福建仙草細(xì)菌性枯萎病的病原菌鑒定

吳水良, 林可竟, 張一帆, 詹夢琳, 胡方平, 蔡學(xué)清

(福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,福建 福州 350002)

仙草(Mesonachinensis)又名仙人草、涼粉草，為唇形科仙草屬1年生草本植物，主產(chǎn)于我國的福建、廣西、廣東等省份。仙草含有黃酮類物質(zhì)、維生素等活性成分，是一種重要的藥食兩用植物資源[1]。目前，有關(guān)仙草病害的報(bào)道較少，主要有茄雷爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)引起的細(xì)菌性青枯病[2-3]、果膠桿菌(Pectobacteriumsp.)引起的莖褐腐病[3]、立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)引起的莖葉枯病[4]、根結(jié)線蟲(Meloidogynesp.)引起的根結(jié)線蟲病[3,5]、菟絲子(Cuscutasp.)引起的草害等，以及由有害化學(xué)物質(zhì)污染、水分失調(diào)、營養(yǎng)失調(diào)(缺鋅、缺鉀、缺氮)等引起的非侵染性病害[3]。隨著人工栽培面積的不斷擴(kuò)大，危害仙草的病蟲害種類及發(fā)生程度逐年加重，部分病害嚴(yán)重發(fā)生并造成減產(chǎn)，甚至絕收。

仙草在福建省栽培歷史悠久，南平市建甌區(qū)和龍巖市長汀縣、武平縣是福建省的主要種植地區(qū)。近年來，武平縣種植的仙草發(fā)生了一種系統(tǒng)性病害。該病害危害仙草的根部和莖稈，初期葉片變黃、植株萎蔫，隨后維管束褐變，最后植株死亡。該病害蔓延迅速，危害嚴(yán)重，輕則造成仙草減產(chǎn)，重則導(dǎo)致絕收，嚴(yán)重影響了該地區(qū)的仙草生產(chǎn)，給當(dāng)?shù)胤N植戶帶來重大的經(jīng)濟(jì)損失。通過切取病組織鏡檢，可見明顯的溢菌現(xiàn)象，推測該病害由細(xì)菌引起。此外，田間癥狀與已報(bào)道的仙草細(xì)菌性青枯病(Ralstoniasolanacearum)相似[2]。鑒于在福建省尚未見系統(tǒng)鑒定該病害病原物的報(bào)道，本研究對(duì)其病原菌進(jìn)行分離鑒定，以期為有效防治該病害提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試病株 2020—2021年采自福建省龍巖市武平縣平川鎮(zhèn)，于福建農(nóng)林大學(xué)細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原菌的分離。

1.1.2 供試菌株 甘薯青枯菌菌株GSRS1、番茄青枯菌菌株FQRS1均由本課題組分離鑒定保存；大腸桿菌JM109由本課題組保存。

1.1.3 供試培養(yǎng)基 NB、NA(NB培養(yǎng)基中加入20 g·L-1瓊脂)以及TTC培養(yǎng)基的配方均參照方中達(dá)[6]的方法。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌分離純化 參照方中達(dá)[6]方法對(duì)病組織病原菌進(jìn)行分離，即用體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精溶液將病組織表面進(jìn)行消毒后，用無菌水沖洗3遍，再用滅菌解剖刀切取約0.5 cm×0.5 cm病株莖部病健交界處的組織塊，置于滅菌的培養(yǎng)皿內(nèi)，加約0.5 mL無菌水破碎組織，靜置30 min。后用接種環(huán)蘸取少量組織液在NA培養(yǎng)基平板上以分區(qū)劃線法劃線，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱(DZ47-63，寧波賽福)中培養(yǎng)，待其長出單菌落后用常規(guī)方法純化，純化后的菌株保存在-75 ℃低溫冰箱(DW-86L386，海爾)中備用。

