飼料中添加輔酶Q10對(duì)吉富羅非魚幼魚生長(zhǎng)、抗氧化能力和組織結(jié)構(gòu)的影響

黃 瑩 葛汝祥 婁格格 滿 洲 姜能座 郭雅哲 朱曉鳴李晨昊 劉軒宇 陳新華

(1.福建農(nóng)林大學(xué)海洋學(xué)院, 福建省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 福州 350002; 2.福建省測(cè)試技術(shù)研究所, 福州 350003;3.中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所, 淡水生態(tài)與生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430072)

隨著環(huán)保意識(shí)和健康認(rèn)知的不斷提高, 綠色養(yǎng)殖成為新時(shí)代產(chǎn)業(yè)發(fā)展的前進(jìn)方向, 而尋找多功能、無污染、無殘留的飼料添加劑是促進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖可持續(xù)發(fā)展的必經(jīng)之路。輔酶Q10(Coenzyme Q10), 又稱泛醌, 是一種天然存在的脂溶性物質(zhì), 結(jié)構(gòu)與維生素K、維生素E和質(zhì)體醌相似, 其作為線粒體電子傳遞鏈(ETC)中的輔助因子參與細(xì)胞生物能量學(xué), 對(duì)于ATP產(chǎn)生至關(guān)重要[1]。輔酶Q10主要來源為機(jī)體自身合成, 機(jī)體合成量會(huì)隨年齡增加而減少[2]。輔酶Q10合成量不足會(huì)導(dǎo)致機(jī)體組織出現(xiàn)線粒體功能障礙和氧化損傷, 對(duì)心肌、大腦等需能高的組織造成危害[3]。另外, 輔酶Q10的缺乏還會(huì)導(dǎo)致CoQ2、CoQ6等基因的變異, 肝臟、腎臟等器官受損引起多種疾病, 因此需要外源補(bǔ)充保證體內(nèi)輔酶Q10含量的穩(wěn)定[4]。由于輔酶Q10為脂溶性, 在被動(dòng)物攝食后, 易透過細(xì)胞膜被完全吸收[5]。有研究表明, 高劑量的輔酶Q10添加也不會(huì)對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生明顯的毒性[6—8], 說明輔酶Q10是一種多功能、易吸收、安全性高的營(yíng)養(yǎng)性添加劑。

輔酶Q10可清除自由基[9], 降血脂[10], 抗氧化[11],提高免疫力[12], 對(duì)肝腎具有保護(hù)作用[13], 并且可治療多種疾病[14], 提高動(dòng)物存活率[15], 保證動(dòng)物精子質(zhì)量[16]等功能。輔酶Q10自1957年Frederick Crane從牛心臟中分離得到后[17], 已在食品、醫(yī)藥和畜牧等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用[18,19]。在小鼠攝食輔酶Q10后,脂肪組織中的脂質(zhì)氧化增多, 脂質(zhì)清除率提高, 減少了脂肪組織的重量[20]。用輔酶Q10可治療醋酸鉛引起的氧化應(yīng)激, 大鼠皮質(zhì)組織中SOD、CAT和GSH-Px酶活性顯著提升, MDA含量顯著降低, 同時(shí)SOD和CAT的基因表達(dá)量顯著上調(diào)[21]。輔酶Q10能發(fā)揮保護(hù)缺血心肌的作用, 可有效改善冠心病患者的心功能[22]。高血壓患者接受輔酶Q10外源補(bǔ)充后, 其血壓水平明顯下降[23]。飼料中補(bǔ)充輔酶Q10后, 鵪鶉(Coturnix japonica)的日采食量、日增重和飼料轉(zhuǎn)化率都得到顯著提升[24]。輔酶Q10通過發(fā)揮其抗氧化特性, 可提高雄鹿精子質(zhì)量和胚胎的發(fā)育能力[25]。輔酶Q10能顯著改善動(dòng)物生長(zhǎng)性能和肉品質(zhì), 在飼料行業(yè)具有廣闊的應(yīng)用前景[26]。

羅非魚又名非洲鯽魚, 是我國(guó)重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類。自20世紀(jì)50年代引入我國(guó)后, 養(yǎng)殖產(chǎn)量和養(yǎng)殖水平得到大幅提升。目前, 中國(guó)已是羅非魚最大的生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó), 羅非魚養(yǎng)殖具有較好的前景[27]。吉富羅非魚是羅非魚經(jīng)遺傳性狀改良后的品種, 具有生長(zhǎng)快、食性雜、易飼養(yǎng)和肉質(zhì)鮮美等優(yōu)點(diǎn)。目前關(guān)于輔酶Q10在水產(chǎn)動(dòng)物上的研究鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在研究長(zhǎng)期攝食輔酶Q10對(duì)吉富羅非魚幼魚生長(zhǎng)、體成分、抗氧化能力、肝臟抗氧化相關(guān)基因表達(dá)和抗病力等方面的影響, 為輔酶Q10應(yīng)用于水產(chǎn)飼料提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 養(yǎng)殖系統(tǒng)

