替米考星可溶性粉在烏雞體內(nèi)的藥動學(xué)研究*

秦曉冰（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)/山東省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點實驗室，山東 青島 266109）

替米考星（Timicosin）可溶性粉為類白色結(jié)晶性粉末，屬于大環(huán)內(nèi)酯類半合成抗菌藥，具有抗菌性強、吸收快、分布容積大、與其它藥物無交叉等特點，已被廣泛應(yīng)用于雞、豬、牛、羊等畜禽[1-3]。替米考星敏感菌主要包括革蘭氏陽性菌、部分革蘭氏陰性菌、螺旋體等，特別是對巴氏桿菌、支原體和胸膜肺炎放線菌等有較好的作用[4-6]。家禽生產(chǎn)中常常被各種病原微生物侵襲，其中能夠感染家禽的支原體就達20余種，一旦感染很難根除，而且往往與其它病原微生物混合感染，降低家禽的生產(chǎn)性能，造成養(yǎng)禽業(yè)嚴(yán)重的損失[7]。由于支原體類型復(fù)雜，疫苗免疫效果不甚理想，目前多使用大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類、喹諾酮類進行治療。隨著減抗政策的不斷實施，替米考星作為非處方藥經(jīng)常被用來預(yù)防和治療支原體等病。關(guān)于替米考星在動物體內(nèi)的藥動力學(xué)國內(nèi)外均有報道[8-9]，但在烏雞體內(nèi)的研究目前尚無資料。10%磷酸替米考星可溶性粉與10%替米考星可溶性粉效果相當(dāng)，增加磷酸基團顯著增加了水溶性，使得該藥應(yīng)用更加便捷廣泛。本研究將通過對替米考星在烏雞體內(nèi)的藥動學(xué)研究，為該藥在給藥方案和臨床上合理應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品及配制

10%的磷酸替米考星可溶性粉，批號190404，購自諸城市華特獸藥有限公司，推薦雞混飲用量：2.5 g/L。

替米考星對照品，含量為95.0%，購自德國Dr.Ehrenstorfer Gmb H公司，批號17582000。

磷酸替米考星飲用水（口服液）的配制：10%磷酸替米考星可溶性粉使用前用蒸餾水配成1 g/L溶液，供口服給藥。

替米考星標(biāo)準(zhǔn)貯備液（標(biāo)準(zhǔn)液）的配制：對照品用天平稱取27.47 mg，流動相溶解后，定容，配制濃度為1 mg/mL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗動物與分組

60日齡黑鳳烏雞24只，公母各半，體重（1.0±0.1）kg，購自青島市城陽區(qū)仙家寨養(yǎng)殖場。隨機分為A組和B組，每組12只，公母各半。A組服用口服液，B組服用標(biāo)準(zhǔn)液，服用劑量為12 mg/kg體重（以替米考星計）。雞只給藥前12 h禁飼，自由飲水，飼喂全價日糧。

1.3 主要試劑與儀器

乙腈、甲醇和四氫呋喃，色譜級，購自Fisher Scientific公司；正己烷和二氯甲烷，分析純，購自天津市大茂化學(xué)試劑廠；二正丁胺，色譜純，購自Sigma-Aldrich Chemie GmbH。

高效液相色譜儀（購自島津儀器有限公司）、漩渦混合儀（購自德國IKA公司）、離心機（購自德國Sigma公司）、超聲機（購自寧波科生儀器廠）。

1.4 血樣采集

在給藥前采血一次，記為0 h，給藥后0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、16、24、48、72 h各采血一次。采血部位為雞翼下靜脈，劑量為每次2 mL。置于含肝素鈉的管中，離心出血漿，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 血漿中替米考星的測定

準(zhǔn)確吸取0.1 mL烏雞血漿于1 mL離心管內(nèi)，加入0.4 mL二氯甲烷-正己烷混合液，渦旋1 min，8000 r/min離心5 min，取上清液，35 ℃水浴下蒸干，取0.4 mL流動相溶解漩渦，0.45 μm的微孔濾膜過濾后進行HPLC分析。

從表2中可以看出，與安靜對照組相比，力竭運動即刻組(E0)骨骼肌和血清中AMPK含量上升，有極顯著性差異(P<0.01)；而C組、E24組、E48組之間骨骼肌和血清中AMPK含量無明顯差異。

色譜條件：C18色譜柱；280 nm檢測波長；0.05mol/L磷酸-二丁胺（pH=2.5），乙腈-流動相(85：15，v/v )，流速：1 mL/min；進樣量：30 μL；柱溫：25 ℃，手動進樣。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

取空白血漿0.5 mL，添加一定量的替米考星標(biāo)準(zhǔn)液和稀釋液，分別配制替米考星濃度為0.05、0.1、1、5、10、20 μg/mL，按照方法1.5進行處理并進行HPLC分析，每個濃度重復(fù) 5次。