1.2.2 病原菌的致病性測定 將待測細(xì)菌接種到NB培養(yǎng)液，置于恒溫?fù)u床中，28 ℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)24 h，獲得細(xì)菌懸浮液。將細(xì)菌懸浮液稀釋為0.3×109CFU·mL-1后用于致病性測定。用傷根接種法和注射接種法測定病原菌的致病性。(1)傷根接種。用無菌小刀在仙草苗兩側(cè)切斷根系，每株澆灌待測菌懸液30 mL，以無菌水接種作對(duì)照。接種后，觀察發(fā)病情況并記錄。(2)注射接種。用滅菌注射器吸取1 mL待測菌懸液注射仙草莖稈維管束，以無菌水接種作對(duì)照。接種后，保濕培養(yǎng)并觀察記錄發(fā)病情況。以上每處理重復(fù)3次。對(duì)上述接種后發(fā)病的仙草，進(jìn)行病原菌再分離、純化。

1.2.3 病原菌生物學(xué)特性和生理生化反應(yīng)測定 采用負(fù)染法，在透射電子顯微鏡(JEM1010)下對(duì)細(xì)菌菌體和鞭毛的形態(tài)特征進(jìn)行觀察。參照方中達(dá)[6]的方法，將供試細(xì)菌在NA培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)24～48 h，觀察菌落顏色、大小、形狀等性狀特征。參照文獻(xiàn)[7]的方法，測定供試菌株對(duì)木糖、海藻糖、丙三醇、葡萄糖、阿拉伯糖、肌醇和酒石酸鈉等的利用；以及菌株對(duì)果膠酶的活性、果聚糖利用、精氨酸水解、氧化酶實(shí)驗(yàn)、聚-β-羥基丁酸鹽(PHB)的積累、KB產(chǎn)熒光現(xiàn)象、硝酸鹽還原、41 ℃生長等生理生化反應(yīng)。

1.2.4 馬鈴薯接種 用75%酒精溶液對(duì)馬鈴薯塊莖表面進(jìn)行消毒，在無菌條件下將其切成塊狀(3.0 cm×3.0 cm×2.0 cm)置于滅菌的培養(yǎng)皿中。用接種環(huán)挑取培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)24 h的細(xì)菌菌落，涂抹到馬鈴薯小塊上，并滴1～2滴(約10 μL)無菌水，同時(shí)在培養(yǎng)皿底部加入少許無菌水，30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)24 h，觀察馬鈴薯小塊發(fā)病腐敗情況。

1.2.5 青枯菌的特異性引物鑒定及其演化型和生化型測定 參照Opina et al[8]和Fegan et al[9]方法，利用青枯菌特異性引物759F/760R和演化型復(fù)合引物(Nmult21∶1F、Nmult21∶2F、Nmult23∶AF、Nmult22∶InF、Nmult22∶RR、759F、760R)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測定菌株的演化型。參照Huang et al[10]方法，測定菌株對(duì)3種雙糖(麥芽糖、乳糖、纖維二糖)和3種己醇(甘露醇、甜醇、山梨醇)的利用。

1.2.6 16S rDNA基因擴(kuò)增 利用通用引物27F/1492R擴(kuò)增供試菌株的16S rDNA基因片段，其擴(kuò)增體系和擴(kuò)增條件同Lane[11]方法。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳分析驗(yàn)證后送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序，所得序列輸入NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，并利用BLAST軟件比對(duì)分析，用 MEGA 7.0(Molecular evolutionary genetics analysis 7.0)軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，采用鄰接法(neighbor-joining method, NJ)構(gòu)建發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害的癥狀

根部和莖稈是病害的主要危害部位(圖1)。發(fā)病初期，頂部葉片表現(xiàn)中午失水萎蔫狀，早晚恢復(fù)，隨著病情的發(fā)展，病葉向下擴(kuò)展至整株失水萎蔫，但植株葉片仍保留綠色，呈青枯狀。4～5 d后植株萎蔫不可恢復(fù)，葉片發(fā)病部位沿著主葉脈向側(cè)脈發(fā)生褐變，最后葉片變黃脫落；根和莖基部維管束變褐，發(fā)病后期植株死亡?？v切莖稈，用手?jǐn)D壓，可見乳白色菌膿溢出。