養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)在循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進(jìn)行, 系統(tǒng)由12個(gè)體積相同的圓柱體PP缸(直徑80 cm, 桶高70 cm)組成, 水體體積為180 L/缸, 每缸水流速度為0.6 L/min。每天檢測(cè)2次氣溫和水溫, 每2周檢測(cè)水體溶氧和氨氮情況。實(shí)驗(yàn)期間, 水溫為24—26℃, 保持水體中溶解氧含量在6 mg/L以上, 氨氮為0.2—0.4 mg/L, pH為6.8—7.0。光照周期12L﹕12D, 光照周期為每天8:00到20:00。

1.2 實(shí)驗(yàn)飼料及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)飼料的原料組成和常規(guī)化學(xué)成分如表1所示。實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)飼料添加不同水平輔酶Q10(0、40、80和120 mg/kg)配置成4種實(shí)驗(yàn)飼料。以豆粕、雞肉粉、菜粕、棉粕和魚粉等為主要蛋白源, 以豆油為主要脂肪源。飼料原料由福建大昌生物科技實(shí)業(yè)有限公司提供。輔酶Q10購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。將輔酶Q10純品按設(shè)計(jì)量與豆油充分混合, 然后將含有不同含量輔酶Q10的大豆油添加到各組實(shí)驗(yàn)飼料中混合均勻, 用飼料機(jī)制成直徑為2 mm的顆粒飼料, 在室溫下于陰暗處平鋪放置, 待干燥后儲(chǔ)存于–20℃冰箱。

表1 實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)飼料配方及化學(xué)組成(g/kg干物質(zhì))Tab.1 Diet formulation and chemical composition of experimental diets (g/kg in dry matter)

1.3 實(shí)驗(yàn)魚與飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)吉富羅非魚幼魚來自福建省淡水水產(chǎn)研究所養(yǎng)殖基地。正式實(shí)驗(yàn)前挑選健康活潑、規(guī)格相近、體表無明顯損傷的吉富羅非魚幼魚暫養(yǎng)于室內(nèi)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中。用實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)飼料暫養(yǎng)2周后, 挑選規(guī)格相近的312尾吉富羅非魚幼魚隨機(jī)投放到12個(gè)養(yǎng)殖缸中, 每養(yǎng)殖缸放養(yǎng)26尾。將這12個(gè)缸隨機(jī)分成4個(gè)實(shí)驗(yàn)組, 每組再設(shè)置3個(gè)平行, 進(jìn)行為期56d的養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)。在暫養(yǎng)期間和實(shí)驗(yàn)期間, 每天分別于8:00和16:00連續(xù)投喂1h達(dá)到表觀飽食(少量多次地循環(huán)投喂, 不留殘餌或極少殘餌)。實(shí)驗(yàn)開始2周后, 每天于幼魚攝食2h后用虹吸管收集魚缸中新鮮的魚糞, 烘箱中60℃烘干, –20℃保存, 留作干物質(zhì)消化率分析用。每天記錄水溫、攝食情況和實(shí)驗(yàn)魚死亡情況, 在養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束后, 實(shí)驗(yàn)魚饑餓24h后稱取每缸魚的終末體重。

1.4 實(shí)驗(yàn)取樣

在養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束后, 每缸分別取12尾魚用MS-222(購(gòu)自美國(guó)Sigma公司)麻醉。麻醉后隨機(jī)取3尾魚, 使用注射器于尾靜脈采血, 于4℃下以3500 r/min離心10min, 取3尾魚血清混合成一個(gè)樣品于–80℃冰箱中保存, 用于血液指標(biāo)的測(cè)定。在冰盤上解剖出肝臟, 3尾魚肝臟混合成1個(gè)樣品, 放入凍存管中經(jīng)液氮急凍, 稍后轉(zhuǎn)移到–80℃冰箱中保存, 用于肝臟抗氧化酶的測(cè)定。另取3尾魚稱取體重并測(cè)量體長(zhǎng), 解剖后稱取內(nèi)臟團(tuán)和肝臟質(zhì)量, 用于計(jì)算肥滿度、臟體比和肝體比。再取3尾魚解剖出肝臟和腸道, 經(jīng)中性甲醛固定后進(jìn)行HE染色, 制作切片, 絨毛密度按照Barducci 等[28]的方法計(jì)算每mm2的絨毛個(gè)數(shù)。剩余3尾魚, 解剖出肝臟后混合, 置于–80℃保存, 用于分析肝臟相關(guān)基因的表達(dá)。

