶解。1000 μg/kg毒素組肝小管失去正常結(jié)構(gòu), 部分管腔變性, 星狀結(jié)構(gòu)消失, R細(xì)胞數(shù)量減少, B細(xì)胞進(jìn)一步增大且數(shù)量明顯增多, 部分肝細(xì)胞腫脹和破裂, 基膜部分區(qū)域溶解, 細(xì)胞碎片和內(nèi)容物漏出, 出現(xiàn)明顯病變特征。

圖1 飼料中AFB1對(duì)克氏原螯蝦幼蝦肝胰腺組織學(xué)的影響(H&E)Fig.1 Hepatopancreas of juvenile red swamp crayfish fed with diets containing AFB1 (H&E)

2.4 飼料中AFB1水平對(duì)克氏原螯蝦幼蝦肝胰腺超微結(jié)構(gòu)的影響

如圖2所示, 飼喂不同濃度AFB1的克氏原螯蝦的肝胰腺細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)有明顯區(qū)別, 且隨濃度的增加病變愈為明顯。對(duì)照組細(xì)胞核完整, 粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)規(guī)則均勻地排列在細(xì)胞核邊緣, 線粒體正常, 油滴均勻分布。10 μg/kg毒素組部分線粒體腫脹, 溶酶體增多。100 μg/kg毒素組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、腫脹, 出現(xiàn)很多白色囊泡, 核膜擴(kuò)張, 核染色質(zhì)聚在細(xì)胞核一側(cè), 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹擴(kuò)張嚴(yán)重, 線粒體腫脹, 脂滴融合變大。1000 μg/kg毒素組油滴聚集把細(xì)胞核擠到一側(cè), 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)斷裂, 油滴巨大, 囊泡多, 細(xì)胞崩解, 細(xì)胞核消失, 自噬體聚集, 溶酶體聚集在自噬體周圍, 囊泡增多變大, 聚集在一起; 基本無完整的細(xì)胞核結(jié)構(gòu), 線粒體腫脹。

圖2 飼料中AFB1對(duì)克氏原螯蝦幼蝦肝胰腺超微結(jié)構(gòu)的影響Fig.2 Ultrastructure of hepatopancreas of juvenile red swamp crayfish fed with diets containing AFB1

2.5 飼料AFB1水平對(duì)克氏原螯蝦幼蝦積累水平的影響

在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí), 攝食AFB1≤100 μg/kg的克氏原螯蝦幼蝦蝦體均未檢測出AFB1(AFB1檢測限為0.1 μg/kg), 僅在1000 μg/kg毒素組中檢測出(1.65±0.22) μg/kg的AFB1。

3 討論

3.1 飼料中AFB1水平對(duì)克氏原螯蝦幼蝦存活和生長的影響

AFB1是一種劇毒物質(zhì), 高劑量AFB1對(duì)水生動(dòng)物有致癌、致畸和致突變等基因毒性, 易導(dǎo)致動(dòng)物死亡; 而低劑量AFB1會(huì)因累積效應(yīng)導(dǎo)致水生動(dòng)物機(jī)體慢性中毒, 阻礙生長發(fā)育, 造成水產(chǎn)動(dòng)物體表黃化、行為異常、食欲下降和體重減輕等[25,27,28]。

