艷錦竹芋葉枯病病原菌的分離與鑒定

張徐玥, 宋蘊哲, 李悅悅, 聶傳朋, 李焰焰, 蔡普默

(武夷學院茶與食品學院，福建 武夷山 354300)

竹芋科(Marantaceae)植物原產于美洲，現已知有27個屬約350種，我國常見的有4個屬10余種，主要分布于我國南部地區(qū)[1]。竹芋科植物除具觀賞價值外，其根莖富含淀粉，可直接煮食或加工后食用，還兼具清肺、利水的藥用功效，深受人們的喜愛[2]。隨著我國引種品種和栽植面積的增加，竹芋病害日趨嚴重。國內已報道的竹芋病害有近10種[3-4]，主要有炭疽病[5-6]、基腐病[5]、葉斑病[6]等。竹芋病害的發(fā)生不僅嚴重影響其觀賞價值，也影響其經濟價值。目前,國內對竹芋病害病原菌的分離鑒定及生物防治的研究仍較少。吳碧云[6]研究發(fā)現，廣州市紫背竹芋(Stromanthesanguinea)炭疽病病原菌為暹羅炭疽菌(Colletotrichumsiamense)；趙京鵬[7]研究發(fā)現，廣州市孔雀竹芋(Calatheamakoyana)基腐病病原菌為天南星麗赤殼(Calonectriaspathiphylli)；陳燦鈿等[8]研究發(fā)現，平臍蠕孢(Bipolarissivanesaniana)可引起廣州市青蘋果竹芋(Calathearotundifoliacv.fasciata)的葉斑病。

2021年5月在武夷學院園藝大棚內發(fā)現種植的艷錦竹芋(Stromanthesanguinea‘Triostar’ )發(fā)生了一種較為嚴重的病害。根據已有關于紫背竹芋屬葉枯病的癥狀描述[3]，診斷該病害為葉枯病。艷錦竹芋又名三色竹芋、艷錦密花竹芋，是竹芋科紫背竹芋屬的多年生草本植物[9]。紫背竹芋屬葉枯病初期多從葉尖開始干枯或產生病斑，后逐漸向葉基侵染，后期葉片干枯卷曲并出現黑色粒狀物，嚴重時植株容易出現死亡[3]。目前，引起艷錦竹芋葉枯病的病原菌種類尚不明確。因此，本研究以武夷山市武夷學院園藝大棚內艷錦竹芋葉枯病葉片為試驗材料，通過分離病原菌和測定致病性，結合系統(tǒng)發(fā)育樹的分析，對艷錦竹芋葉枯病的病原菌進行鑒定，旨在為其葉枯病的診斷及防控提供依據。

1 材料與方法

1.1 病葉采集與病原菌的分離純化

2021年5月，在福建省武夷學院(118°00′E，27°44′N)園藝大棚內對艷錦竹芋癥狀進行拍照，并采集病葉作為供試樣品。參考方中達[10]的常規(guī)組織分離法分離出病葉樣品的病原菌并純化。具體操作為：將病葉樣品用無菌水沖洗干凈，在超凈工作臺切取若干塊2 mm×2 mm病健交界處的病葉組織，用體積分數為75%酒精浸泡30 s，無菌水沖洗3次，風干后放置在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar, PDA)培養(yǎng)基中央，28 ℃下恒溫培養(yǎng)。7 d后挑取菌落邊緣菌絲轉接于PDA培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，重復3次。純化后的菌絲塊(Φ=5 mm)放在裝有無菌水的10 mL離心管中，置于-4 ℃冷凍保存。

