噬菌體在水產(chǎn)養(yǎng)殖中治療細(xì)菌感染的研究進(jìn)展和挑戰(zhàn)

龔夢(mèng)馨, 李明源

噬菌體在水產(chǎn)養(yǎng)殖中治療細(xì)菌感染的研究進(jìn)展和挑戰(zhàn)

龔夢(mèng)馨, 李明源

(喀什大學(xué) 生命與地理科學(xué)學(xué)院, 新疆 喀什 844000)

高密度、集約化水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展導(dǎo)致疾病不斷發(fā)生并呈現(xiàn)日趨嚴(yán)重之勢(shì), 同時(shí), 由于細(xì)菌對(duì)傳統(tǒng)抗生素產(chǎn)生耐藥性而使抗生素的使用受到越來(lái)越多的限制, 世界各國(guó)科學(xué)家都在致力于研究替代抗生素的新療法。噬菌體因?yàn)榭梢蕴禺愋缘貧⑺滥承┘?xì)菌, 對(duì)動(dòng)、植物以及環(huán)境都沒(méi)有副作用, 因此, 在水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治中呈現(xiàn)良好的應(yīng)用前景。本文從噬菌體的特異性、安全性、賦形方法以及對(duì)環(huán)境的影響等方面對(duì)國(guó)內(nèi)外水產(chǎn)養(yǎng)殖中的噬菌體治療研究現(xiàn)狀和存在的主要問(wèn)題進(jìn)行了簡(jiǎn)要論述, 為了解學(xué)科進(jìn)展, 促進(jìn)噬菌體在治療中的成功使用提供了理論依據(jù)。

水產(chǎn)養(yǎng)殖; 噬菌體療法; 噬菌體; 抗生素耐藥性

作為優(yōu)質(zhì)蛋白重要來(lái)源的水產(chǎn)品, 人們對(duì)其需求正日漸增長(zhǎng)。據(jù)《2022年世界漁業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖狀況》[1]報(bào)告, 2020年世界漁業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖總產(chǎn)量上升至歷史最高水平, 亞洲國(guó)家漁業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物產(chǎn)量約占全球總量的70%。隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的擴(kuò)大發(fā)展, 特別是高密度、集約化養(yǎng)殖的發(fā)展, 導(dǎo)致疾病經(jīng)常爆發(fā), 引起養(yǎng)殖動(dòng)物大量死亡, 給產(chǎn)業(yè)帶來(lái)巨大損失, 致使生產(chǎn)效益下降、成本提高。水生動(dòng)物病原體主要包括細(xì)菌、病毒、原生動(dòng)物和真菌等。其中, 細(xì)菌給水生動(dòng)物造成的危害最大。據(jù)統(tǒng)計(jì), 水生動(dòng)物約34%的疾病是由細(xì)菌引起[2]。抗擊水生動(dòng)物的疾病對(duì)公眾健康可能產(chǎn)生巨大影響, 因?yàn)槟承┤诵蠊不疾≡w可通過(guò)與患病動(dòng)物或動(dòng)物源性食品的直接接觸傳播, 存在導(dǎo)致人類(lèi)疾病或?qū)е鹿残l(wèi)生風(fēng)險(xiǎn)[3]。水生養(yǎng)殖動(dòng)物發(fā)病后, 往往使用抗生素治療。然而, 抗生素治療不但容易造成環(huán)境污染, 而且會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生耐藥性細(xì)菌, 所以抗生素的使用正受到越來(lái)越多限制。目前, 世界各國(guó)科學(xué)家都在致力于研究替代抗生素的新療法。噬菌體由于可以特異性地殺死某些細(xì)菌, 對(duì)動(dòng)、植物以及環(huán)境都沒(méi)有副作用, 因此, 在水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治中呈現(xiàn)良好的應(yīng)用前景。下面, 我們對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖中的噬菌體治療研究現(xiàn)狀和存在主要問(wèn)題, 作簡(jiǎn)要概述。