存活率下降和生長抑制被認(rèn)為是AFB1對(duì)水生動(dòng)物的主要毒性作用[29]。飼料中2500 μg/kg AFB1會(huì)顯著降低斑節(jié)對(duì)蝦的存活率和生長性能, 其含量與存活率、平均末重和體重增加呈高度負(fù)相關(guān)[18]。不同AFB1濃度(19—1641 μg/kg)對(duì)羅非魚(Oreochromis niloticus×O.aureus)20周的存活率無顯著影響, 僅在AFB1高劑量組(>380 μg/kg)觀察到厭食、體表黃變、體重減輕和飼料效率降低[4]。飼喂含AFB1飼料的頭石脂鯉(Brycon cephalus) 180d, 對(duì)照組、10、20和50 μg/kg組的存活率分別為98.9%、99.1%、99.8%和98.0%。推測50 μg/kg高含量組存活率較低是由于AFBO與DNA或RNA之間形成加合物, 抑制蛋白質(zhì)合成, 從而對(duì)免疫系統(tǒng)造成了損害, 但各毒素組的攝食率與對(duì)照組無顯著差異[30]。飼料中AFB1達(dá)1.0 mg/kg時(shí)降低了雜交條紋鱸(Morone chrysops×M.saxatilis)的生長性能, 其中增重率和消化率分別降低了80%和60%[7]。草魚(Ctenopharyngodon idella)攝食25、50、75和100 μg/kg AFB1飼料49d未出現(xiàn)死亡, 但與對(duì)照組相比, 顯著降低了其增重率和特定生長率。該研究認(rèn)為, AFB1降低了草魚的生產(chǎn)性能, 造成了經(jīng)濟(jì)損失[31]。暴露于AFB1的眼斑擬石首魚(Sciaenops ocellatus)表現(xiàn)出“倒U型”的毒物興奮效應(yīng), 即AFB1在高劑量時(shí)對(duì)眼斑擬石首魚表現(xiàn)出負(fù)面影響, 而低劑量時(shí)則表現(xiàn)為有益的現(xiàn)象。在該研究中, AFB1為0.01 mg/kg時(shí)增重率、飼料效率和存活率與對(duì)照組相比顯著降低, AFB1為0.5 mg/kg時(shí), 增重率和飼料效率在各毒素組中最高; 當(dāng)AFB1≥1 mg/kg時(shí), 增重率和飼料效率開始呈現(xiàn)下降趨勢[32], 這與Han等[33]對(duì)異育銀鯽(Carassius auratus gibelio)幼魚的研究結(jié)果相似。在本實(shí)驗(yàn)中, 與對(duì)照組相比, 飼料AFB1濃度為100和1000 μg/kg時(shí), 克氏原螯蝦幼蝦的存活率、攝食率、終末體重、特定生長率和飼料效率均顯著低于10 μg/kg組和對(duì)照組, 推測飼料中高劑量的AFB1會(huì)降低飼料適口性, 導(dǎo)致動(dòng)物食欲和采食量下降[34],損傷機(jī)體的消化機(jī)能, 減少吸收利用營養(yǎng)物質(zhì)的能力, 進(jìn)而降低生長性能[27]。

不同蝦類對(duì)AFB1的敏感性不同。用含有25 μg/kg AFB1的飼料飼喂初始體重為0.52 g的南美白對(duì)蝦幼蝦, 會(huì)對(duì)其生長性能造成不良影響[35]。斑節(jié)對(duì)蝦幼蝦對(duì)飼料中的AFB1的耐受水平為52.3 μg/kg[36]。而在對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦成蝦的實(shí)驗(yàn)中, 當(dāng)飼料中AFB1含量達(dá)到2500 μg/kg時(shí)才會(huì)降低其增重率和存活率[18]。當(dāng)飼料中AFB1含量達(dá)到10 μg/kg時(shí)可顯著降低非洲沼蝦(Macrobrachium vollenhovenii)的特定生長率和存活率[37]。在本實(shí)驗(yàn)中, 飼料中AFB1含量≥100 μg/kg時(shí)顯著降低了克氏原螯蝦的生長性能。這可能是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)AFB1的耐受程度受物種、年齡、性別、暴露時(shí)間長短、餌料、實(shí)驗(yàn)條件等因素的影響, 幼年比成年更容易受到影響[3,4,35]。有研究表明, 物種對(duì)AFB1的易感性程度不同, 基本上取決于物種的遺傳易感性, 這在很大程度上取決于生物轉(zhuǎn)化過程中酶的不同編碼基因模式的表達(dá)[38]。