1.5 樣品的測(cè)定

采用外源指示劑(Y2O3)測(cè)量干物質(zhì)消化率[29]。根據(jù)指示劑及干物質(zhì)在飼料和糞便中的含量變化,計(jì)算干物質(zhì)消化率。

實(shí)驗(yàn)飼料和魚體的水分、粗蛋白、粗脂肪、灰分的測(cè)定參照文獻(xiàn)[30]的方法測(cè)定: 將樣品在105℃烘干至恒重, 通過失重法測(cè)定干物質(zhì), 從而計(jì)算出水分; 粗蛋白采用FOSS 定氮儀(2300 Kjeltec Analyzer Unit)測(cè)定; 粗脂肪采用索氏抽提儀(Soxtec system HT6, Tecator, Hoganas, Sweden)測(cè)定; 灰分在馬福爐中550℃燃燒3h, 失重法測(cè)定。

過氧化氫酶(CAT)、總超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)活性及丙二醛(MDA)、膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)含量均采用南京建成生物工程研究所試劑盒測(cè)定。

肝臟相關(guān)基因表達(dá)測(cè)定采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qRT-PCR)反應(yīng)體系。根據(jù)TRIzol法提取樣品的總RNA后, 再根據(jù)試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄過程中使用DNA酶去除基因組DNA, 引物的擴(kuò)增效率在有效范圍(0, 1)之內(nèi)。因β-actin具有氨基酸序列的高度保守性, 能在不同組織中持續(xù)衡量地表達(dá), 且表達(dá)量高, 故將其作為內(nèi)參基因用來計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量[31]。以逆轉(zhuǎn)錄cDNA第一條鏈為模板, 然后β-actin與目的基因引物同時(shí)在不同反應(yīng)孔內(nèi)進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增?？偡磻?yīng)體積為20 μL的反應(yīng)體系如下: cDNA模板9 μL, 10 μL SYBR Green Realtime PCR Master Mix, 10 μmol/L正/反定量引物各0.5 μL。每個(gè)時(shí)相做5個(gè)平行樣品, 每個(gè)樣品做4次重復(fù)。PCR反應(yīng)條件: 95℃ 15s, 60℃ 1min,40個(gè)循環(huán)。本實(shí)驗(yàn)所需特定引物(表2)均在NCBI(the National Center for Biotechnology Information)數(shù)據(jù)庫(kù)中設(shè)計(jì)[32]。經(jīng)驗(yàn)證后使用特定引物組擴(kuò)增選定的基因, 同時(shí)對(duì)每個(gè)基因的溶解曲線進(jìn)行分析,溶解曲線均無雜峰, 證明引物設(shè)計(jì)符合實(shí)驗(yàn)要求[33]。

表2 實(shí)驗(yàn)所用引物Tab.2 Primers used in the experiment

根據(jù)儀器自動(dòng)給出樣品的RQ值(2–ΔΔCt, ?Ct=樣品目的基因的Ct值–內(nèi)參基因β-actin Ct值, ΔΔCt=每一個(gè)樣品的?Ct值–基準(zhǔn)樣品的?Ct值), 記錄下RQ值, 基因表達(dá)水平均用RQ平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)來表示。

1.6 攻毒實(shí)驗(yàn)

所用的病原為嗜水氣單胞菌, 購(gòu)自廣東省微生物菌種保藏中心(GIMCC)。將嗜水氣單胞菌接種在FWA培養(yǎng)基(蛋白胨5 g/L、牛肉膏2.5 g/L、酵母膏2.5 g/L、葡萄糖1 g/L、NaCl 15 g/L、MgSO40.05 g/L、K2HPO40.2 g/L和瓊脂15 g/L, pH 7.2—7.4)上, 30℃培養(yǎng)36h后, 用0.85%的無菌生理鹽水洗脫菌體, 菌液濃度為3×107cfu/mL。在56d的養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后,每缸隨機(jī)取10尾魚, 經(jīng)胸鰭基部注射0.3 mL嗜水氣單胞菌活菌懸液, 進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn), 分別記錄攻毒后1—10d的死亡情況, 計(jì)算累計(jì)存活率。

1.7 數(shù)據(jù)處理

利用下列公式計(jì)算特定生長(zhǎng)率、攝食率和飼料效率:

特定生長(zhǎng)率(SGR, %/d)=100×(LnWt–LnW0)/t

攝食率(FR, %BW/d)=100×I/[(Wt+W0)/2]/t

飼料效率(FE, %)=100×(Wt–W0)/I

干物質(zhì)消化率(DMD, %)=100×(1–B/B1)

肥滿度(CF, g/cm3)=100×(Wt/L3)

肝體比(HSI)=100%×(Wz/Wt)

臟體比(VSI)=100%×(Wv/Wt)