1 噬菌體概述

噬菌體是指可以感染細(xì)菌的病毒, 發(fā)現(xiàn)于20世紀(jì)初, 是由一層蛋白質(zhì)或脂蛋白組成的衣殼包裹著核酸(單鏈或雙鏈DNA或RNA)組成的生物實(shí)體(圖1)。它的衣殼可以保護(hù)噬菌體遺傳物質(zhì), 而尾部可以通過(guò)位于尾部纖維上的特定受體識(shí)別宿主細(xì)菌[4-5]。噬菌體是地球上最豐富、最多樣化的微生物, 其數(shù)量大約是細(xì)菌的10倍。目前, 大多數(shù)已知的噬菌體都屬于有尾病毒目(Caudovirales)的有尾噬菌體。

噬菌體表現(xiàn)出兩個(gè)不同的復(fù)制循環(huán)(周期): 裂解性循環(huán)和溶原性循環(huán)。只表現(xiàn)出裂解循環(huán)的噬菌體為烈性噬菌體, 而同時(shí)表現(xiàn)出裂解循環(huán)和溶原循環(huán)的噬菌體為溫和噬菌體。無(wú)論是裂解性循環(huán)還是溶原性循環(huán), 噬菌體都是從被動(dòng)地黏附到細(xì)菌細(xì)胞(宿主菌)表面特異性受體(或轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)后將基因組注入宿主細(xì)胞開(kāi)始進(jìn)行裂解循環(huán)。在裂解循環(huán)中, 噬菌體基因組在宿主菌細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)自身組分合成, 包括基因組復(fù)制, 從而致使宿主菌細(xì)胞直接裂解。溶原性循環(huán)中, 噬菌體基因組整合到宿主菌基因組中, 并與宿主基因組一起復(fù)制形成原噬菌體。

圖1 噬菌體照片(a)和模式圖(b)

原噬菌體可以以質(zhì)粒的形式存在于宿主菌中, 這一狀態(tài)稱(chēng)為溶原性。溶原性可以持續(xù)很多代, 直到由于環(huán)境因素(如抗生素治療、DNA 損傷等)出現(xiàn)而誘導(dǎo)裂解循環(huán)發(fā)生為止[4-5]。原噬菌體和宿主菌雙方都從溶原性中獲益。一方面, 宿主菌為噬菌體提供生存之所, 另一方面, 原噬菌體可以影響宿主菌代謝特性, 使之獲得對(duì)超級(jí)感染的免疫力和諸如抗生素抗性、毒力因子等新的表型, 有利于其拓展生存環(huán)境。

表現(xiàn)出溶原性循環(huán)的噬菌體即溫和噬菌體被認(rèn)為是參與細(xì)菌細(xì)胞之間基因水平轉(zhuǎn)移的噬菌體。它們可以轉(zhuǎn)移毒力因子或抗生素抗性基因。因此, 溫和噬菌體不適合用于疾病防治。相反, 只表現(xiàn)出裂解循環(huán)的烈性噬菌體, 可以直接裂解宿主菌, 其參與基因轉(zhuǎn)移的可能性有限, 從而使它們可以用于疾病治療[4, 6]。

2 水產(chǎn)養(yǎng)殖中噬菌體治療研究現(xiàn)狀

2.1 噬菌體的發(fā)展簡(jiǎn)史

噬菌體應(yīng)用研究由來(lái)已久。早在1919年, 噬菌體的發(fā)現(xiàn)和命名者之一Felix d’Herelle就開(kāi)始嘗試?yán)檬删w治療人類(lèi)細(xì)菌感染疾病。1921年Richard Bruynoghe和Joseph Maisin發(fā)表了有關(guān)噬菌體治療由金黃色葡萄球菌()引起的皮膚病的論文, 這是第一篇關(guān)于噬菌體治療人類(lèi)細(xì)菌感染性疾病的研究報(bào)告[7]。但是, 隨著磺胺類(lèi)藥()和青霉素()分別于1930和1940年代相繼投入使用, 人類(lèi)對(duì)細(xì)菌感染疾病的治療進(jìn)入抗生素化學(xué)治療時(shí)代, 這極大削弱了對(duì)噬菌體治療的研究熱情, 只在少數(shù)國(guó)家包括前蘇聯(lián)、波蘭和印度仍然進(jìn)行噬菌體治療研究。有趣的是, 自20世紀(jì)80年代, 利用噬菌體治療動(dòng)物細(xì)菌感染[8-12]和治療人類(lèi)多重耐藥性細(xì)菌感染獲得成功以來(lái), 人們又開(kāi)始重視噬菌體治療這一方法。