3.2 飼料AFB1水平對(duì)克氏原螯蝦幼蝦抗氧化指標(biāo)的影響

需氧生物體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)主要是由一系列抗氧化酶構(gòu)成的, 而酶活性的高低能夠在一定程度上反映生物體的健康狀況[25,28]。肝臟中的抗氧化酶主要由CAT、SOD和GSH-Px等構(gòu)成, 抗氧化酶可清除或中和自由基以及活性氧(ROS)。CAT是一種通過催化H2O2分解來保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷的抗氧化酶。SOD可以催化超氧陰離子自由基的分解進(jìn)而緩解細(xì)胞內(nèi)DNA的損傷。GSH-Px在生物體內(nèi)普遍存在, 對(duì)于肝臟的保護(hù)和抗肝臟生成過量氧自由基都有一定的作用[29]。GST是與肝臟解毒功能相關(guān)的酶, 當(dāng)AFB1進(jìn)入肝臟后, GST催化其與谷胱甘肽結(jié)合, 并隨膽汁或尿液排出體外[39]; 丙二醛(MDA)作為脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物, 可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激[29]?；狑~(Anguilla marmorata)幼魚攝入1000 μg/kg AFB1后, 肝臟SOD、CAT、GSH-Px和GST活性均顯著降低, MDA含量顯著升高, 說明AFB1可顯著影響花鰻鱺幼魚的抗氧化能力[25]。南美白對(duì)蝦幼蝦1600 μg/kg毒素組肝胰腺中ROS和MDA含量顯著高于對(duì)照組, 而SOD活性顯著低于對(duì)照組, 肝胰腺中MDA含量與SOD活性呈負(fù)相關(guān), 肝胰腺細(xì)胞抗氧化與清除自由基的能力隨飼料中AFB1的增加而減弱[40]。在短期飼喂15 mg/kg AFB1后, 與對(duì)照組相比, 南美白對(duì)蝦肝胰腺中SOD、GST、GSHPx和CAT活性均顯著升高, 表明AFB1誘導(dǎo)了肝胰腺的脂質(zhì)過氧化, 激活了肝胰腺的抗氧化酶系統(tǒng), 進(jìn)而清除過量的ROS并維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡[41],這與Peng等[29]的結(jié)論相似。虹鱒攝入AFB1后(Oncorhynchus mykiss)血清和腸道的CAT及總SOD活性顯著降低, 這與AFB1誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激期間產(chǎn)生的自由基和H2O2的破壞作用有關(guān)[42]。ALT和AST活性是組織損傷和功能障礙的良好生物指示物。喂食AFB112周后, 1000 μg/kg組的鯉(Cyprinus carpio)肝臟AST和ALT活性與對(duì)照組相比顯著升高[43]。AKP是肝臟中具有解毒功能的酶, 當(dāng)肝臟中進(jìn)入大量有毒物質(zhì)時(shí), AKP活性升高發(fā)揮解毒功能[44]。與對(duì)照組相比, 南美白對(duì)蝦AFB1組AKP活性明顯升高, 這可能是由于AFB1引發(fā)了肝胰腺細(xì)胞損傷[45]。飼料中加入AFB1會(huì)增加花鱸AKP和溶菌酶(LZM)活性[8]。在本實(shí)驗(yàn)中, 100和1000 μg/kg組克氏原螯蝦幼蝦的AKP、ALT、AST活性及MDA含量顯著高于10 μg/kg組和對(duì)照組, 而CAT、SOD、GSH-Px和GST活性顯著低于對(duì)照組。表明AFB1造成了克氏原螯蝦幼蝦肝胰腺損傷和抗氧化機(jī)能失衡。