1.7 回收率和精密度測定

將一定濃度的替米考星稀釋液加入0.5 mL空白血漿中，制得低、中、高三個梯度濃度分別為0.05、0.5、5 μg/mL，按照1.5處理并進行HPLC分析，每個濃度每日重復(fù) 5次，1周內(nèi)測定5個批次，求出日內(nèi)變異系數(shù)（RSD）和日間變異系數(shù)。

回收率 = A · 100% /AS

式中，A為添加樣品中替米考星實測峰面積；AS為對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)液中替米考星峰面積。

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用Win Nonlin 5.2 藥動學(xué)分析軟件進行數(shù)據(jù)分析，藥物動力學(xué)參數(shù)由該軟件進行非房室藥動力學(xué)模型計算。

2 結(jié)果

2.1 替米考星的線性方程、檢測限和定量限

設(shè)X為所測血藥濃度，Y為色譜峰面積值，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為： Y = 4010.4X +2064.9，相關(guān)系數(shù)R = 0.9996。替米考星的濃度在0.05~20 μg/mL范圍內(nèi)，其線性關(guān)系良好。

2.2 血漿樣品回收率及精密度

替米考星在不同水平的血漿濃度0.05、0.5、5.0 μg/mL，回收率見表1。平均回收率在92.0%~ 95.6%之間，日內(nèi)和日間變異系數(shù)小于10%。

表1 替米考星在血漿樣品中的回收率

2.3 替米考星在雞體內(nèi)的血藥濃度

烏雞內(nèi)服替米考星后，雞體內(nèi)不同時間的血藥濃度均值見表2。由表2可知，烏雞口服藥后1 h達到了血藥濃度的高峰，以后開始逐漸下降，0.10 μg/mL以上的濃度可以維持6~7 h，并在48 h后檢測不到替米考星的血藥濃度。10%的可溶性粉與標(biāo)準(zhǔn)粉之間的差異不顯著（P＞0.5）。

表2 烏雞口服單劑量替米考星（12 mg/kg）血藥濃度

2.4 替米考星在烏雞體內(nèi)藥動學(xué)參數(shù)

黑鳳烏雞口服替米考星溶液（12 mg/kg）后，血漿藥動力參數(shù)見表3。由表3可知，替米考星在烏雞體內(nèi)達到峰值的時間（Tmax）約為1.1 h，峰濃度（Cmax）約為0.35 μg / mL，藥時曲線下面積（AUC）約為 2.35 μg/mL ·h，消除半衰期（T1/2β）約為 35 h，平均滯留時間（MRT）約為9.5 h?？扇苄苑叟c標(biāo)準(zhǔn)粉的藥動力參數(shù)差異不顯著（P＞0.05）。

表3 烏雞口服單劑量替米考星（12 mg/kg）體內(nèi)的藥動學(xué)參數(shù)

3 討論

替米考星對畜禽有害微生物有良好的抑菌效果，對豬鏈球菌、副豬嗜血桿菌、巴氏桿菌和胸膜肺炎放線菌對最小抑菌濃度（MIC）為0.005~2.5 μg/mL，對豬肺炎支原體MIC為0.005 μg/mL，對雞毒支原體MIC為0.312 μg/mL[10]。研究表明，雞口服不同劑量的磷酸替米考星可溶性粉，10倍大于推薦劑量（800 μg/mL）飲水投服后未見其對雞的靶器官組織造成藥物不良影響，安全使用范圍較廣[11]。另外，替米考星對于巴氏桿菌和胸膜肺炎放線桿菌等微生物，有較長時間的抗菌后效應(yīng)，藥物濃度越大該效應(yīng)時間越長[12]。韓孝欣等研究報道，磷酸替米考星可溶性粉對雞慢性呼吸道病治愈率和保護率都達到了95%以上[13]。

黑鳳烏雞口服替米考星溶液（12 mg/kg）后，測定血漿中的藥物濃度達到峰值的時間（Tmax）約為1.1 h，AUC約為2.35 μg/mL·h，消除半衰期（T1/2β）約為35 h，說明該藥在烏雞體內(nèi)吸收迅速，分布較廣，消除緩慢。這與鄧振領(lǐng)[8]、Abu-Basha等[9]和G Shu等[14]研究報道的替米考星飼喂健康雞只后測定血漿藥動力結(jié)果是一致的。但達峰時間差異較大，藥時曲下面積、半衰期等也不完全相同，這可能是替米考星產(chǎn)品各個廠家制劑工藝不相同和試驗雞只品種及個體因素等造成的，但這些差異并不影響該藥在雞體內(nèi)有效血藥濃度的維持。

因此，該藥可以用于預(yù)防和治療烏雞支原體和巴氏桿菌等疾病，磷酸替米沙星溶液烏雞口服后，吸收迅速能達到體內(nèi)不同靶器官，按照12 mg/kg體重給藥，血漿中的Cmax可達到0.35 μg/mL，24 h血藥濃度0.08 μg/mL。根據(jù)藥動力學(xué)參數(shù)和血藥濃度變化過程等，建議烏雞可以按照12 mg/kg體重磷酸替米考星可溶性粉口服給藥，一日兩次。