攻毒后累計(jì)存活率(%)=100×Xt/X0

式中,W0為平均初始體重(g),Wt為平均終末體重(g),t為實(shí)驗(yàn)時(shí)長(zhǎng)(d),I為攝食量(g),B為飼料中Y2O3含量,B1為糞便中Y2O3含量,L為平均終末體長(zhǎng)(cm),Wz為平均終末肝胰臟質(zhì)量(g),Wv為平均終末內(nèi)臟團(tuán)質(zhì)量(g),X0為開始攻毒時(shí)實(shí)驗(yàn)魚的尾數(shù),Xt為攻毒t時(shí)間后實(shí)驗(yàn)魚的存活尾數(shù)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)表示, 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)一元方差分析(Oneway ANOVA)后, 用Duncan’s 進(jìn)行多重比較, 當(dāng)P<0.05時(shí), 為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 飼料中輔酶Q10水平對(duì)吉富羅非魚幼魚生長(zhǎng)性能的影響

在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中, 各實(shí)驗(yàn)組的吉富羅非魚幼魚均未表現(xiàn)出行為異常。由表3所示, 不同水平輔酶Q10對(duì)吉富羅非魚幼魚初始體重(IBW)、終末體重(FBW)、存活率(SR)、攝食率(FR)、特定生長(zhǎng)率(SGR)、飼料效率(FE)、肥滿度(CF)、肝體比(HSI)和臟體比(VSI)均無顯著影響(P>0.05), 120 mg/kg輔酶Q10組終末體重、特定生長(zhǎng)率和飼料效率在各組中均為最高。當(dāng)輔酶Q10添加量為120 mg/kg時(shí),吉富羅非魚幼魚的干物質(zhì)消化率顯著升高(P<0.05)。

表3 飼料輔酶Q10含量對(duì)吉富羅非魚幼魚生長(zhǎng)、飼料利用及體指標(biāo)的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)*Tab.3 Effects of dietary CoQ10 on growth performance, feed utilization and physical indexes of juvenile GIFT tilapia (mean±SE)*

2.2 飼料中輔酶Q10對(duì)吉富羅非魚幼魚體成分的影響

如表4所示, 各實(shí)驗(yàn)組間吉富羅非魚幼魚去內(nèi)臟全魚的水分、干物質(zhì)、粗蛋白和灰分含量無顯著差異(P>0.05), 當(dāng)輔酶Q10添加量為120 mg/kg時(shí),去內(nèi)臟全魚的粗脂肪含量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。各組間吉富羅非魚幼魚內(nèi)臟團(tuán)的水分、干物質(zhì)、粗蛋白、粗脂肪和灰分含量均無顯著差異(P>0.05)。

表4 飼料輔酶Q10含量對(duì)吉富羅非魚幼魚體成分含量的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)Tab.4 Effect of dietary CoQ10 on body composition of juvenile GIFT tilapia (mean±SE)

2.3 飼料中輔酶Q10水平對(duì)吉富羅非魚幼魚抗氧化指標(biāo)的影響

由表5所示, 40 mg/kg輔酶Q10組吉富羅非魚幼魚血清過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)活性均顯著高于對(duì)照組(P<0.05), 總超氧化物歧化酶(SOD)與對(duì)照組無顯著差異(P>0.05)。80 mg/kg輔酶Q10組吉富羅非魚幼魚血清CAT和GSH-Px均顯著高于對(duì)照組(P<0.05), SOD和GST均與對(duì)照組無顯著差異(P>0.05)。與對(duì)照組相比, 120 mg/kg輔酶Q10組吉富羅非魚幼魚血清CAT、SOD和GSH-Px活性顯著升高(P<0.05), GST活性無顯著差異(P>0.05)。120 mg/kg輔酶Q10組吉富羅非魚幼魚血清中膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)含量顯著低于對(duì)照組, 其他各組TC和TG與對(duì)照組均無顯著差異(P>0.05)。

表5 飼料輔酶Q10含量對(duì)吉富羅非魚幼魚血清抗氧化指標(biāo)以及血清膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)含量的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)Tab.5 Effect of dietary CoQ10 on serum antioxidant indexes, total cholesterol (TC) and triglyceride (TG) of juvenile GIFT tilapia(mean±SE)

如表6所示, 40 mg/kg輔酶Q10組吉富羅非魚幼魚肝臟的過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性均顯著高于對(duì)照組(P<0.05), 總超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)和丙二醛含量(MDA)均與對(duì)照組無顯著性差異(P>0.05)。與對(duì)照組相比, 80和120 mg/kg輔酶Q10組吉富羅非魚幼魚肝臟CAT、SOD、GSH-Px、GST活性均顯著升高(P<0.05), MDA含量均顯著降低(P<0.05)。

表6 飼料輔酶Q10含量對(duì)吉富羅非魚幼魚肝臟抗氧化指標(biāo)的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)Tab.6 Effect of dietary CoQ10 on liver antioxidant indexes of juvenile GIFT tilapia (mean±SE)

