粵糖93-159再生體系的建立

趙振麗, 黃潮華, 徐良年, 鄧祖湖, 趙新旺,2, 黃國(guó)強(qiáng)

(1.福建農(nóng)林大學(xué)國(guó)家甘蔗工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350002；2.廣西大學(xué)廣西甘蔗生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530004)

甘蔗(Saccharumspp.)為禾本科甘蔗屬植物，原產(chǎn)于熱帶以及亞熱帶地區(qū)[1]。甘蔗不僅是糖料作物，還是重要的能源作物[2]。我國(guó)甘蔗種植區(qū)主要分布在云南、廣東、廣西、海南等地，其中廣西地區(qū)的種植面積最大，約77.48萬(wàn)hm2[3-4]。組織培養(yǎng)是實(shí)現(xiàn)植物離體快繁的有效途徑，也是植物脫毒和遺傳轉(zhuǎn)化的重要基礎(chǔ)。甘蔗是第1個(gè)組織培養(yǎng)成功的禾本科植物[5]。組培過(guò)程中可能出現(xiàn)一些變異類型，可為育種提供一些特殊的基因型，如20世紀(jì)70年代就有研究者利用甘蔗組織培養(yǎng)獲得抗斐濟(jì)病亞無(wú)性系材料[6]；利用甘蔗愈傷組織可獲得轉(zhuǎn)基因材料，如羅遵喜等[7]利用新臺(tái)糖22號(hào)的愈傷組織獲得了抗花葉病毒的轉(zhuǎn)基因植株，胡天嬌[8]利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法把抗蟲(chóng)基因Cry2A轉(zhuǎn)入到甘蔗的愈傷組織，獲得了抗蟲(chóng)植株；用誘變劑處理甘蔗愈傷組織可獲得表現(xiàn)良好的突變材料，如陸耀邦等[9]用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的EMS處理桂糖1號(hào)、桂糖11號(hào)、臺(tái)糖134的愈傷組織，獲得了2個(gè)高產(chǎn)高糖突變株系。

粵糖93-159由中國(guó)輕工業(yè)總會(huì)甘蔗糖業(yè)研究所雜交選育，其母本是粵農(nóng)73-204，父本是美國(guó)大陸蔗區(qū)主栽品種CP72-1210[10]。該品種屬于特早熟、高產(chǎn)、高糖品種，具有萌芽率高、分蘗力強(qiáng)、生長(zhǎng)快和長(zhǎng)勢(shì)均勻等特點(diǎn)[11]，2014—2019年累計(jì)種植約47.95 hm2[12]?；浱?3-159常用作雜交育種的親本，以其為親本選育出粵糖06-233、粵糖05-267、粵糖03-373等優(yōu)良品種。但粵糖93-159抗旱性略差，對(duì)花葉病菌敏感[7,13]。若以粵糖93-159為基礎(chǔ)基因型，結(jié)合組織培養(yǎng)、誘變等方法，通過(guò)人工定向選擇和鑒定，有望創(chuàng)制出具有抗旱、抗病等優(yōu)良特性的突變體材料?；诖耍狙芯繉?duì)粵糖93-159進(jìn)行了愈傷組織誘導(dǎo)、分化和生根的試驗(yàn)，以期建立其再生體系。

1 材料與方法

1.1 供試材料

2021年7月，選取福建農(nóng)林大學(xué)甘蔗種質(zhì)資源圃保育的粵糖93-159為供試材料。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng) 晴朗的中午，取田間生長(zhǎng)健壯的甘蔗莖梢部位，用體積分?jǐn)?shù)為75%酒精消毒外表后置于超凈工作臺(tái)中進(jìn)行無(wú)菌操作。將外葉鞘層層剝至出現(xiàn)直徑大約為1 cm的白色幼嫩心葉部分，將其切成約1～2 mm厚的心葉片接種到愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。以MS+30 g·L-1蔗糖+7 g·L-1瓊脂為基本培養(yǎng)基，愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基(A1～A4)分別添加1.0、2.0、3.0、4.0 mg·L-12,4-D。每個(gè)處理接種5瓶，每瓶接種6片，3次重復(fù)。25 ℃暗培養(yǎng)15 d后，觀察、統(tǒng)計(jì)愈傷的誘導(dǎo)情況。

愈傷誘導(dǎo)率/%=(誘導(dǎo)出愈傷的心葉片數(shù)/接種心葉片數(shù))×100

1.2.2 愈傷組織的分化培養(yǎng) 選擇生長(zhǎng)狀況一致、大小均勻的愈傷組織，接種到分化培養(yǎng)基上。以MS+0.2 mg·L-1NAA+30 g·L-1蔗糖+7 g·L-1瓊脂為基本培養(yǎng)基，分化培養(yǎng)基(B1～B5)分別添加0、1.0、2.0、3.0、4.0 mg·L-1細(xì)胞分裂素6-BA。每個(gè)處理接種6瓶，每瓶接種5塊愈傷，3次重復(fù)。于光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行芽的分化誘導(dǎo)，設(shè)置培養(yǎng)溫度為28 ℃，光照強(qiáng)度為54 μmol·m-2·s-1，光周期為12 h·d-1，20 d后統(tǒng)計(jì)分化率。