2.2 噬菌體的研究進(jìn)展

利用噬菌體治療水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物細(xì)菌性疾病, 始于20世紀(jì)90年代。NAKAI等[13]把分離到的格氏乳球菌()噬菌體PLgY, 通過(guò)皮下注射到格氏乳球菌感染的黃尾魚(yú)()的體內(nèi), 發(fā)現(xiàn)可以顯著降低感染黃獅魚(yú)的死亡率。變形假單胞菌()是魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖中常見(jiàn)的一種致病性很強(qiáng)的細(xì)菌, 能導(dǎo)致不同時(shí)期的香魚(yú)()發(fā)病。PARK等[14]發(fā)現(xiàn)讓變形假單胞菌感染魚(yú)苗, 口服分離到的變形假單胞菌的兩株噬菌體PPpW-3和PPpW-4, 不但可以顯著降低病魚(yú)死亡率, 而且可以顯著減少池塘中的變形假單胞菌數(shù), 特別值得注意的是, 治療變形假單胞菌感染的香魚(yú)所用的噬菌體PPpW-3和PPpW-4, 不會(huì)在香魚(yú)體內(nèi)長(zhǎng)期存在, 也不會(huì)誘導(dǎo)香魚(yú)產(chǎn)生中和抗體[15]。中國(guó)學(xué)者在水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物疾病的噬菌體防治方面開(kāi)展了大量研究?；【?Ⅱ)可以感染皺紋盤(pán)鮑(Ino)誘發(fā)膿皰病, 李太武等[16]分離到的河流弧菌Ⅱ的噬菌體, 可以有效地治療或推遲膿皰病引起的鮑死亡, 把鮑成活率提高50%以上。目前, 噬菌體用于治療鮑哈維氏弧菌()感染[17]、牡蠣()副溶血弧菌(s)感染[18]和刺參()鰻弧菌()感染[19]都有報(bào)道(表1)。

2.3 噬菌體的特異性

噬菌體具有很強(qiáng)特異性, 作用一般僅限于少數(shù)或幾種細(xì)菌菌株。噬菌體可以特異識(shí)別目標(biāo)細(xì)菌表面受體, 具有高度特異性, 僅感染一種細(xì)菌屬甚至某些特定菌株。噬菌體不會(huì)損害環(huán)境或宿主的天然微生物群落, 特別是益生菌群落[4]。另外, 噬菌體不會(huì)與真核細(xì)菌相互作用, 僅作用于原核生物細(xì)菌, 因此, 利用噬菌體治療副作用很小[5, 20]。應(yīng)用噬菌體治療感染殺鮭氣單胞菌()的比目魚(yú)()實(shí)驗(yàn)表明, 噬菌體不但有效降低了氣單胞菌(sp.)的感染, 而且對(duì)養(yǎng)殖水體的天然細(xì)菌群落沒(méi)有影響[21], 這與使用抗生素治療結(jié)果形成反差。用抗生素特別是具有廣譜活性的抗生素治療魚(yú)類(lèi)疾病, 會(huì)改變環(huán)境和宿主正常的微生物群落, 并可能導(dǎo)致繼發(fā)感染和耐藥性的出現(xiàn)[22]。

表1 水產(chǎn)養(yǎng)殖中主要的噬菌體治療實(shí)驗(yàn)研究總結(jié)