2.4 飼料中輔酶Q10對(duì)吉富羅非魚幼魚肝臟和腸道組織學(xué)的影響

如圖1所示, 對(duì)照組吉富羅非魚幼魚肝臟組織學(xué)切片顯示出肝臟組織的正常組織學(xué)特征。可以觀察到正常的肝實(shí)質(zhì), 肝細(xì)胞形成索狀結(jié)構(gòu)。且細(xì)胞間界限分明, 大多數(shù)肝細(xì)胞只有一個(gè)細(xì)胞核, 細(xì)胞核位于細(xì)胞中央, 近似圓形, 邊緣清晰, 胞質(zhì)豐富。各輔酶Q10組的肝臟結(jié)構(gòu)均未出現(xiàn)異常, 肝細(xì)胞排列緊密, 大小和排列方式均與對(duì)照組相似。

圖1 輔酶Q10含量對(duì)吉富羅非魚幼魚肝臟組織學(xué)的影響(HE,標(biāo)尺為50 μm)Fig.1 Liver of juvenile GIFT tilapia fed with diets containing CoQ10 (HE, Bar=50 μm)

如圖2所示, 各實(shí)驗(yàn)組吉富羅非魚幼魚腸道組織學(xué)切片顯示出腸道組織的正常組織學(xué)特征。從內(nèi)到外由黏膜層、黏膜下層、肌層和外膜四層結(jié)構(gòu)構(gòu)成。腸道組織完整, 肌層緊實(shí), 黏膜層腸絨毛柱狀上皮細(xì)胞完整且緊密排列, 表面可觀察到紋狀緣, 杯狀細(xì)胞均勻分布。120 mg/kg輔酶Q10組腸道組織結(jié)構(gòu)正常, 腸絨毛相較于對(duì)照組排列更加緊密。由表7所知, 120 mg/kg輔酶Q10組吉富羅非魚腸道的絨毛長(zhǎng)度、絨毛密度和肌層厚度均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

表7 飼料輔酶Q10含量對(duì)吉富羅非魚幼魚腸道結(jié)構(gòu)的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)Tab.7 Effects of dietary CoQ10 on intestinal structure of juvenile GIFT tilapia (mean±SE)

圖2 輔酶Q10含量對(duì)吉富羅非魚幼魚腸道組織學(xué)的影響(HE,標(biāo)尺為50 μm)Fig.2 Intestinal histology of juvenile GIFT tilapia fed with diets containing CoQ10 (HE, Bar=50 μm)

2.5 飼料中輔酶Q10水平對(duì)吉富羅非魚幼魚肝臟相關(guān)基因表達(dá)的影響

如圖3所示, 120 mg/kg輔酶Q10組的sod、cat、gsh-px和gst基因表達(dá)量最高, 且顯著高于其他各組(P<0.05)。80和120 mg/kg輔酶Q10組的免疫球蛋白M(igm)基因表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。各輔酶Q10組的il-1β和il-8基因表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

圖3 輔酶Q10含量對(duì)吉富羅非魚幼魚肝臟相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.3 Effect of dietary CoQ10 on the expression of liver-related genes in juvenile GIFT tilapia

2.6 飼料中輔酶Q10水平對(duì)吉富羅非魚幼魚抗病力的影響

如圖4所示, 每天記錄一次所有組吉富羅非魚幼魚的累計(jì)存活率。注射嗜水氣單胞菌8d后, 所有組存活率達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。80和120 mg/kg輔酶Q10組的累計(jì)存活率分別為70.00%和80.00%, 均顯著高于對(duì)照組和40 mg/kg輔酶Q10組(P<0.05), 其10d累計(jì)存活率均為46.67%。

圖4 輔酶Q10含量對(duì)嗜水氣單胞菌攻毒后吉富羅非魚幼魚存活率的影響Fig.4 Effects of dietary CoQ10 on survival rate of juvenile GIFT tilapia challenged with Aeromonas hydrophila