分化率/%=(分化出芽的愈傷組織塊/接種愈傷組織塊總數(shù))×100

1.2.3 生根誘導(dǎo)培養(yǎng) 分化培養(yǎng)獲得的組培苗繼代增殖2～3代后，選擇大小一致的組培苗(4～5片葉)接種到生根培養(yǎng)基。以1/2MS+30 g·L-1蔗糖液體培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，生根培養(yǎng)基(C1～C6)分別添加2.0、3.0、4.0 mg·L-1NAA和0、0.5 mg·L-1活性炭(activated carbon, AC)。每個(gè)處理接種5瓶，每瓶接種10株，3次重復(fù)。培養(yǎng)20 d后，觀察、統(tǒng)計(jì)根系的生長(zhǎng)狀況。

1.2.4 煉苗馴化與移栽 生根誘導(dǎo)培養(yǎng)約20 d后，將組培瓶苗移到自然光下繼續(xù)煉苗1周，而后打開(kāi)瓶蓋再煉苗馴化3 d，使苗逐步適應(yīng)外界的光、溫、濕度條件。煉苗馴化后洗凈根部殘留的培養(yǎng)基，將苗在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%多菌靈消毒液中浸泡10～15 min，之后將苗移栽到穴盤(pán)中。以營(yíng)養(yǎng)土、黃土和細(xì)砂等比例混合為栽培基質(zhì)。移栽后蓋上盤(pán)蓋保溫保濕3～5 d，期間全程置于遮陽(yáng)網(wǎng)下以免強(qiáng)光照射，待苗抽出新葉后再揭去盤(pán)蓋讓其自然生長(zhǎng)。

1.3 統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel統(tǒng)計(jì)與整理數(shù)據(jù)，采用SPSS進(jìn)行LSD和Duncan分析。使用根系掃描儀(Epson prepection 700 photo)掃描根系狀態(tài)，利用根系分析軟件Winrhizo分析根系圖片。

2 結(jié)果與分析

2.1 2,4-D濃度對(duì)粵糖93-159愈傷誘導(dǎo)的影響

從表1可見(jiàn)，4種質(zhì)量濃度2,4-D均能誘導(dǎo)出愈傷組織，但不同濃度誘導(dǎo)出的愈傷狀態(tài)存在明顯差異。其中，A4處理(4.0 mg·L-12,4-D)的誘導(dǎo)率最低且愈傷組織的狀態(tài)最差，出現(xiàn)了嚴(yán)重的褐化；A2處理(2.0 mg·L-12,4-D)誘導(dǎo)率達(dá)到95.37%，顯著高于其他處理，愈傷淡黃色且體積較大、結(jié)構(gòu)緊密，明顯比其他處理新鮮、有活力(圖1)。因此，誘導(dǎo)粵糖93-159愈傷組織的最佳2,4-D質(zhì)量濃度為2.0 mg·L-1。

A.誘導(dǎo)15 d;B.繼代15 d。

表1 不同濃度2,4-D對(duì)粵糖93-159愈傷誘導(dǎo)的影響1)

2.2 6-BA濃度對(duì)粵糖93-159愈傷分化的影響

把愈傷組織轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基上，1周左右即可分化出芽。從表2和圖2可以看出，不含6-BA的B1處理愈傷組織褐化嚴(yán)重，分化率最低，芽弱??；B2處理(1.0 mg·L-16-BA)分化率為42.22%，芽生長(zhǎng)健壯；B3處理(2.0 mg·L-16-BA)分化率為41.11%，芽生長(zhǎng)健壯。當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度提高到3.0 mg·L-1時(shí)，B4處理分化率反而下降，芽長(zhǎng)勢(shì)一般；提高到4.0 mg·L-1時(shí)，B5處理分化率進(jìn)一步下降且愈傷組織褐化嚴(yán)重。由上可見(jiàn)，高濃度的6-BA(≥3.0 mg·L-1)不利于愈傷的分化。B2、B3處理分化率相近，芽都生長(zhǎng)健壯，但B2處理節(jié)省了試劑，因此分化培養(yǎng)基的6-BA最佳質(zhì)量濃度為1.0 mg·L-1。

B1.未添加6-BA;B2～B5分別添加1.0、2.0、3.0、4.0 mg·L-1 6-BA。

表2 不同濃度6-BA對(duì)粵糖93-159愈傷組織分化的影響1)