水生動(dòng)物病原體范圍廣泛, 而噬菌體作用具有特異性, 所以, 分離廣譜噬菌體成為一個(gè)主要研究領(lǐng)域[23]。VINOD等[24]分離出對(duì)50株對(duì)哈維氏弧菌()具有活性的噬菌體, 以保護(hù)蝦幼蟲(chóng); ZHANG等[25]發(fā)現(xiàn)了一種對(duì)副溶血性弧菌()具有廣泛宿主范圍的噬菌體。新近, 劉莉等[26]鑒定到一株廣譜噬菌體, 發(fā)現(xiàn)分離自中華鱉()、南美白對(duì)蝦()、鱸魚(yú)()等養(yǎng)殖動(dòng)物的嗜水氣單胞菌()、遲緩愛(ài)德華氏菌()、副溶血弧菌和黃桿菌()等10多種致病株都對(duì)該噬菌體敏感, 而枯草芽孢桿菌()、酵母菌()等益生菌對(duì)其不敏感, 顯示出該噬菌體在水產(chǎn)動(dòng)物疾病防治中具有良好應(yīng)用前景。

鑒于已發(fā)現(xiàn)的廣譜噬菌體十分有限, 克服噬菌體宿主范圍狹窄這一挑戰(zhàn)的方法還可以使用具有不同特異性的噬菌體混合物來(lái)實(shí)現(xiàn), 這種方法也稱(chēng)為噬菌體雞尾酒療法?；旌衔镏械氖删w各自都有特定的靶細(xì)菌, 它們共同作用, 實(shí)現(xiàn)廣譜殺菌的同時(shí), 又不影響益生菌群落。隨著越來(lái)越多的噬菌體被發(fā)現(xiàn)和鑒定, 使得利用混合噬菌體同時(shí)治療不同的細(xì)菌疾病成為可能[27-28]。目前, 已經(jīng)報(bào)道有混合噬菌體制劑成功應(yīng)用于醫(yī)學(xué)治療[29]。中國(guó)已有一種有噬菌體性質(zhì)的制劑神克隆菌應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物疾病防治, 其對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的主要致病菌如弧菌()、假單胞菌、氣單胞菌、耶爾森氏菌()、愛(ài)德華氏菌()等都較好治療作用。研究還發(fā)現(xiàn), 重復(fù)或連續(xù)使用噬菌體治療比單次使用噬菌體治療效果更好[30]。

3 水產(chǎn)養(yǎng)殖中噬菌體治療存在問(wèn)題

噬菌體療法在水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖上的應(yīng)用雖然前景光明, 但仍有些理論和應(yīng)用問(wèn)題有待解決, 特別是噬菌體基因轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)亟待探索[40, 41]。烈性噬菌體具有高度特異性, 一般不會(huì)破壞有益細(xì)菌, 也不會(huì)影響環(huán)境[42], 人們擔(dān)心的是噬菌體根除病原體可能會(huì)導(dǎo)致空出的生態(tài)位被其他細(xì)菌重新入侵[43], 通過(guò)調(diào)節(jié)宿主菌的數(shù)量改變?nèi)郝浔壤? 從而破壞微生物組對(duì)環(huán)境產(chǎn)生負(fù)面影響。噬菌體還通過(guò)裂解細(xì)菌細(xì)胞釋放有機(jī)物, 也可能對(duì)生物圈中有機(jī)物循環(huán)產(chǎn)生重要影響[44]。這些因素在水生環(huán)境中可以快速傳播, 其作用尤為明顯[45]。使用最小的噬菌體劑量, 可能有助于降低破壞環(huán)境細(xì)菌群落的可能性。但是, 有關(guān)噬菌體的繁殖研究尚不充分, 少量噬菌體在治療期間可能低于閾值且效率低下。因此, 在規(guī)?；瘧?yīng)用之前, 亟需對(duì)每種噬菌體對(duì)微生物群落的影響進(jìn)行研究[41, 46, 47]。