3 討論

3.1 飼料中輔酶Q10水平對(duì)吉富羅非魚幼魚生長(zhǎng)性能的影響

日糧中補(bǔ)充輔酶Q10對(duì)肉雞采食量、體重增加和飼料轉(zhuǎn)化率均無顯著的影響[34,35]。但也有研究發(fā)現(xiàn), 飼料中補(bǔ)充輔酶Q10能提高動(dòng)物的生長(zhǎng)性能[36],例如顯著增加了21日齡肉雞的平均體重[37]。飼糧中補(bǔ)充輔酶Q10后, 鵪鶉的終末體重、累計(jì)采食量和飼料效率顯著增加[24,38]。飼料中補(bǔ)充40 mg/kg輔酶Q10, 顯著提高了非洲鯰(Clarias gariepinus)的終末體重和特定生長(zhǎng)率[39]。生長(zhǎng)性能提升的原因可能是輔酶Q10具有一定的抗炎特性, 能顯著降低機(jī)體應(yīng)激狀態(tài)造成的損傷[40]。但在本實(shí)驗(yàn)中, 不同輔酶Q10水平對(duì)終末體重、特定生長(zhǎng)率、攝食率和飼料效率均無顯著影響, 但隨著輔酶Q10含量的增加終末體重、特定生長(zhǎng)率和飼料效率有上升的趨勢(shì),120 mg/kg輔酶Q10組終末體重、特定生長(zhǎng)率和飼料效率均為最高, 比對(duì)照組分別提高了2.32%、3.03%和4.44%。研究結(jié)果不同可能是受物種、年齡、飼料組成和實(shí)驗(yàn)條件等因素的影響。肥滿度能反映魚類生長(zhǎng)狀況, 其大小與溫度、飼料和繁殖等密切相關(guān)[41]。肝體比可反映實(shí)驗(yàn)期間肝臟功能的好壞,而臟體比可用來衡量動(dòng)物攝入能量的分配情況[42]。飼喂輔酶Q10顯著降低了非洲鯰的肝體比, 但對(duì)肥滿度無顯著影響[39]。在本實(shí)驗(yàn)中, 不同輔酶Q10水平對(duì)肥滿度、肝體比和臟體比均無顯著影響, 該結(jié)果與El Basuini等[43]的報(bào)道相似。

3.2 飼料中輔酶Q10水平對(duì)吉富羅非魚幼魚體成分的影響

腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)是重要的脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)因子, 在AMPK磷酸化后會(huì)刺激分解代謝途徑, 減少膽固醇、脂肪酸和甘油三酯的合成[44]。過氧化物酶體增值物激活受體(PPAR)是脂質(zhì)代謝中的轉(zhuǎn)錄因子, 在脂代謝和脂肪酸氧化中起重要作用[45]。輔酶Q10能通過介導(dǎo)AMPK途徑誘導(dǎo)PPAR的表達(dá),從而減少脂肪的合成[44]。研究表明, 肉雞肝臟中PPAR-α基因的表達(dá)隨輔酶Q10補(bǔ)充水平的升高而線性增加, 脂肪酸氧化增多, 肉雞腹部脂肪和血脂降低[46]。羥甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGR)是膽固醇合成的限速酶, 輔酶Q10能顯著降低HMGR活性從而抑制膽固醇的生成[47]。日糧中補(bǔ)充20 mg/kg輔酶Q10, 肉雞肝臟中HMGR活性顯著降低, 血清中膽固醇顯著降低[35]。小鼠在攝食輔酶Q10后, 脂肪組織中的脂質(zhì)氧化增多, 脂質(zhì)清除率提高, 降低了脂肪組織的重量[20]。血清TC和TG含量可反映機(jī)體脂質(zhì)代謝情況, TC和TG含量過高可引起動(dòng)物肝功能損傷[48]。日糧補(bǔ)充輔酶Q10, 肉雞血液中TC和TG含量顯著降低[49]。飼料中添加輔酶Q10, 水牛(Bubalus bubalis)犢牛的血清總脂質(zhì)和TG均顯著降低[50]。家兔攝食含輔酶Q10的飼糧, 血清TC和TG均顯著降低[51]。在本實(shí)驗(yàn)中, 當(dāng)輔酶Q10添加量為120 mg/kg時(shí), 顯著降低了吉富羅非魚幼魚血清TC、TG及去內(nèi)臟全魚的粗脂肪含量, 但對(duì)水分、粗蛋白和灰分均無顯著影響。