A.田間癥狀；B.病株；C.病枝干。

2.2 病原菌的分離和致病性測定

從田間采集的病株上分離純化獲得了8株細(xì)菌菌株，編號(hào)為X1～X8。純化后的菌株用于致病性測定和病原菌的鑒定。注射或傷根接種的致病性測定結(jié)果均顯示，8株細(xì)菌菌株接種仙草后均產(chǎn)生與田間病株相同的癥狀，即初期可見仙草植株葉片變黃，后植株萎蔫，早晚恢復(fù)，后期維管束變褐，植株死亡。從接種后發(fā)病的植株上重新分離獲得與原始接種菌株菌落形態(tài)特征相同的細(xì)菌菌株，經(jīng)柯赫氏法則證實(shí)這8株細(xì)菌均是該病害的病原菌。

2.3 病原菌的鑒定

2.3.1 形態(tài)特征 供試菌株在NA培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)48 h后，其菌落呈白色、圓形，邊緣不規(guī)則，表面濕潤，流動(dòng)性大；在TTC培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)48 h后，其菌落中間呈粉紅色，邊緣白色，表面濕潤，流動(dòng)性大；革蘭氏染色陰性(G-)；透射電子顯微鏡下觀察到,細(xì)菌的菌體呈短桿狀，兩端鈍圓，極生鞭毛1～2根(圖2)。

圖2 X1菌株的鞭毛(12 000×)

2.3.2 碳水化合物的利用及生理生化特征 X1～X8菌株對(duì)碳水化合物的利用和分解及生理生化測定結(jié)果見表1。從表1可見，X1～X8菌株均可利用木糖、海藻糖、丙三醇、葡萄糖、阿拉伯糖，不能利用肌醇和酒石酸鈉；精氨酸水解酶陰性，不能使馬鈴薯薯塊腐敗，在41 ℃下不能生長，在KB培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)不產(chǎn)生水溶性綠色熒光；PHB積累、果聚糖、氧化酶、果膠酶和硝酸鹽還原反應(yīng)均為陽性，其中除了氧化酶活性的測定結(jié)果與對(duì)照菌株GSRS1和FQRS1不同外，其余的測定結(jié)果均與GSRS1和FQRS1相一致。

表1 仙草細(xì)菌性枯萎病病原菌的生理生化反應(yīng)和碳水化合物利用1)

2.3.3 青枯菌的演化型及生化型 青枯菌特異性引物759F/760R 的PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果顯示，X1～X8菌株擴(kuò)增出280 bp的特異性片段，與對(duì)照菌株FQRS1的擴(kuò)增結(jié)果一致(圖3A)。因此，將X1～X8菌株鑒定為青枯菌(Ralstoniasolanacearum)。青枯菌復(fù)合引物PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果顯示，擴(kuò)增出的2條條帶片段分別為280、144 bp(圖3B)，參照Fegan et al[9]青枯菌演化型框架的劃分標(biāo)準(zhǔn)，將X1～X8菌株鑒定為演化型I； X1～X8菌株對(duì)3種雙糖(乳糖、麥芽糖、纖維二糖)和3種己醇(甘露醇、山梨醇、甜醇)的利用結(jié)果與對(duì)照菌株FQRS1和GSRS1相一致(表2)，根據(jù)Hayward[12]提出的青枯菌生化型劃分標(biāo)準(zhǔn)，將X1～X8菌株鑒定為生化型Ⅲ。

表2 供試菌株的生化型測定1)