2.3 活性炭和NAA對(duì)粵糖93-159組培苗生根的影響

根長(zhǎng)、根表面積以及根平均直徑是衡量根系生長(zhǎng)好壞的重要指標(biāo)。如表3所示，NAA能夠促進(jìn)粵糖93-159組培苗根系的生長(zhǎng)，C3處理(4.0 mg·L-1NAA)相較于C1處理(2.0 mg·L-1NAA)根長(zhǎng)更長(zhǎng)，根表面積更大，但根系較細(xì)；C2處理(3.0 mg·L-1NAA)和C3處理根系生長(zhǎng)差異不明顯。活性炭能夠吸附有害物質(zhì)，抑制褐化。從表3可見(jiàn)，生根培養(yǎng)基僅添加3.0 mg·L-1NAA、未添加活性炭，粵糖93-159組培苗根系粗壯、根數(shù)多，根較短且出現(xiàn)了愈傷(圖3A)；添加3.0 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-1活性炭，粵糖93-159組培苗根系較長(zhǎng)，但根數(shù)較少且較細(xì)(圖3B)。因此，粵糖93-159最佳生根培養(yǎng)基為：3.0 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-1活性炭。

表3 活性炭和NAA對(duì)粵糖93-159組培苗生根的影響1)

A.3.0 mg·L-1 NAA；B.3.0 mg·L-1 NAA+0.5 mg·L-1活性炭。

3 討論與結(jié)論

本研究以粵糖93-159嫩葉鞘作為外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，污染率低，誘導(dǎo)效果比較好。其他植物中，如煙草[14]、馬鈴薯[15]等常選用葉片作為外植體，白菜[16]、番茄[17]等常選用子葉和下胚軸作為外植體。這些外植體進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)時(shí)，消毒殺菌通常較繁瑣，包括75%酒精浸泡、無(wú)菌水沖洗、氯化汞浸泡等步驟。本研究中，由于甘蔗嫩葉鞘位于生長(zhǎng)點(diǎn)上，不需要多步驟消毒，減輕了工作量。

基因型差異是影響植物組培特性的最主要因素，不同基因型甘蔗離體培養(yǎng)效果不同。呂平等[18]研究發(fā)現(xiàn)，相同條件下新臺(tái)糖22號(hào)、03-75、B8、02-64等4個(gè)甘蔗品種(系)愈傷組織的誘導(dǎo)率、分化率、增殖率和生根率不同，說(shuō)明不同基因型在組織培養(yǎng)過(guò)程中表現(xiàn)出來(lái)的特性不同。陳敏敏等[19]對(duì)3種基因型甘蔗材料進(jìn)行組織培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)不同基因型莖尖褐化率及成活率不同。梁麗君[20]利用Badila進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)時(shí)，誘導(dǎo)率為87.5%。本研究利用2,4-D處理粵糖93-159嫩葉鞘組織，得到的最佳誘導(dǎo)率為95.37%；利用6-BA進(jìn)行分化培養(yǎng)，得到最佳分化率為42.22%。因此，甘蔗基因型不同，離體培養(yǎng)效果有差異。

激素濃度的控制對(duì)再生體系的建立至關(guān)重要。2,4-D是促進(jìn)外植體脫分化的有效激素[21]。本研究中，低濃度2,4-D誘導(dǎo)出來(lái)的粵糖93-159愈傷組織細(xì)胞團(tuán)易破碎，較高濃度誘導(dǎo)出來(lái)的愈傷組織褐化嚴(yán)重且細(xì)胞團(tuán)質(zhì)地較軟，這與韋海球等[22]對(duì)桂柳05136愈傷的誘導(dǎo)結(jié)果相一致。本研究中， 2,4-D最佳誘導(dǎo)濃度為2.0 mg·L-1，此濃度下誘導(dǎo)出來(lái)的愈傷組織質(zhì)量較好。甘蔗愈傷組織的誘導(dǎo)還要注意取材時(shí)間、季節(jié)。劉怡等[23]研究表明，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入少量椰乳也能夠較大提高愈傷組織的質(zhì)量。朱萬(wàn)升等[24]研究表明，6-BA能夠促進(jìn)細(xì)胞分裂，在分化培養(yǎng)基中添加少量NAA分化效果則更明顯。6-BA濃度過(guò)低或過(guò)高均不利于愈傷組織的分化，且愈傷組織褐化嚴(yán)重、分化出來(lái)的芽較弱小，生長(zhǎng)緩慢[25-26]。本研究中，1.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA為最佳分化激素組合。生根是建立再生體系的重要環(huán)節(jié)，強(qiáng)壯的根系能夠提高組培苗移栽時(shí)的存活率[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，3.0 mg·L-1NAA處理最有利于組培苗根系生長(zhǎng)；本研究還發(fā)現(xiàn)，含有3.0 mg·L-1NAA的生根培養(yǎng)基中添加0.5 mg·L-1活性炭，根系更長(zhǎng)更多，這與徐新江等[28]對(duì)新臺(tái)糖16號(hào)生根試驗(yàn)結(jié)果相一致。

綜上所述，本研究利用不同濃度的激素處理有效建立了粵糖93-159的再生體系，為該品種組培快繁、遺傳轉(zhuǎn)化體系建立及利用愈傷組織進(jìn)行誘變育種等提供了理論依據(jù)。