3.3 飼料中輔酶Q10水平對(duì)吉富羅非魚幼魚抗氧化指標(biāo)的影響

動(dòng)物體抗氧化系統(tǒng)由一系列抗氧化酶組成。機(jī)體長(zhǎng)期處于不良條件下會(huì)產(chǎn)生大量氧自由基, 自由基發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為MDA。CAT能協(xié)同SOD將體內(nèi)多余活性氧自由基轉(zhuǎn)化為水, GST也可以與GSH-Px互作清除自由基[43]。輔酶Q10在機(jī)體以其還原態(tài)形式發(fā)揮抗氧化作用。還原型輔酶Q10的異戊二烯側(cè)鏈能夠滲入飽和脂肪酸的膜脂類雙層, 保護(hù)細(xì)胞膜的磷脂和低密度脂蛋白, 減少自由基對(duì)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)的損傷并清除體內(nèi)多種氧化誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)產(chǎn)生的自由基[52,53]。輔酶Q10能顯著提高SOD和GSH-Px的活性, 有效降低人體血清MDA的含量, 說明輔酶Q10對(duì)人體具有抗氧化作用[54]。水牛犢牛在斷奶期間補(bǔ)充輔酶Q10后, 血清中SOD和CAT酶活性顯著升高[50]。飼料中添加20 mg/kg的輔酶Q10能顯著增加育肥豬背長(zhǎng)肌SOD酶活性,MDA含量顯著降低[18]。飼喂40 mg/kg輔酶Q10能顯著改善冷應(yīng)激下鵪鶉的抗氧化狀態(tài)(TAS), 顯著增加SOD活性和降低MDA含量[38]。輔酶Q10能減輕肉雞氧化應(yīng)激損傷, 肝臟線粒體內(nèi)T-SOD活性升高以及MDA含量顯著降低[55]。魚類的血液指標(biāo)是反映魚體健康狀況的重要參數(shù), 血液中抗氧化酶活性反映了清除機(jī)體自由基和活性氧的能力[56]。非洲鯰在攝食輔酶Q10后, 血清SOD、CAT、GSHPx酶活性顯著升高, 血清MDA含量顯著降低[39]。在本實(shí)驗(yàn)中, 隨著飼料中輔酶Q10添加量增加, 各輔酶Q10組吉富羅非魚幼魚血清和肝臟CAT和GSHPx活性均顯著升高。當(dāng)添加量為80或120 mg/kg時(shí),吉富羅非魚幼魚SOD和GST活性均顯著高于對(duì)照組, 且MDA含量顯著下降。說明添加輔酶Q10可顯著提高吉富羅非魚幼魚的抗氧化能力。

3.4 飼料中輔酶Q10水平對(duì)吉富羅非魚幼魚肝臟和腸道組織學(xué)的影響

肝臟是魚類最重要的代謝器官, 具有消化、解毒和代謝等多種功能。肝臟的結(jié)構(gòu)狀態(tài)可以直接反映魚類肝臟的健康狀況[57]。泛醇是輔酶Q10的雙電子還原產(chǎn)物, 在線粒體中起抗氧化劑的作用。大鼠和狗服用200 mg/kg及以上泛醇, 肝細(xì)胞有細(xì)小空泡形成，但研究認(rèn)為該變化是對(duì)輔酶Q10吸收的適應(yīng)性反應(yīng), 不會(huì)引起細(xì)胞毒性變化[58]。大鼠口服2000 mg/kg輔酶Q10 28d后, 肝臟重量和組織學(xué)結(jié)構(gòu)與對(duì)照組無顯著差異變化[8]。小鼠每日口服0.56、1.13和2.25 g/kg的輔酶Q10, 肝臟谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)活性不受輔酶Q10添加水平的影響, 輔酶Q10不會(huì)造成肝損傷[7]。非洲鯰攝食含40 mg/kg輔酶Q10的日糧后, 肝組織切片均顯示出正常的肝臟結(jié)構(gòu), 并且肝臟的AST、ALT和堿性磷酸酶(ALP)活性顯著降低[39]。本研究結(jié)果顯示, 各輔酶Q10組吉富羅非魚幼魚肝組織結(jié)構(gòu)與對(duì)照組對(duì)比無顯著變化, 細(xì)胞間界限分明, 排列緊密。結(jié)合肝臟抗氧化酶活性升高和丙二醛(MDA)含量的減少, 說明輔酶Q10可減少肝臟的氧化損傷, 有助于肝臟組織的健康。

腸道是魚類消化與吸收營(yíng)養(yǎng)的主要器官, 由漿膜層、肌層、黏膜下層和黏膜層組成[59]。腸絨毛是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的主要部位, 其形態(tài)結(jié)構(gòu)直接反映魚類消化吸收能力。飼料添加劑的使用能夠促進(jìn)魚類腸道發(fā)育和維持腸道健康。在本實(shí)驗(yàn)中,飼料中添加120 mg/kg輔酶Q10顯著增加吉富羅非魚幼魚腸道絨毛長(zhǎng)度和絨毛密度。腸絨毛表面積的增加, 更有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收。飼料中補(bǔ)充其他添加劑也有類似效果, 例如在歐洲海鱸(Dicentrarchus labrax)飼料中添加0.2%微囊丁酸鈉后, 顯著提高了絨毛長(zhǎng)度和絨毛密度, 有利于腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整和穩(wěn)固[60]。飼料中添加肉桂醛能顯著提高鰻鱺(Anguilla japonica)腸道的絨毛數(shù)量和長(zhǎng)度, 從結(jié)構(gòu)上改善了腸道的消化與吸收功能[61]。飼料中添加丁酸鈉顯著提高了黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)前腸和后腸的絨毛長(zhǎng)度, 促進(jìn)了腸道發(fā)育和維持腸道健康[62]。腸道的蠕動(dòng)依靠腸道肌肉的收縮作用,而肌層的厚度能一定程度促進(jìn)腸道蠕動(dòng), 有利于腸道內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸[63]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 120 mg/kg輔酶Q10組吉富羅非魚幼魚腸道肌層厚度顯著增加,可能提高了其對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收效率。類似的研究顯示, 1500 mg/kg的枸杞多糖能有效提高尼羅羅非魚前腸的肌層厚度, 促進(jìn)食物在下游消化道的消化吸收[64]。結(jié)合本研究干物質(zhì)消化率的升高,說明輔酶Q10對(duì)吉富羅非魚幼魚腸道消化和吸收能力可能有一定程度的改善, 且添加量為120 mg/kg時(shí)具有明顯的效果。