3.3 飼料中AFB1水平對(duì)克氏原螯蝦幼蝦肝胰腺組織學(xué)及超微結(jié)構(gòu)的影響

肝臟是AFB1的主要靶器官, 飼喂AFB1污染的飼料會(huì)導(dǎo)致水產(chǎn)動(dòng)物肝臟發(fā)生嚴(yán)重的組織病理學(xué)變化[25,29,46]。肝臟熒光轉(zhuǎn)基因斑馬魚(Danio rerio)幼魚在暴露于AFB124h后熒光面積顯著降低, 熒光強(qiáng)度在0.4 mg/mL AFB1處理組顯著降低, 說明AFB1在進(jìn)入幼魚體內(nèi)后迅速作用于肝臟器官, 并抑制了肝臟的生長發(fā)育[47]。飼喂AFT的鯉肝細(xì)胞脂肪變性、渾濁腫脹、細(xì)胞質(zhì)空泡形成、肝細(xì)胞壞死、門靜脈組織纖維化、膽管細(xì)胞過度增殖和胰腺細(xì)胞壞死的情況, 這些損傷可影響魚類的生理平衡[48]。用80 μg/kg AFB1飼喂的雜交鱘(Acipenser ruthenus♂×A.baeri♀)幼魚, 肝臟組織出現(xiàn)嗜堿性肝細(xì)胞和多核的腫大肝細(xì)胞, 這是肝臟腫瘤的征兆[49]。用100、500和1000 μg/kg AFB1飼料喂養(yǎng)的南美白對(duì)蝦的肝胰腺出現(xiàn)了明顯的變化, 包括萎縮和不規(guī)則的管狀結(jié)構(gòu), R細(xì)胞和B細(xì)胞的減少[35]。R細(xì)胞和B細(xì)胞的減少可以被視為蝦類受到AFB1毒性損傷的可靠生物標(biāo)志[50]。飼料中AFB1含量的增加導(dǎo)致南美白對(duì)蝦肝胰腺細(xì)胞壞死程度加劇, 細(xì)胞的空泡數(shù)量顯著高于對(duì)照組。AFB1通過破壞對(duì)蝦肝胰腺結(jié)構(gòu)誘發(fā)器官炎癥, 從而破壞器官正常機(jī)能以及抑制其吸收和分泌的功能[51]。

AFB1作用于細(xì)胞會(huì)使胞內(nèi)ROS含量及線粒體膜通透增加。由于線粒體是ROS的主要產(chǎn)生部位,同時(shí)也對(duì)ROS極其敏感, 因此ROS的增加會(huì)對(duì)線粒體造成氧化損傷, 進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡[52]。隨著AFB1濃度的增加, 對(duì)錦鯉(Cyprinus carpio haematopterus)肝細(xì)胞細(xì)胞密度及生長狀態(tài)的影響逐漸增大, 從而造成錦鯉肝細(xì)胞死亡[53]。斑節(jié)對(duì)蝦在飼喂AFB18周后, 肝胰腺超微結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變, 如細(xì)胞器喪失、線粒體和細(xì)胞核結(jié)構(gòu)崩解、囊泡形成、細(xì)胞自噬和壞死[54]。在AFB1感染的斑馬魚胚胎中, 約有86%的肝臟體積縮小, 肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞。TUNEL染色表明AFB1引發(fā)了胚胎肝細(xì)胞的凋亡[55]。在本實(shí)驗(yàn)中, 隨AFB1濃度的增加, 克氏原螯蝦幼蝦肝胰腺R細(xì)胞數(shù)量減少, B細(xì)胞明顯增大和數(shù)量增多, 肝小管內(nèi)腔星狀結(jié)構(gòu)消失, 肝細(xì)胞逐步崩解, 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹且斷裂加劇, 油滴和囊泡增多, 100和1000 μg/kg組克氏原螯蝦幼蝦肝胰腺嚴(yán)重病變。R細(xì)胞數(shù)量減少,B細(xì)胞數(shù)量增加, 預(yù)示肝胰腺解毒功能受損[56], 肝細(xì)胞的崩解導(dǎo)致肝臟功能不足并趨于衰竭[57]。