3.1 噬菌體的基因轉(zhuǎn)移

使用噬菌體治療時(shí)要考慮的一個(gè)重要安全因素是基因水平轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。據(jù)報(bào)道細(xì)菌對(duì)噬菌體比對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥性的速率大約慢10倍, 并且耐噬菌體細(xì)菌對(duì)具有相似靶標(biāo)范圍的其他噬菌體沒(méi)有耐藥性[48], 但這仍然是需要重視的問(wèn)題。眾所周知, 選擇壓力和環(huán)境中抗生素的持續(xù)存在會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性。細(xì)菌在結(jié)合和轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中可以通過(guò)基因水平轉(zhuǎn)移獲得抗生素抗性基因。結(jié)合指供體細(xì)菌和受體細(xì)菌通過(guò)細(xì)胞間的暫時(shí)溝通, 將遺傳物質(zhì)自供體菌轉(zhuǎn)入受體菌, 使受體菌獲得供體菌部分遺傳性狀[49]。轉(zhuǎn)導(dǎo)是指外源DNA被引入細(xì)菌細(xì)胞, 這個(gè)過(guò)程不需要細(xì)菌細(xì)胞的直接接觸, 溫和的噬菌體可能會(huì)在這個(gè)過(guò)程中發(fā)揮作用。因此, 水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物疾病防治中, 應(yīng)將具有轉(zhuǎn)導(dǎo)可能的溫和噬菌體排除在外, 僅選擇烈性的噬菌體用于噬菌體雞尾酒療法[50]。有證據(jù)證明, 應(yīng)用噬菌體雞尾酒療法可能是避免細(xì)菌對(duì)噬菌體產(chǎn)生耐藥性的有效方法。MATEUS等[51]發(fā)現(xiàn)一種由3種噬菌體組成的混合物不但可以防治水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物疾病, 而且可能會(huì)延緩細(xì)菌對(duì)噬菌體抗性的發(fā)展, 這是因?yàn)閷?duì)一種以上的噬菌體產(chǎn)生耐藥性意味著細(xì)菌的適應(yīng)成本更高[40, 52]。

3.2 噬菌體賦形

每個(gè)生物系統(tǒng)都是不同的, 因此, 應(yīng)用噬菌體療法進(jìn)行治療或者作為預(yù)防性治療時(shí), 正確的使用方法包括噬菌體的選擇、遞送方式和穩(wěn)定性等因素, 必需獨(dú)立考慮。噬菌體療法成功的第一步是選擇合適的噬菌體, 一般而言, 選擇具有烈性且裂解周期短的噬菌體可以提高治療效率[53]。噬菌體在自然界中非常豐富, 據(jù)報(bào)道每毫升水中含有多達(dá) 104～108個(gè)噬菌體[42], 分離能夠有效應(yīng)用于治療的新型烈性噬菌體仍然是一項(xiàng)重要工作[54-55]。

在水產(chǎn)養(yǎng)殖中, 噬菌體遞送方式包括浸泡、注射、飼喂和局部施用。當(dāng)疾病是外部的或當(dāng)噬菌體穿過(guò)一些天然屏障可以到達(dá)感染的內(nèi)部部位時(shí), 浸泡是一種有效的治療方法[56-57]。噬菌體遞送方式遇到的挑戰(zhàn)之一是噬菌體有時(shí)難以到達(dá)體內(nèi)的細(xì)菌感染部位。噬菌體療法成功的關(guān)鍵是有足夠數(shù)量的噬菌體可以到達(dá)并攻擊目標(biāo)。只有當(dāng)噬菌體被有效地運(yùn)送到感染部位并且它們不被動(dòng)物的免疫系統(tǒng)清除時(shí), 才能實(shí)現(xiàn)有效治療。KALATZIS等[40]報(bào)道魚(yú)類(lèi)的噬菌體療法可以引起其自身免疫系統(tǒng)反應(yīng), 從而清除噬菌體并阻止其到達(dá)感染部位, YUN等[58]驗(yàn)證了噬菌體裂解物可能具有免疫調(diào)節(jié)作用并誘導(dǎo)細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)的事實(shí), 他們使用嗜水氣單胞菌的噬菌體裂解物來(lái)刺激鯉魚(yú), 發(fā)現(xiàn)用噬菌體裂解物的存活率高于用滅活細(xì)菌細(xì)胞疫苗免疫的魚(yú)。這與PARK 等[56, 59]的黃尾魚(yú)()進(jìn)行噬菌體治療后沒(méi)有發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生中和抗體的報(bào)告相矛盾, 因此這個(gè)問(wèn)題尚需深入研究。解決阻礙噬菌體抵達(dá)體內(nèi)細(xì)菌感染部位的可能方法, 一是將噬菌體微膠囊化進(jìn)行保護(hù)[48], 二是篩選噬菌體突變體, 旨在減弱表面蛋白的免疫原性, 使噬菌體不易被動(dòng)物的免疫系統(tǒng)清除[60]。