3.5 飼料中輔酶Q10水平對(duì)吉富羅非魚幼魚肝臟相關(guān)基因表達(dá)的影響

40 mg/kg輔酶Q10顯著增加了大鼠線粒體錳超氧化物歧化酶(MnSOD)基因的表達(dá), 且肝臟SOD、CAT和GSH-Px酶活性顯著升高[65]。飼料中添加40 mg/kg輔酶Q10, 使肉雞肝臟CAT基因被高度表達(dá)[15]。白細(xì)胞介素(Interleukin,il)是一種促炎細(xì)胞因子, 在介導(dǎo)T淋巴細(xì)胞和B細(xì)胞的活化、增殖和分化過程中有重要作用[66]。輔酶Q10能抑制il-1、il-6等多種促炎細(xì)胞因子的表達(dá)[67,68]。NF-κB通路可以被活性氧激活, 而輔酶Q10可以通過抑制NF-κB從而下調(diào)促炎細(xì)胞因子的表達(dá)[69,70]。大鼠涂抹輔酶Q10藥膏后, 與炎癥有關(guān)的HO-1、il-1β、tnf-α和NF-κB的基因表達(dá)顯著下調(diào)[71]。用輔酶Q10治療氧化損傷的大鼠, 大鼠肝臟中促炎細(xì)胞因子il-6下降至正常水平[72]。免疫球蛋白M(igm)在特異性免疫中起著識(shí)別和清除潛在病原體的重要作用, 其含量水平可反映魚類免疫功能強(qiáng)弱[73]。在本實(shí)驗(yàn)中, 120 mg/kg輔酶Q10上調(diào)了sod、cat、gsh-px、gst和igm基因的表達(dá), 而不同水平輔酶Q10組均下調(diào)了il-8和il-1β基因的表達(dá)。這說明當(dāng)添加量為120 mg/kg時(shí), 機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)明顯增強(qiáng)。輔酶Q10還能作用于機(jī)體免疫系統(tǒng), 減少炎癥因子的表達(dá)量, 提高機(jī)體的免疫力[12]。

3.6 飼料中輔酶Q10水平對(duì)吉富羅非魚幼魚抗病力的影響

輔酶Q10的添加可刺激體內(nèi)抗體水平的提高,增加巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的數(shù)量和功能, 從而提高機(jī)體免疫水平[14]。輔酶Q10減輕了氟化物污染引起的貧血和組織學(xué)變化, 提高了非洲鯰對(duì)溫和氣單胞菌(Aeromonas sobria)的抗病力[39]。奶薊草和輔酶 Q10的聯(lián)用可調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)和腦鎳含量來減輕氯化鎳引起的尼羅羅非魚神經(jīng)行為障礙[74]。輔酶Q10減少了大鼠神經(jīng)缺陷和組織損傷, 增強(qiáng)了抗病力[75]。嗜水氣單胞菌我國(guó)流行最為廣泛的一種典型人-畜-水生動(dòng)物共患的病原菌, 廣泛分布于淡水、海洋和河口等水生環(huán)境[76]。魚類感染嗜水氣單胞菌后易出現(xiàn)出血病, 主要表現(xiàn)為頭部、腹部等部位充血, 漂浮于水面等現(xiàn)象, 致死率極高[77]。在本實(shí)驗(yàn)中, 80和120 mg/kg輔酶Q10組吉富羅非魚幼魚嗜水氣單胞菌侵染后的累計(jì)存活率顯著高于對(duì)照組。輔酶Q10充分發(fā)揮了免疫防御作用, 可能與其提升了機(jī)體抗氧化酶活性和抗氧化相關(guān)基因的表達(dá)有關(guān), 進(jìn)而提高了魚體抗病力。

4 結(jié)論

飼料中添加輔酶Q10≤120 mg/kg對(duì)吉富羅非魚幼魚存活、生長(zhǎng)、飼料利用及組織結(jié)構(gòu)均無不良影響。飼喂120 mg/kg輔酶Q10能顯著提高吉富羅非魚幼魚的消化率、抗氧化能力、肝臟抗氧化相關(guān)基因的表達(dá)和對(duì)嗜水氣單胞菌的抗病力, 降低血脂和去內(nèi)臟全魚的脂肪含量。