3.4 飼料AFB1水平對(duì)克氏原螯蝦幼蝦積累水平的影響

AFB1在胃腸道被吸收后分布到肌肉、腎臟和脂肪組織, 主要分布到肝臟。影響AFT代謝的因素包括種類、性別、年齡、健康狀況、染毒時(shí)間和飼料中的毒素水平[30]。AFB1在黃河鯉(Cyprinus carpio var)組織中的積累與飼料中AFB1的含量密切相關(guān), 而肝臟中AFB1的含量遠(yuǎn)高于肌肉中含量,這也反映了肝膽系統(tǒng)是AFB1及其代謝物積累和排泄的重要場所[58]。鯉幼魚攝入100 μg/kg AFB1肝胰臟殘留濃度最高[59]。飼養(yǎng)3個(gè)月的異育銀鯽肝胰臟中AFB1殘留量明顯增加, 并與飼料中AFB1含量呈對(duì)數(shù)關(guān)系, 其殘留量遠(yuǎn)高于肌肉和卵巢[33]。大菱鲆(Scophthalmus maximus)500 μg/kg AFB1飼料組血清中AFB1殘留量高于肌肉中[46]。在整個(gè)AFB1暴露期頭石脂鯉肝臟中僅能檢測到水平很低的AFB1, 而在肌肉中則沒有AFB1的積累[30]。Barany等[60]在AFB1對(duì)大西洋鯛(Sparus aurata)的影響研究顯示,盡管驗(yàn)證了飼料中存在AFB1, 但肝臟和肌肉樣品均未檢出AFB1。飼喂含AFB1飼料的中國對(duì)蝦(Penaeus Chinensis)體內(nèi)均未檢出AFB1[61]。Su等[11]研究發(fā)現(xiàn), 飼喂含AFB1飼料的南美白對(duì)蝦肌肉中沒有檢測到AFB1, 這意味著食用南美白對(duì)蝦的肌肉不會(huì)增加消費(fèi)者接觸AFB1的風(fēng)險(xiǎn)。飼喂含AFB1飼料4周后發(fā)現(xiàn)斑節(jié)對(duì)蝦肌肉中的殘留量最高, 第6周開始降低, 在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間, 頭部和外殼中殘留物均較少[18]。在本實(shí)驗(yàn)中, 僅在1000 μg/kg組幼蝦蝦體中檢測出(1.65±0.22) μg/kg的AFB1, 低于FDA食品中AFB1的安全限量標(biāo)準(zhǔn)(5 μg/kg)[62], 該結(jié)果與草魚的報(bào)道相似, 草魚攝食10、20、100、1000和1000 μg/kg AFB1后肌肉中均未檢測出AFB1, 攝食5000 μg/kg AFB1的草魚肌肉中檢測出1.21 μg/kg AFB1[28]。AFB1的主要清除途徑為膽和排泄系統(tǒng)。AFB1在體內(nèi)較快地轉(zhuǎn)化成AFL而非AFBO, 并且迅速被解毒酶作用而生成水溶性物質(zhì), 最后通過其膽汁、尿液等排出體外[63]。異育銀鯽攝食AFB1達(dá)1000 μg/kg時(shí)糞便中的AFB1僅34 μg/kg, 比率僅為0.034, 而肝胰臟和肌肉中積累比率也僅為0.012和0.002, 大部分AFB1未被吸收或經(jīng)排泄系統(tǒng)排出體外[44]。在本實(shí)驗(yàn)中, 攝食AFB1≤100 μg/kg的克氏原螯蝦幼蝦蝦體均未檢測出AFB1, 但100 μg/kg組在生長、抗氧化和組織學(xué)方面跟對(duì)照組均有顯著差異, 類似的結(jié)果在其他AFB1對(duì)蝦類的研究中已有報(bào)道。南美白對(duì)蝦飼料中添加129.1 μg/kg AFB1顯著降低了對(duì)蝦的生長性能和體脂含量, 抑制了抗氧化能力和免疫力, 增加了脂質(zhì)過氧化, 并造成肝胰腺組織損傷, 但僅在肝胰腺中檢測到極低的AFB1殘留, 肌肉中則未檢出[12]。另有研究表明, 南美白對(duì)蝦持續(xù)8周攝入含1600 μg/kg AFB1的飼料后, 對(duì)蝦的肝胰腺受損且MDA、SOD和ROS等抗氧化指標(biāo)均受到不同程度的影響, 但其肌肉中未檢測到AFB1殘留。當(dāng)對(duì)蝦攝入AFB1后, 在肝胰腺中代謝產(chǎn)生AFM1, 實(shí)驗(yàn)中檢測了對(duì)蝦肝胰腺、腸道和肌肉中的AFM1殘留量, 證明AFB1的代謝主要在肝胰腺中, 排泄時(shí)有極小的一部分在腸道中吸收,肌肉中則不存在AFM1殘留[40]。推測克氏原螯蝦可能是以肝胰腺和排泄系統(tǒng)作為其主要的AFB1清除途徑, 但是還需要進(jìn)一步的藥物動(dòng)力學(xué)分析。