M.DL2000；泳道1～8分別為X1～X8菌株；泳道9.FQRS1;泳道10.無菌水。

2.3.4 16S rDNA基因序列分析 用細(xì)菌的通用引物27F/1492R對(duì)代表菌株X3進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得約1 500 bp的目的條帶。經(jīng)回收，將該基因片段轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109，挑取陽性克隆子，酶切驗(yàn)證正確后委托生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序，獲得的序列總長為1 517 bp (GenBank Nos. GI387861248)。通過NCBI在線序列比對(duì)，數(shù)據(jù)庫中共有百余條16S rDNA部分序列與供試菌株的16S rDNA序列同源性在95%～98%之間，其中Ralstoniapseudosolanacearum和Ralstoniasolanacearum菌株的16S rDNA基因序列與X3菌株的16S rDNA基因序列同源性為98%。從GenBank中下載已提交的部分Ralstoniapseudosolanacearum、Ralstoniasolanacearum、Ralstoniasyzygii、Ralstoniapickettii等10個(gè)近源種菌株的16S rDNA基因序列，用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行比較。分析表明，X3菌株與已登錄的Ralstoniapseudosolanacearum菌株CIP 365、Ralstoniapseudosolanacearum菌株GMI 1000和Ralstoniapseudosolanacearum菌株MAFF 211475聚在一個(gè)分支上，它們之間的遺傳距離最短，將X3菌株鑒定為Ralstoniapseudosolanacearum，演化型Ⅰ(PhylotypeⅠ)(圖4)。

圖4 X3菌株與相近種的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

根據(jù)Safni et al[13]2014 年對(duì)青枯菌重新劃分的分類法，將新發(fā)生的仙草細(xì)菌性病害病原菌鑒定為假茄科雷爾氏菌(Ralstoniapseudosolanacearum,異名：Ralstoniasolanacearum)，生化型Ⅲ。這與Liu et al[2]報(bào)道引起廣東省仙草細(xì)菌性青枯病的病原菌(Ralstoniasolanacearum)相同。Fegan et al[9]提出了以演化型分類框架來描述青枯菌種以下的差異，演化型為亞種水平，并將已報(bào)道的青枯菌劃分為4個(gè)演化型即演化型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ，而演化型Ⅰ包含了所有來自亞洲的生化型Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ。根據(jù)此演化型分類依據(jù)，已有研究報(bào)道侵染花生[14]、筍瓜[15]、番茄[16]、煙草[17-18]、胡椒[19]、桑[20]、姜[21]、星油藤[22]、薔薇[23]等作物的青枯病菌(Ralstoniapseudosolanacearum)主要以演化型Ⅰ為主。依據(jù)Fegan et al[9]對(duì)青枯菌的分類框架鑒定表明，武平縣發(fā)生的仙草細(xì)菌性枯萎病病原菌屬于演化型Ⅰ(PhylotypeⅠ)，與已報(bào)道的相一致[14-23]。

目前，根據(jù)青枯病菌對(duì)3種雙糖和3種己醇氧化產(chǎn)酸能力的差異，將生化型劃分為5個(gè)，即生化型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ[12,24]。She et al[15]報(bào)道，廣東省16種寄主植物上分離的110株青枯菌菌株分屬于4種生化型，即生化型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ，而生化型Ⅲ和Ⅳ為優(yōu)勢群體。姜青枯病菌[21]、星油藤青枯菌[22]和玫瑰青枯病菌[25]也屬于生化型Ⅲ。林維英等[26]報(bào)道，福建番茄青枯雷爾氏菌有2個(gè)生化型，分別為生化型Ⅲ和Ⅳ，生化型Ⅲ占絕大多數(shù)。陳曉敏等[27]報(bào)道，福建花生青枯病菌屬于生化型Ⅲ。本研究從福建仙草病莖上分離的菌株屬于生化型Ⅲ，與已有報(bào)道的我國作物青枯菌的優(yōu)勢群體為生化型Ⅲ的結(jié)果相一致[15,20-22,24-27]。關(guān)于福建省仙草細(xì)菌性枯萎病菌是否存在其他的生化型，如生化型Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ，需收集福建省不同地區(qū)發(fā)生的仙草細(xì)菌性枯萎病菌菌株進(jìn)一步測定。