耐pH和耐熱性對(duì)噬菌體的存活至關(guān)重要。pH可以影響噬菌體的感染性, 低于5 或超過(guò)10時(shí), 感染細(xì)菌效率較低, 大多數(shù)噬菌體在pH為6～8時(shí)活性最佳[61]。當(dāng)魚(yú)類(lèi)胃中pH值較低, 會(huì)影響噬菌體的胞內(nèi)復(fù)制和增殖。解決這一問(wèn)題的方法, 可以在含有噬菌體的魚(yú)飼料上用乳清蛋白涂層[62], 既能控制噬菌體的釋放并保護(hù)它們到達(dá)目的地[41, 60]。溫度對(duì)噬菌體的活力、儲(chǔ)存和發(fā)生關(guān)系密切, 高溫可能會(huì)降解構(gòu)成衣殼的蛋白質(zhì)。水產(chǎn)養(yǎng)殖用水溫度通常適中, 不影響噬菌體活性。需要注意的是在生產(chǎn)過(guò)程中, 有時(shí)需要在低溫或高溫下加工產(chǎn)品, 因此, 這時(shí)最好選擇對(duì)溫度敏感性較低的噬菌體。另外, 水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物疾病治療和預(yù)防治療中, 使用噬菌體的劑量和遞送時(shí)間, 也會(huì)影響治療和預(yù)防效果。

終上所述, 噬菌體由于其對(duì)動(dòng)、植物以及環(huán)境沒(méi)有副作用, 在水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治中具有非常良好的應(yīng)用前景。然而, 目前對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖中的噬菌體治療仍有一些問(wèn)題, 如適用的噬菌體數(shù)量有限及其對(duì)基因水平轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn), 都需要深入研究。

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Research progress and challenges of bacteriophage in the treatment of bacterial infections in aquaculture

GONG Meng-xin, LI Ming-yuan

(School of Life and Geographical Sciences, Kashi University, Kashi 844000, China)

With the rising frequency of diseases in aquaculture as a result of high-density and intensive farming, as well as antibiotics limits, biologists all over the world are investigating alternatives to antibiotics for the treatment of bacterial infection. Bacteriophages can precisely kill some bacteria while having a little detrimental impact on animals, plants, and the environment; they are thus emerging as a promising option for non-antibiotic therapy to treat bacterial diseases. This study briefly examines the research status and major challenges of phage therapy in aquaculture at home and abroad in terms of specificity, safety, shaping method, and environmental impact. The successful application provides a theoretical foundation.

aquaculture; bacteriophage; phage therapy; antibiotic resistance

Jul. 25, 2022

Q939.48

A

1000-3096(2022)11-0160-07

10.11759/hykx20220725001

2022-07-25;

2022-09-13

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(2021D01A18)

[The Natural Science Foundation of Xinjiang Uygur Autonomous Region, No. 2021D01A18]

龔夢(mèng)馨(1994—), 女, 新疆喀什人, 助教, 碩士, 主要從事噬菌體研究, E-mail: mercyxin@163.com; 李明源,通信作者(1984—), E-mail: mingyuan_lee@163.com

(本文編輯: 譚雪靜)