1.2 病原菌的致病性測定

采用菌絲塊針刺接種法，分別進行離體和活體接種[10]。用75%酒精和無菌水消毒健康葉片后，隨機在葉片上穿刺5個小孔，作為接種處；在菌落邊緣切取菌絲塊(Φ=5 mm)，將菌絲面貼合接種處，覆蓋濕棉球保濕，以無菌PDA培養(yǎng)基塊(Φ=5 mm)為對照。離體和活體接種的葉片都用上述方法進行處理，均接種6片葉片，重復3次。接種后的離體葉片基部用濕棉球包裹后置于培養(yǎng)皿內(底部鋪有無菌水浸濕的濾紙)，放置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱保濕培養(yǎng)。接種后的活體植株套上透明塑料袋隔絕污染，置于光照通風處，按日常方法管理。定期觀察發(fā)病情況并拍照記錄，待產生病斑后再次分離病原菌。

1.3 病原菌的形態(tài)學觀察

將分離純化的菌株置于PDA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)7 d，測量菌落直徑，觀察并記錄菌落的形態(tài)特征。使用插片法誘導產孢。將有分生孢子的蓋玻片制成臨時裝片，在Nikon相差倒置顯微鏡[Eclipse Ts2，成貫儀器(上海)有限公司]下觀察孢子的大小、形狀以及產孢細胞的形狀和產孢方式，并拍照。

1.4 病原菌的分子鑒定

將純化的菌株接種至新PDA培養(yǎng)基中，待菌絲長滿培養(yǎng)基，刮取適量菌絲體，采用液氮研磨樣本。使用真菌基因組DNA抽取試劑盒(天根生化科技有限公司)提取純化菌株的DNA，-20 ℃下保存。1%瓊脂糖檢測合格后，選用 ITS1/ITS4引物(TCCGTAGGTGAACCTGCGG/TCCTCCGCTTATTGATATGC)進行PCR擴增。PCR反應體系為：10 μL 2×Taq PCR反應混合物溶液、12 μL ddH2O、2 μL DNA、1 μL上游引物和1 μL下游引物。PCR擴增程序為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃總延伸7 min，16 ℃保存。擴增后PCR產物在1%瓊脂糖凝膠中進行電泳檢測。PCR產物經膠回收試劑盒純化后進行DNA測序，由上海派森諾生物科技有限公司完成。將測序結果與NCBI核酸數據庫中的數據進行比對，運用MEGA11軟件，根據鄰位歸并法(neighbor-joining, NJ)構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結果與分析

2.1 葉枯病癥狀及病原菌分離純化結果

患病艷錦竹芋的病害特征主要集中在葉片(圖1)。從圖1A、1B可見，葉片邊緣有不規(guī)則黃褐色的病斑，病健交界處有明顯失綠變黃的暈圈。病原菌多從葉尖和葉緣侵入，形成病斑并沿葉柄蔓延，與相鄰病斑相接形成大病斑，病斑處干枯起皺伴隨卷曲。隨著病斑擴大，導致葉片大面積干枯壞死后脫落。葉片正反面(圖1C、1D)散生大小不等的黑褐色近圓錐形粒狀凸起，多以葉片正面為主，牢牢附著在葉片上，中心為淺褐色。本研究從艷錦竹芋病葉上分離純化得到2株菌落形態(tài)不同的單菌株。

A、B為患病植株;C、D為病斑明顯的病葉正、反面。

2.2 葉枯病病原菌的致病性測定結果

將分離純化得到的2株菌株分別進行致病性測定表明，僅菌株YJ-1有致病性，且發(fā)病情況與病葉樣品邊緣病斑相符。YJ-1離體接種葉片在接種后第5天開始發(fā)病，活體接種葉片在接種后第7天開始發(fā)病，離體接種病斑比活體接種病斑擴展速度更快、范圍更廣，發(fā)病更嚴重。接種初期在接種處開始褪綠發(fā)黃，病斑迅速向四周大面積擴散，無明顯分界，可擴大到整個葉片，背部出現不規(guī)則銹斑(圖2)。離體接種和活體接種均未出現黑褐色凸起小顆粒。從接種發(fā)病的葉片上分離到的菌株形態(tài)學特征與接種菌株YJ-1一致，經柯赫氏法則證實YJ-1為艷錦竹芋葉枯病的病原菌。

A、B為離體接種10 d(正、反面);C、D為離體接種15 d(正、反面);E、F為活體接種15 d(正、反面)。

2.3 葉枯病病原菌的形態(tài)學觀察

在PDA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)7 d后，菌株 YJ-1的菌落直徑約75 mm，呈致密的蛛網狀白色圓形，中央隆起，氣生菌絲發(fā)達，背面出現黃棕色色素(圖3A、3B)；后期菌落平滑，氣生菌絲呈白色卷曲，集結成圓環(huán)狀，背面色素顏色變?yōu)榧t棕色(圖3C、3D)；有芳香氣味。菌絲有隔(圖3E)；分生孢子梗分枝少且明顯，產孢細胞瓶梗單生或2～3個輪生(圖3G)；大分生孢子紡錘形，較直，頂胞稍顯鈍圓，最寬部位在中部以上，3～5隔，分隔不明顯；小分生孢子多為卵圓形或橢圓形，一端稍尖，數量較多，分隔不明顯(圖3F)；厚垣孢子球形或橢圓形，壁厚，多單生，少見對生或串生，表面光滑(圖3H)。根據形態(tài)學觀察，初步鑒定為鐮孢菌屬菌(Fusariumsp.)。

A、B為培養(yǎng)7 d的菌落正、反面;C、D為培養(yǎng)10 d的菌落正、反面;E.為菌絲(400×);F-α.大分生孢子(400×)，F-β.小分生孢子(400×);G.分生孢子梗(400×);H.厚垣孢子(400×)。

2.4 葉枯病病原菌的分子鑒定

菌株YJ-1的ITS測序結果顯示，其序列長度為561 bp。將該序列與NCBI核酸數據庫中的數據進行Blast比對表明，菌株YJ-1(登錄號為ON899813)和NCBI數據庫中芬芳鐮孢菌(F.redolens，登錄號MT563395.1)的相似性達99.82%。系統(tǒng)發(fā)育樹結果顯示，菌株YJ-1與F.redolens聚為一支，置信值為91%(圖4)，表明親緣關系比較近。結合形態(tài)學觀察，將菌株YJ-1鑒定為芬芳鐮孢菌(F.redolens)。

圖4 基于ITS序列構建的菌株YJ-1與相關菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論與結論

本試驗對引起武夷學院園藝大棚內艷錦竹芋患葉枯病的病原菌進行了分離與鑒定，通過形態(tài)學觀察和分子鑒定，并結合系統(tǒng)發(fā)育樹的分析，確定分離的菌株YJ-1為芬芳鐮孢菌，是該病株艷錦竹芋葉枯病的致病菌。

芬芳鐮孢菌屬于鐮孢菌屬美麗組(SectionElegans)，易變且不穩(wěn)定，種內分化和變異顯著[11]。在形態(tài)學上，不僅與同在美麗組的尖孢鐮孢菌(F.oxysporum)很相似，也與茄病鐮孢菌(F.solani)很相似[12]，所以在不同分類系統(tǒng)中有不同的分類地位[13]。1971年，Booth[14]認為其是尖孢鐮孢菌的變種；2001年，Baayen et al[15]證明了芬芳鐮孢菌與F.oxysporum為不同種；2006年，Leslie et al[16]將其定義為種。該菌普遍存在于溫暖地區(qū)的土壤中，多為土傳病害，主要危害植物的根或莖，少有危害植物的葉。據報道，此菌可引起大豆、馬鈴薯、小麥等植物的枯萎病[17-19]。目前尚未見芬芳鐮孢菌侵染竹芋科植物的報道。芬芳鐮孢菌是否還可侵染其他竹芋品種，引起竹芋發(fā)病的癥狀是否一致，有待進一步研究。

本研究僅對艷錦竹芋葉枯病的致病菌進行分離和初步鑒定，建議今后深入開展發(fā)病規(guī)律、致病機理、病原菌與宿主之間關系等研究，并對鑒定的致病菌進行生防制劑的篩選，以期為竹芋科觀葉植物的病害防治提供參考。